甜瓜枯萎病菌ELISA檢測方法的初步建立

延 涵，楊瑞秀，蓋曉彤，李 剛，趙治國，高增貴，*

(1.內(nèi)蒙古出入境檢驗檢疫局 檢驗檢疫技術(shù)中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020; 2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物免疫所，遼寧 沈陽 110866)

甜瓜枯萎病是由尖孢鐮孢菌甜瓜專化型(Fusariumoxysporumf.sp.melonis)侵染引起的，防治難度較高。甜瓜植株一旦患病，常引起瓜秧整株枯萎死亡，造成不可逆轉(zhuǎn)的損失[1]。目前，甜瓜枯萎病的檢測主要依靠傳統(tǒng)方法和分子檢測方法，單靠傳統(tǒng)方法通過分離培養(yǎng)、生物學(xué)測定等常規(guī)技術(shù)進行檢測診斷，不僅難度較大，而且效率低、速度慢[2]。分子生物學(xué)方法成本較高，且須配備相應(yīng)的檢測設(shè)備，限制了其在實際生產(chǎn)生活中的應(yīng)用。ELISA檢測技術(shù)建立在抗原和抗體免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)上，測定中可使用的抗原種類多樣，只要可以附著在固相載體上即可[3]，該方法適用于類菌質(zhì)體、植物病原細菌以及植物病原真菌的檢測。病原真菌無需分離、活化便可進行檢測，田間檢測非常便捷。ELISA檢測方法通過測定病原蛋白的含量來研究寄主-病原物互作關(guān)系。近年來，許多學(xué)者對植物病害的ELISA檢測方法進行了研究，如張亮[4]建立了棉花黃萎病菌雙抗夾心ELISA法檢測技術(shù)，孫艷秋等[5]制備了黃瓜細菌性白枯病菌的特異性抗體并建立了其ELISA檢測方法。目前，國內(nèi)有關(guān)甜瓜枯萎病菌的血清學(xué)檢測方法尚無報道，建立快速、簡便的甜瓜枯萎病菌血清學(xué)檢測方法可為田間快速診斷該病害提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試病原菌

甜瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.melonis)、黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.niveum)和苦瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf .sp.momdicae)均由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物免疫所分離保存。

1.1.2 實驗動物

雄性新西蘭大白兔3只，體質(zhì)量約2 kg(沈陽藥科大學(xué)實驗動物中心)。

1.1.3 試劑

抗體(自制)；堿性磷酸酶標記羊抗兔Ig-G (Sigma)；牛血清蛋白(BSA)(Solarbio)；弗氏不完全佐劑(FICA)(Sigma)；弗氏完全佐劑(FCA)(Sigma)；磷酸緩沖液(PBS)、包被液、洗板液、顯色液、終止液，均為國產(chǎn)分析純試劑，按照陳新建[6]方法自配。

1.1.4 儀器

全波長酶標儀(Thermo)；紫外可見分光光度計(尤尼柯儀器有限公司)；通用數(shù)字加熱磁力攪拌器(北京鼎昊源科技有限公司)；培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；高速冷凍離心機(HITACHI)。

1.2 方法

1.2.1 菌絲體胞內(nèi)蛋白提取及其濃度測定

將甜瓜枯萎病菌菌體置于PDA培養(yǎng)液，25 ℃連續(xù)培養(yǎng)7 d，用紗布將菌絲過濾，無菌水沖洗3次，在冷凍干燥機中干燥48 h去除水分。在干燥后的菌絲中加入一定量的PBS提取液(質(zhì)量體積比2∶1)，液氮中充分研磨；4 ℃、8 000 r·min-1離心20 min，再4 ℃、15 000 r·min-1離心1 h，取上清液即得菌絲蛋白。

用考馬斯亮藍G-250測定提取的菌絲蛋白在595 nm的吸光值。制作牛血清蛋白系列濃度標準曲線，根據(jù)標準曲線得出甜瓜枯萎病菌菌絲蛋白的濃度，用提取液稀釋，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 免疫方案

選取體質(zhì)量為2 kg左右的雄性新西蘭大白兔3只進行免疫注射。首次免疫劑量為0.5 mL菌絲蛋白提取液與等體積的弗氏完全佐劑，在無菌注射器內(nèi)充分混勻，采取腿部肌肉注射的方法免疫注射3只兔子；15 d后進行第2次免疫注射，此次免疫劑量為0.5 mL菌絲蛋白提取液與等體積的弗氏不完全佐劑，之后均使用該劑量，共免疫注射5次。第5次免疫注射10 d后，殺兔取血。免疫注射前后均在兔耳緣靜脈取血5 mL，以備檢測使用。

1.2.3 抗血清的提取

將提取的兔血清在25 ℃靜止5 h，4 ℃過夜。4 ℃、5 000 r·min-1離心30 min，再4 ℃、10 000 r·min-1離心10 min，取上清液即為抗血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 抗血清的純化

