解讀DNA鑒定

楊勁樹

DNA 雙螺旋結構與堿基配對圖

DNA鑒定又稱DNA分析，是隨DNA雙螺旋結構的發(fā)現(xiàn)及DNA測序技術的出現(xiàn)而發(fā)展起來的一門分析型技術學科，也是分子生物學技術最為常見的應用之一。

DNA雙螺旋結構的發(fā)現(xiàn)

1962年，瑞典皇家科學院將諾貝爾化學獎授予吉姆·沃森、弗朗西斯·克里克和莫里斯·威爾金斯，以表彰他們在1953年前后發(fā)現(xiàn)并解析了DNA雙螺旋結構。他們的發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)立了分子生物學這一生命科學領域重要的分支學科，也讓科學家們能夠對生命的遺傳物質DNA一窺究竟。而在這一無比優(yōu)美的螺旋結構背后，是對DNA序列配對的嚴密量化計算。

DNA是由核苷酸（糖、磷酸和堿基）組成的長鏈分子，兩條鏈以反平行方式形成右手螺旋結構。DNA結構中最重要的遺傳信息存儲載體是四種堿基——兩種嘌呤（腺嘌呤A和鳥嘌呤G）以及兩種嘧啶（胞嘧啶C和胸腺嘧啶T）。堿基位于雙螺旋內部，其中A和T、G和C之間形成稱為氫鍵的作用力，讓雙螺旋結構得以穩(wěn)定。由于兩條鏈是相互配對的，理論上來說，我們只要有方法測定其中一條鏈的堿基序列，另一條互補鏈的信息便很容易獲得。

簡而言之，DNA雙螺旋結構告訴我們，DNA結構是穩(wěn)定的，而其中的遺傳信息包含在堿基當中。

DNA測序技術的發(fā)明

1975年，英國生物化學家弗雷德里克·桑格發(fā)明了鏈終止法。作為DNA序列測定的金標準，鏈終止法（第一代DNA測序技術）憑借測序準確和讀取DNA序列較長等優(yōu)點，至今仍被廣泛使用。

1990年，以美國科學家為主導，英國、法國、德國、日本和中國共同參與的人類基因組計劃啟動，目標就是利用鏈終止法測定人類基因組的全部序列。測定結果表明，人類全基因組由30億個堿基對組成，其中含有2.5萬個基因。2006年，人類基因組這一天書被人們完全破譯，歷時16年，耗資30億美元。對于這本天書的解讀工作一直持續(xù)至今（稱為“后基因組時代”）。

第一代測序方法雖然相較之前的方法有了很大進步，但也存在著缺點，其最主要的就是成本高、通量低。2005年前后，出現(xiàn)了以羅氏公司454法和Illumina公司Solexa/HiSeq技術為代表的第二代DNA測序技術。不同于第一代測序的“合成后測序”，這些新技術采用“邊合成邊測序”的方法。其基本原理是將DNA分子打碎成小片段，在附著基質（玻片或者磁珠）上進行擴增和測序，通過檢測每次合成釋放出來的焦磷酸來獲得相應的序列。玻片和磁珠可以同時容納大量分子，通量巨大，也大大降低了測序成本。然而，第二代測序最大的缺點在于讀長比較短，這給后續(xù)的序列分析造成了巨大困難。

2009年開始，以PacBio公司SMRT技術和Oxford Nanopore Technologies公司納米孔單分子測序技術為代表的第三代DNA測序技術開始被應用，其最大特點就是單分子測序，無需進行擴增，本質上是檢測DNA分子通過單分子納米孔而造成光電信號變化的物理方法。由于第三代測序錯誤率比較高、應用有限，一般只用于一代、二代測序結果的驗證。

DNA分析技術的應用

序列分析的基礎是文本處理，即字母表中只有四個字母（ATCG）的文字分析。一般來說，用來測序的DNA分子體現(xiàn)出來的遺傳信息是一條（或者一對）完整連續(xù)的堿基序列，而從測序儀上獲得的卻只有部分DNA片段序列，如第一代測序每個片段約1000個堿基，第二代測序約200個堿基。因此，如何把這些短片段拼接成完整的序列，便成了分子生物學家最亟待解決的問題。

