不同濃度酸雨對鎘污染下桑樹幼苗生物量和生理特性的影響

徐晨陽，毛曉瑜

(浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 311300)

近年來，工業(yè)“三廢”和生活垃圾大量排放到自然界，導(dǎo)致土壤、水體及大氣中都存在重金屬及其化合物等有害物質(zhì)，且含量呈增加趨勢，這些污染物可通過食物鏈危害人類健康[1]。鎘(Cd)是毒性較強的重金屬元素，在土壤中持久度高、活性強，易被植株吸收，Cd的大量積累對植物存在毒害作用[2]，例如影響植物形態(tài)生長、光合作用、呼吸作用以及抗氧化酶活性等[3]。

從1982年國家環(huán)保相關(guān)部門建立全國酸雨監(jiān)測網(wǎng)以來，華東地區(qū)酸雨頻率一直呈增大趨勢，覆蓋面積也呈擴大態(tài)勢[4]。浙江省位于中國亞熱帶地區(qū)，該區(qū)域酸雨危害普遍嚴(yán)重，多低于pH 5.0，并形成了以杭州、金華和寧波為核心的三角形重酸雨區(qū)域[5]。酸雨污染日趨嚴(yán)重，對森林生態(tài)系統(tǒng)是個巨大的挑戰(zhàn)，酸雨不僅會影響植物光合和呼吸作用，還會抑制植物養(yǎng)分的吸收和運輸，從而危害植物整個生理代謝過程[6-7]。相對中度、弱酸性酸雨而言，重度酸雨對植物光合系統(tǒng)的抑制更為明顯[8]。另外，酸雨的沉降會對土壤生態(tài)系統(tǒng)、土壤重金屬的化學(xué)行為產(chǎn)生顯著影響[9]。酸雨會導(dǎo)致已鈍化的重金屬重新活化并被植物吸收[10]，甚至增加重金屬對植物的毒害作用[11]。

桑樹(Morusalba)除了傳統(tǒng)的栽桑養(yǎng)蠶作用外，其藥食用途、新材料用途也在不斷被發(fā)掘[12]。桑樹適應(yīng)性強、根系發(fā)達(dá)的特點使其在防沙治沙、水土保持、鹽堿地治理等方面的作用日益凸顯[13-14]。農(nóng)桑12號自育成以來，適應(yīng)性廣、成活率高、抗性強，適宜種植于長江流域和黃河中下游各種土壤類型[15]。本文探討了Cd處理、弱酸性酸雨處理、重度酸雨處理、Cd與不同濃度酸雨復(fù)合處理下，農(nóng)桑12號幼苗氣體交換和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化。擬解決以下3個問題：1)單獨Cd處理對農(nóng)桑12號光合及熒光參數(shù)的影響；2)不同濃度酸雨對農(nóng)桑12號的生理影響差異；3)Cd處理下，加入不同濃度酸雨處理，對農(nóng)桑12號Cd耐受性的影響差異。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于浙江省杭州市臨安區(qū)浙江農(nóng)林大學(xué)東湖校區(qū)果木園試驗地溫室，地理位置為119°44′E、30°16′N，屬中亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，四季分明，光照充足，具有春多雨、夏濕熱、秋氣爽、冬干冷的特征。該地區(qū)年平均氣溫16.6 ℃，其中，月均最高溫度為7月的29.1 ℃，月均最低溫度為1月的4.1 ℃；年降水日約為158 d，年降水量162 8.6 mm，年蒸發(fā)量1 450 mm，年無霜期平均237 d，年日照總時長1 825.7 h，土壤為紅黃壤[6，16-17]。

1.2 試驗材料

農(nóng)桑12號扦插條由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所提供。于春季選取大小、長短均一的健康枝條進行扦插培養(yǎng)。待生根后移栽至塑料花盆中(土壤為當(dāng)?shù)丶t黃壤，花盆直徑26 cm，高40 cm)，每盆1 株，放置在溫室大棚內(nèi)，常規(guī)管理。緩苗60 d后挑選長勢基本一致的植株，隨機分成6組，每組20株，總共120株，進行試驗。