采用飽和硫酸銨分級沉淀法[6]進行抗體純化。

1.2.5 抗血清的選擇

采用間接ELISA方法測定3只兔子抗血清的吸光度(D405)，選擇效果好的血清用于后續(xù)實驗。

1.2.6 抗體效價測定

將純化后的抗血清在冰上解凍后，用PBS倍比稀釋，從1∶100稀釋至1∶26 500。按間接ELISA方法測定抗體的效價。以陰性血清(即免疫前的血清)為對照，測定D405。計算P/N值，P/N>2.1為陽性，P/N<2.1為陰性。

1.2.7 酶標記抗體的工作濃度確定

用PBS將酶標記抗體分別稀釋為1∶250、1∶500、1∶1 000、1∶2 000和1∶5 000，用間接ELISA法篩選出最佳的稀釋倍數(shù)。

1.2.8 抗原、多克隆抗體最佳工作濃度的確定

將抗原用PBS從1∶100倍比稀釋到1∶8 000，將多克隆抗體用PBS從1∶500倍比稀釋至1∶8 000。采用方陣滴定法和間接ELISA法測定D405值。

1.2.9 抗體特異性的測定

分別用PBS提取甜瓜枯萎病菌、黃瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌和苦瓜枯萎病菌的菌絲蛋白，用間接ELISA法測定，檢測抗體的特異性。

1.2.10 抗體靈敏度測定

用PBS緩沖液稀釋甜瓜枯萎病菌菌液為0.2、0.1、0.05、0.025、0.01、0.005、0.001 μg·mL-1，用間接ELISA法測定D405，繪制標準曲線，對靈敏度進行測定。

1.2.11 田間病樣ELISA檢測

采集感病的甜瓜植株標樣，截取發(fā)病部位的根莖，放入研缽中，加入PBS提取液(質(zhì)量體積比1∶2)，充分研磨，靜置30 min。將其轉(zhuǎn)移到離心管中，充分混勻，4 ℃、8 000 r·min-1離心15 min，取上清液備用。采用間接ELISA法對上清液進行測定，以未發(fā)病的植株提取液作為對照。

1.2.12 土壤中甜瓜枯萎病菌ELISA檢測

土壤源于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗基地甜瓜種植大棚和非甜瓜種植田地。

分別取種植1 a甜瓜、連作5 a甜瓜以及非甜瓜種植區(qū)的土壤，將土壤表層土去掉，采集距離甜瓜植株10～20 cm的土壤約1 kg。去除土壤中的石塊、根莖以及其他雜質(zhì)，將土壤風(fēng)干后過2 mm篩，并用研磨機打磨。將非甜瓜種植區(qū)的土壤于101 kPa、120 ℃滅菌2 h，其他土壤樣品不做滅菌處理。分別稱取滅菌土壤和連作甜瓜土壤1.00 g于離心管中，加入PBS提取液振蕩混勻，靜置24 h，25 ℃、8 000 r·min-1離心30 min，取上清液。將上清液過0.22 nm微孔濾膜，以除去細菌；再次離心，取上清液用作檢測。采用間接ELISA法進行測定，滅菌土壤上清液作為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗血清選擇結(jié)果

用間接ELISA法測定3只兔子所提取的抗血清的反應(yīng)情況，二抗(堿性磷酸酶標記羊抗兔IgG)稀釋濃度為商品說明書推薦的濃度1∶5 000。選取吸光度較高、反應(yīng)情況好的抗血清為后續(xù)實驗所用血清。實驗結(jié)果表明，2號兔子吸光度均值最高，達0.524，可用作后續(xù)實驗。

2.2 抗體效價

對抗體進行倍比稀釋，間接ELISA法測定效價。結(jié)果表明，稀釋倍數(shù)為1∶25 600時，P/N>2.1，呈陽性；當(dāng)稀釋倍數(shù)為1∶51 200時，P/N<2.1，呈陰性。因此，抗體的效價為1∶25 600(表1)。

2.3 抗原、抗體最適工作濃度

間接ELISA實驗中，抗體的工作濃度是影響實驗結(jié)果的重要因素，抗體工作濃度直接影響抗原對其的反應(yīng)靈敏度。本實驗采用方陣滴定法確定抗原和抗體的最佳工作濃度。實驗結(jié)果表明，抗體稀釋倍數(shù)為1∶1 000時，D405值(1.005)最接近1，為抗體最佳工作濃度(表2)。

2.4 酶標記抗體最佳工作濃度選擇

表1 抗體效價

+，陽性；-，陰性。下同。

+，positive; -，negative.The same as bellow.