序列拼接的基本原理，是利用兩個片段之間的重疊部分來進行的。理論上，重疊部分越多的序列越容易拼接，而且部分序列越長，重疊部分越多。但是重疊序列會造成序列的重復讀取，一般第一代測序可接受的測序深度（實際讀取的序列長度與待測序列的真實長度之間的比值）是10倍，而第二代測序要達到幾十倍甚至上百倍才能獲得理想效果。

獲得了DNA序列，接下來就得進行序列的比較了。在比較之前，首先要排除污染的可能性，因為PCR反應極其敏感，稍有不慎就會造成非目的序列的擴增。一旦我們獲得了真實所需的DNA序列，接下來就要進行具體分析。

物種及個體鑒定

DNA 測序技術的發(fā)展歷程

早在達爾文發(fā)表進化論之前，人們就已經對自然界存在的生物進行了系統(tǒng)分類，最出名也是最常用的是瑞典植物分類學家林奈發(fā)明的雙名法，即將生物從高到低劃分為界、門、綱、目、科、屬、種七個分類單元，用“屬名”+“種名”的拉丁文表示某一具體的物種，這一命名法一直沿用至今。在DNA鑒定技術出現(xiàn)之前，分類學家主要依靠形態(tài)學特征來對物種進行歸類，但此法存在著效率低下、分類混亂和主觀性強的缺點。DNA鑒定技術成熟后，我們通過對未知物種基因片段的擴增和測定，就可以根據(jù)與已知物種相同基因序列的相似程度進行歸類，大大提高了分類效率，在不破壞原本分類框架的基礎上解決了很多疑難問題。DNA鑒定技術與分類學的結合直接促成了一門新學科——分子進化生物學——的誕生，它的終極目標是建立完整的所有物種（包括現(xiàn)存和已滅絕）的“生命之樹”，將達爾文進化論不斷向前推進。

另一方面，DNA鑒定也可以應用于個體鑒定。對同一物種的不同個體來說，一般基因序列的相似性會高達99.99%，這0.01%的差異往往存在于一些非編碼基因或者短的重復序列（微衛(wèi)星序列）。我們可以擴增出這一部分的區(qū)域并測定其序列，用于區(qū)分不同的個體。最常見的應用是刑偵學上的身份鑒定和未知親屬關系的親子鑒定。通過對比從犯罪現(xiàn)場獲得的血液、毛發(fā)等樣品以及疑犯或受害人遺留的組織樣品中獲得的微衛(wèi)星區(qū)域序列，我們可以確定樣品是否來自同一個人，為刑事案件的破解提供重要線索。此外，由于子女的基因組DNA各有一半分別來源于親生父母一方，利用這一點也可以進行親子鑒定。

目前主要從事個性化基因分析的公司

遺傳性疾病診斷

基因體現(xiàn)性狀，性狀由基因決定。從某種意義上來說，任何疾病的發(fā)生和發(fā)展都與基因相關，如孟德爾遺傳?。▎位蛲蛔兙涂梢园l(fā)病的一類遺傳性疾病）。第一個被解析出的孟德爾遺傳病是鐮形貧血癥，由于編碼血紅蛋白基因的單個堿基位點發(fā)生突變，造成合成的血紅蛋白發(fā)生功能異常，攜氧能力大大下降，導致機體缺氧性貧血，嚴重時可能危及患者生命。