1.3 試驗設(shè)置

試驗共設(shè)置6個處理：對照(CK)，Cd處理(100 mg·kg-1Cd)，弱酸性酸雨處理(pH 5.6，AR5.6)，重度酸雨處理(pH 3.0，AR3.0)，Cd與弱酸性酸雨復(fù)合處理(100 mg·kg-1Cd + AR5.6)，Cd與重度酸雨復(fù)合處理(100 mg·kg-1Cd + AR3.0)。

試驗初期先進行模擬Cd污染土壤處理。于2016年7月，將CdCl2·2.5H2O配制成溶液，每周2次共6次加入到土壤中，使土壤中Cd含量達(dá)到約100 mg·kg-1干土。然后進行模擬酸雨處理，配制方法根據(jù)浙江省酸性降水的平均離子組成制定，即母液由體積比為8∶1的H2SO4(濃度98%，密度1.84 g·mL-1)與HNO3(濃度68%，密度1.4 g·mL-1)配制。全淋處理前用蒸餾水稀釋為pH 5.6和pH 3.0的模擬酸雨溶液，噴灑量根據(jù)臨安區(qū)近10 a各月平均降水量折算后制定，即每周全淋處理2次，每次300 mL，對照組噴淋等量蒸餾水，直至試驗結(jié)束[6，18]。

1.4 測定方法

1.4.1 生物量測定

試驗完成后，將試驗桑樹整株取回，用蒸餾水洗凈后按器官分為根、莖、葉，于105 ℃烘箱中殺青5 min后，置于60 ℃烘干至恒質(zhì)量，分別稱量根干質(zhì)量(root weight，RW)、莖干質(zhì)量(stem weight，SW)、葉干質(zhì)量(leaf weight，LW)，并計算總干物質(zhì)積累(dry matter accumulation，DMA)。

1.4.2 氣體交換測定

每個處理組分別隨機選擇3株農(nóng)桑12號幼苗，對第4片完全展開的葉片進行氣體交換測定。儀器為便攜式光合作用測定系統(tǒng)(LI-6400XT，LI-COR，USA)。參數(shù)設(shè)置：葉面溫度25 ℃，相對濕度60%，流量500 μmol·s-1，入氣CO2濃度為大氣中CO2的濃度。選擇在晴朗上午的09：00～11：00進行測定。測定指標(biāo)包括凈光合速率(net photosynthetic rate，Pn)、蒸騰速率(transpiration rate，E)、氣孔導(dǎo)度(stomatal conductance，Gs)、胞間CO2濃度(intercellular CO2concentration，Ci)。

1.4.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定

每個處理組分別隨機選擇3株農(nóng)桑12號幼苗進行葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定。儀器為調(diào)制葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)(IMAGINGPAM，WALZ，GERMANY)，測定前葉片暗適應(yīng)20 min。測定指標(biāo)包含PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量(maximum photochemical efficiency of PSⅡ，F(xiàn)v/Fm)、PSⅡ潛在活性(potential activity of PSⅡ，F(xiàn)v/F0)、PSⅡ光合量子產(chǎn)量[effective quantum yield of PSⅡ，Y(Ⅱ)]、光化學(xué)淬滅系數(shù)(photochemical quenching，qP)、非光化學(xué)淬滅系數(shù)(non-photochemical quenching，qN)和通過PSⅡ的電子傳遞速率(electron transport rate，ETR)等。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 22軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析(ANOVA)，Cd與不同濃度酸雨處理之間的交互作用采用多因素方差分析進行處理，比較方法采用LSD檢驗(P<0.05)，使用Excel 2013繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑樹幼苗生物量

由表1可知，Cd處理顯著降低了桑樹幼苗的RW與SW，與對照相比，RW與SW分別減少了46.9%與24.1%，LW也有所降低，但不顯著。AR5.6處理下，桑樹幼苗的RW顯著降低，下降比例為31.5%；而AR3.0處理引起了RW與SW的顯著降低，下降比例為27.6%與28.6%。

在Cd污染前提下，弱酸性酸雨的加入顯著降低了桑樹幼苗RW。與Cd處理相比，Cd+AR5.6處理使得RW下降了14.0%，而重度酸雨的加入顯著降低了桑樹幼苗的RW與LW，下降比例為13.3%與26.8%。