商品化酶標記羊抗兔IgG說明書推薦稀釋比例為1∶5 000。在抗原、抗體最佳工作濃度確定的基礎(chǔ)上，對酶標記抗體的稀釋比例進行優(yōu)化。使用間接ELISA法測定D405。實驗結(jié)果表明，稀釋倍數(shù)為1∶250、1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶5 000時，D405分別為1.262、1.017、0.721、0.593、0.399，表明稀釋倍數(shù)越小，反應(yīng)結(jié)果越好，稀釋比例為1∶250時D405最大。綜合考慮經(jīng)濟和實驗效果，本實驗采用1∶1 000的稀釋比例作為酶標記抗體的工作濃度。

2.5 抗體特異性

由表3可知，本研究制備的多克隆抗體僅與甜瓜枯萎病菌的蛋白呈陽性反應(yīng)，與黃瓜枯萎病菌、苦瓜枯萎病菌和西瓜枯萎病菌蛋白均呈陰性反應(yīng)(表3、圖1)。表明本實驗制備的多克隆抗體對甜瓜枯萎病菌有特異性，可用于甜瓜枯萎病的特異性檢測。

2.6 抗體靈敏度

間接ELISA測定的靈敏度結(jié)果如圖2。菌體抗原稀釋到0.005 0 μg·mL-1時，P/N>2.1；菌體抗原稀釋到0.002 5、0.001 0 μg·mL-1時，P/N<2.1。因此，間接ELISA檢測的靈敏度為0.005 0 μg·mL-1。

2.7 田間病樣檢測

采用間接ELISA法測定罹病甜瓜植株樣品，結(jié)果表明：2份患病甜瓜樣品的P/N值均大于2.1，呈陽性反應(yīng)；而健康植株樣品的P/N值小于2.1，呈陰性反應(yīng)(表4)。

2.8 土壤中甜瓜枯萎病菌檢測結(jié)果

采用間接ELISA法，以標準尖孢鐮孢菌胞內(nèi)蛋白濃度的對數(shù)為橫坐標，D405為縱坐標，繪制標準曲線(圖3)，回歸方程為y=0.0555x+0.0312，相關(guān)系數(shù)r=0.960 9，可見抗原蛋白質(zhì)濃度與其D405顯著相關(guān)。表明所建立的ELISA方法可行，據(jù)此可進行土壤提取液樣品中抗原蛋白的定量測定。

表2 抗原和抗體工作濃度優(yōu)化

表3 抗體的特異性

1～7依次為甜瓜枯萎病菌、黃瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、苦瓜枯萎病菌、陰性對照、陰性對照、空白對照。1-7 represented Fusarium oxysporum f.sp.melonis，F(xiàn)usarium oxysporum f.sp.Cucumerinum，F(xiàn)usarium oxysporum f.sp.niveum，F(xiàn)usarium oxysporum f .sp.momdicae，negative CK，negative CK，blank，respectively.圖1 抗體特異性Fig.1 Specificity of antibody

圖2 抗體靈敏度Fig.2 Sensitivity of the antibody

表4 田間病樣檢測結(jié)果

將3份土壤提取液進行間接ELISA測定，未滅菌的種植1 a甜瓜的土壤和連作5 a甜瓜的土壤樣品提取液測定結(jié)果呈陽性，而滅菌后的土壤樣品的測定結(jié)果為陰性(表5)。根據(jù)標準曲線計算，種植1 a甜瓜的土壤樣品提取液中蛋白濃度為2.28 μg·mL-1，連作5 a甜瓜的土壤樣品提取液中蛋白濃度為4.43 μg·mL-1。

圖3 尖孢鐮孢菌胞內(nèi)蛋白標準曲線Fig.3 Standard curve of mycelia protein from Fusarium oxysporum

表5 土壤樣品測定結(jié)果

3 討論

近年來，ELISA法日益廣泛地用于植物病害的免疫學(xué)診斷，特別是植物病害細菌和真菌的檢測。該方法不僅具有很強的靈敏性，經(jīng)過優(yōu)化后的ELISA反應(yīng)還可以制成商品化的試劑盒，達到了快速、靈敏、便捷的檢測效果。實驗中使用甜瓜枯萎病菌的胞內(nèi)蛋白制備了多克隆抗體，該抗體有較強的特異性和較高的靈敏度。一般來講，不存在絕對專一的抗體，全血清中會含有一些非特異性的抗體蛋白，如白蛋白、α1和α2球蛋白等，如不進行抗體的純化會對包被有所影響，同時也會影響抗體的靈敏度，可以采用柱層析方法提高抗體的純度、制備相應(yīng)的單克隆抗體和吸附法等。影響ELISA實驗的因素諸多，如實驗溫度、包被條件、包被時間、抗原抗體反應(yīng)條件、固相載體等，實驗過程中試劑、加樣、反應(yīng)時間的控制也是影響實驗結(jié)果的重要因素，進一步探究這些因素對實驗的影響，可以獲得更為準確的實驗結(jié)果[7]。本實驗對采集的病樣和甜瓜種植土壤中的帶菌情況進行了定性和定量測定，結(jié)果表明，建立的ELISA檢測方法具有良好的特異性和靈敏度，在實際生產(chǎn)中，可以用于甜瓜枯萎病的快速檢測。