與對照相比，各處理均引起了桑樹幼苗DMA的顯著降低，Cd處理、AR5.6處理、AR3.0處理、Cd+AR5.6處理、Cd+AR3.0處理分別降低了30.0%、9.8%、24.7%、27.1%、26.9%。結(jié)合圖1可知，各處理改變了桑樹幼苗生物量的分配，與對照相比，各處理均降低了RW分配；除AR3.0降低了植株SW分配外，其余各處理均促進了SW分配；除Cd+AR3.0處理降低了植株LW分配外，其余各處理均促進了LW分配。由此可知，各處理下桑樹幼苗DMA的顯著降低主要源于RW受到的抑制。

表1 AR5.6、AR3.0對Cd污染下農(nóng)桑12號幼苗生物量積累的影響

同列數(shù)據(jù)后無相同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

Data marked without the same lowercase letter in each column indicated significant differences atP<0.05 according to LSD test.The same as bellow.

2.2 桑樹幼苗氣體交換參數(shù)

非生物限制因素條件下，光合作用是反映植株生長和代謝狀態(tài)的重要指標(biāo)[19]，而光合特性主要通過Pn、E、Ci和Gs等來反映[20]。由圖2可知，與對照相比，Cd處理顯著降低了桑樹幼苗的各氣體交換參數(shù)數(shù)值，Pn、E、Ci和Gs分別下降了32.4%、47.5%、14.9%、48.0%。AR5.6與AR3.0處理均顯著降低了Pn、E和Gs，AR5.6處理對于以上3個指標(biāo)的影響要遠(yuǎn)小于AR3.0處理，AR5.6處理下，Pn、E和Gs分別下降了12.2%、16.9%和22.1%，而AR3.0處理下分別下降了30.1%、58.0%和48.2%。

圖1 AR5.6、AR3.0對Cd污染下農(nóng)桑12號幼苗生物量分配的影響Fig.1 Effect of AR5.6 or AR3.0 on biomass allocation of Nongsang12 exposed to Cd pollution

在Cd污染前提下，弱酸性酸雨的加入顯著緩解了Pn、E、Ci和Gs等指標(biāo)，與Cd處理相比，Cd+AR5.6處理使得Pn、E、Ci和Gs分別上升了18.7%、42.0%、17.7%和44.3%，而重度酸雨的加入對以上指標(biāo)并沒有緩解作用，甚至顯著降低了桑樹幼苗的E和Gs，Cd+AR3.0處理下的E值僅為Cd處理時的一半，Gs也僅是Cd處理時的3/4。

對Cd與不同濃度酸雨處理之間的交互作用分析可知，Cd與AR5.6交互處理對農(nóng)桑12號幼苗的Pn與Ci存在顯著影響，對Gs和E存在極顯著影響；Cd與AR3.0交互處理對農(nóng)桑12號幼苗Ci影響不顯著，對Pn、Gs、E影響極顯著。

2.3 對桑樹幼苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

作為光合作用的探針，葉綠素?zé)晒鈪?shù)反映了植物受傷害的程度[21]。由圖3可知，與對照相比，Cd處理顯著降低了桑樹幼苗的Fv/Fm、Fv/F0和ETR，分別下降了4.9%、18.7%和12.0%。AR5.6處理對桑樹幼苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)的所有指標(biāo)均無顯著影響。AR3.0處理顯著降低了桑樹幼苗的Fv/F0，與對照相比，降低了9.6%。不同濃度酸雨處理對桑樹幼苗Fv/Fm和Fv/F0的影響存在顯著差異，與AR5.6相比，AR3.0處理下桑樹幼苗的Fv/Fm和Fv/F0分別降低了3.0%和13.1%。

在Cd污染前提下，弱酸性酸雨的加入沒有加劇或緩解Cd對桑樹幼苗光系統(tǒng)Ⅱ的毒害作用。

Pn、Gs、Ci和E分別表示凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度、蒸騰速率。ns、*、**分別表示P>0.05，0.010.05，0.01

而重度酸雨的加入顯著降低了Fv/Fm和Fv/F0，與Cd處理相比，Cd+AR3.0使Fv/Fm和Fv/F0分別降低了6.9%和19.2%。

對Cd與不同濃度酸雨處理之間的交互作用分析可知，僅Cd與AR3.0的交互作用對Fv/Fm存在顯著影響。

3 討論

植物在受到重金屬脅迫時，會表現(xiàn)出根部生長受限的現(xiàn)象[22-23]，而不同濃度酸雨的全淋處理會引起植物生物量分配的差異[18]。本試驗中，生物量積累的降低說明各處理均抑制了農(nóng)桑12號幼苗的生長，但不同處理間存在生物量分配差異，說明各脅迫條件對植株根系與地上部分的生長有不同影響。弱酸性酸雨處理抑制了植株地下部分生長，促進了地上部分生長，這可能是酸雨中的氮素為植物地上部分合成蛋白質(zhì)提供了充足的氮源，光合產(chǎn)物更多地分配在莖葉，從而降低了地下部分生物量的積累。重度酸雨處理對地上地下部分生長均存在抑制，這可能是因為重度酸雨直接作用于葉片后破壞了葉片膜結(jié)構(gòu)，降低了葉綠素含量與葉片酶活性[18]，引起植株光合能力下降，從而導(dǎo)致了植株整體生長受到抑制。Cd處理對根部生物量的抑制作用強于其他器官，這是由于模擬Cd污染土壤處理首先影響的就是植株根系，弱酸性酸雨的加入降低了根部生物量所占的比例，這可能是弱酸性酸雨緩解了Cd對植株地上部分的毒害，而重度酸雨的加入加劇了植株葉片受到的傷害，這可能是Cd與重度酸雨的復(fù)合作用，也可能是重度酸雨的加入增大了Cd在根莖葉之間的轉(zhuǎn)運量[24-25]，這還需要對各器官Cd元素的積累進行研究。

圖3 AR5.6、AR3.0對Cd污染下農(nóng)桑12號幼苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響Fig.3 Effect of AR5.6 or AR3.0 on chlorophy Ⅱ fluorescence parameters of Nongsang12 exposed to Cd pollution

重金屬脅迫除了會抑制植物卡爾文循環(huán)酶活性，從而直接影響植物的光合功能以外[26]，也會導(dǎo)致葉片氣孔關(guān)閉而間接影響光合作用[27]，Ci值的變化與否是判斷植株光合作用是否為氣孔限制的依據(jù)[28]。在本試驗中，農(nóng)桑12號幼苗在Cd處理與Cd+AR3.0處理下，都表現(xiàn)為Pn、E、Gs、Ci的顯著降低，可以推斷，氣孔因素是抑制這2種處理下植株光合作用的原因之一，即Gs降低，導(dǎo)致了光合作用所需CO2供應(yīng)不足從而抑制了Pn。而AR5.6、AR3.0與Cd+AR5.6處理下，Ci值并沒有顯著降低，說明這3種處理下Pn的降低不是由于CO2的缺乏導(dǎo)致的，但Ci也沒有顯著升高，說明CO2沒有在葉肉細(xì)胞間大量積累，所以也不能推斷是非氣孔因素令CO2的利用受阻導(dǎo)致Pn的降低，這可能是酸雨影響了葉肉細(xì)胞的酶活性或是導(dǎo)致了細(xì)胞的膜脂過氧化等[14]，這還需要進一步的研究。

E受到氣孔開閉的影響，氣孔開放時E增大，氣孔關(guān)閉時E減小[29]。本試驗中，與對照相比，各處理下E與Pn均同步下降，同時，Gs與E也同步下降，說明可能是氣孔保衛(wèi)細(xì)胞失水，即水分因子導(dǎo)致的農(nóng)桑12號幼苗Gs的降低，也可能是各處理導(dǎo)致葉片脫落酸水平增加而導(dǎo)致氣孔關(guān)閉[30]。

由氣體交換參數(shù)可知，單獨的AR處理下，隨AR濃度的增大，對光合系統(tǒng)的抑制作用增大，其他關(guān)于不同濃度酸雨的研究也支持以上結(jié)果[6，18]。Cd處理抑制了農(nóng)桑12號幼苗葉片的碳同化能力，弱酸性酸雨溶液的加入，緩解了Cd的毒害作用，這可能由于酸雨中含有的N、S對葉片生長有促進作用，對植株起到了補充N源的效果；而重度酸雨溶液的加入，進一步降低了植株的光合作用水平，這可能是Cd與AR3.0的交互作用，也可能是重度酸雨溶液降低了植株的Cd耐受性。

作為PSⅡ的最大光化學(xué)量子產(chǎn)量，F(xiàn)v/Fm能反映PSⅡ反應(yīng)中心的光能轉(zhuǎn)化效率，F(xiàn)v/F0能反映PSⅡ捕獲激發(fā)能的效率[31]。本試驗中，Cd處理下桑樹幼苗的Fv/Fm和Fv/F0均顯著降低，說明Cd污染對PSⅡ的遠(yuǎn)處光化學(xué)效率和從天線色素到PSⅡ反應(yīng)中心的傳能效率都造成了影響，并出現(xiàn)了光抑制現(xiàn)象[32]；同時，Cd處理對Fv/F0造成的影響程度高于Fv/Fm，從而可以推斷Cd處理對桑樹幼苗傳能效率的抑制比對其光能轉(zhuǎn)化效率的抑制更為明顯。與此同時，與AR5.6相比，AR3.0處理顯著降低了Fv/Fm和Fv/F0，說明AR3.0對植株光合電子傳遞和傳能效率的抑制均顯著高于AR5.6。另外，與AR5.6相比，AR3.0處理下，F(xiàn)v/F0的下降程度大于Fv/Fm，說明酸雨濃度的增大對植株造成的破壞更多地體現(xiàn)在對傳能效率的抑制方面。

qP代表PSⅡ反應(yīng)中心的開放程度，qN代表植物熱耗散的程度，Y(Ⅱ)反映的是PSⅡ光合量子產(chǎn)量，ETR反映了電子傳遞速率[33-35]。本試驗中，與對照相比，各處理下qP均無顯著變化，說明Cd與不同濃度酸雨處理均沒有降低PSⅡ原初電子受體重新氧化的能力，氧化狀態(tài)仍處于正常水平，但Cd、Cd+AR5.6、Cd+AR3.0處理下ETR均顯著降低，說明由于PSⅡ電子傳遞速率的降低導(dǎo)致了原初電子受體不能高效率地向后傳遞，電子傳遞過程受阻，最后導(dǎo)致了Y(Ⅱ)的降低。Cd、Cd+AR5.6、Cd+AR3.0處理中，qN均有不同程度的升高，說明PSⅡ吸收的光能已經(jīng)過剩，而植株只能以較高的熱耗散方式來保護光合系統(tǒng)。處理間對比而言，AR3.0處理與AR5.6處理相比，只是對電子傳遞速率造成了少許抑制，并不存在顯著差別；另外，復(fù)合處理下，與Cd處理相比，AR5.6的加入并沒有像緩解植株氣體交換速率那樣緩解植株電子傳遞速率受抑制的程度，而AR3.0的加入顯著阻礙了電子傳遞過程，從而導(dǎo)致Y(Ⅱ)的進一步降低，且qN較Cd處理時有所上升，說明AR3.0的加入增大了PSⅡ的受損程度，植株只能加強熱耗散以耗散過剩光能。

本研究通過模擬不同濃度的酸雨溶液，研究了Cd污染前提下，不同濃度酸雨對農(nóng)桑12號幼苗生物量積累、氣體交換、葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響，發(fā)現(xiàn)Cd污染抑制了農(nóng)桑12號幼苗的生長，改變了植株生物量分配比例，對植株光合作用有顯著的抑制，植株光系統(tǒng)Ⅱ也受到了破壞；同為全淋處理模式下，重度酸雨處理增大了根冠比，而弱酸性酸雨處理降低了根冠比，且重度酸雨對植株光系統(tǒng)Ⅱ的破壞顯著高于弱酸性酸雨處理；弱酸性酸雨溶液的加入一定程度上恢復(fù)了受Cd脅迫的農(nóng)桑12號幼苗的氣體交換速率以及葉綠素?zé)晒鈪?shù)，而重度酸雨溶液加劇了Cd對植株光合系統(tǒng)的破壞。