截至2018年10月26日，“在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫”（OMIM）中一共收錄了相關遺傳病基因描述15983條。其中已知性狀分子基礎的有5348個，更多的基因以及與遺傳病的關聯(lián)數(shù)據(jù)還在不斷更新中。但通過對致病基因區(qū)域的DNA擴增和序列測定，我們就可以鑒定患者是否可能患有某種遺傳疾病，甚至通過分析序列信號是單一還是兩種混雜，并確定患者攜帶的致病基因是顯性還是隱性。此外，癌癥的發(fā)生與基因組上的突變密切相關，但實際情況要復雜得多。一種癌癥可能涉及到許多基因的突變，而一個基因的突變又可能與幾種癌癥相關。2006年，美國國家癌癥研究院（NCI）和國家人類基因組研究院（NHGRI）共同啟動了“癌癥基因組圖譜”（TCGA） 計劃。目前，TCGA數(shù)據(jù)庫中已經存儲了20多種癌癥的基因組數(shù)據(jù)，大大方便了通過DNA鑒定實現(xiàn)癌癥在基因組層面上的相關性研究。例如，因檢測發(fā)現(xiàn)攜帶致癌基因，好萊塢著名電影明星安吉麗娜·朱莉進行了預防性雙乳腺切除手術。最近的一項技術甚至可以通過擴增和分析血液中提取DNA的相關基因序列，將癌癥診斷的確診期大大提前。

個性化基因分析

2006年，一家進行個性化基因分析的公司23andMe在美國硅谷成立。用戶只需寄去唾液樣本并付99美元，便可獲得一份在線DNA報告，顯示祖先起源。目前，23andMe的業(yè)務范圍經由美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準，已擴展至包括遺傳導致的帕金森病、阿爾茨海默病等在內的10種疾病預測，大批用戶根據(jù)檢測結果調整了自己的生活方式?？梢哉f，23andMe是將DNA鑒定應用于個性化基因分析上的成功范例。目前，我國的類似公司有WeGene和23魔方等，客戶只需提供2毫升唾液樣品和一些基本費用，便可以完成祖源、遺傳風險、營養(yǎng)需求、藥物反應、皮膚特質等在內的相關DNA鑒定，其中WeGene更提供了不到4000元的全基因組測序服務。然而，盡管個性化基因分析發(fā)展迅速，但它仍處于初級階段，極大地依賴于科學家對人類基因組的解讀和具體遺傳病例的研究結果，檢測結果更多體現(xiàn)的是個體與這些已有成果的相關性而非診斷性，因此宣傳性意義大于實用性價值。

生命之樹

世界上最小的測序儀MinION

DNA技術的展望

物種DNA標簽庫的建立

分類學家多年來心存一個夢想，就是將所有物種（包括現(xiàn)存和已滅絕）的分類關系整理完畢，形成一棵完整的“生命之樹”，給生命進化理論劃上一個完美的句號。對早期的形態(tài)學分類學家來說，實現(xiàn)這一終極目標簡直是幻想，而DNA物種鑒定技術的出現(xiàn)為這一目標的實現(xiàn)提供了可能性。

由于基因組測定相對復雜得多，一般DNA物種鑒定只分析某些基因序列，最常用的是稱為“生命條形碼”的線粒體基因COI。目前，絕大部分物種在GenBank中都具有COI條形碼的記錄，大大方便了DNA物種鑒定需求。然而，COI條形碼分析也存在缺點，最主要是其進化速率不能滿足更低分類單元分析的需求，比如確定亞種和種群，這時候往往需要通過多基因共同分析?？紤]到目前的測序技術和高昂成本，這一工程短期內還無法實現(xiàn)。

疾病基因庫的完善

隨著后基因組時代科學家對人類基因組解讀的不斷深入，以及對各種病例表型和基因型對應分析的不斷清晰，包括OMIM和TCGA在內的基因（組）數(shù)據(jù)庫收錄的數(shù)據(jù)也在持續(xù)更新。目前，人們對于疾病與基因關系的理解是碎片化的：一方面，由于缺乏患者全基因組數(shù)據(jù)，能夠檢測到某種病癥與某個基因的變化可能是不完全的;另一方面，人們總希望一種疾病對應一個基因，然而疾病的發(fā)生是許多基因共同起作用的結果。人們可能碰巧找到了其中一個關鍵基因，對它的操作恰好可以達到預期的治療效果。但這種情況并非常態(tài)，對于絕大多數(shù)疾病來說，基因調控是一個錯綜復雜的網絡系統(tǒng)，依據(jù)目前的認知根本無法徹底闡明，更談不上從基因層面達到治愈的效果。

相信隨著科學研究的不斷深入和相關疾病基因庫的不斷完善，我們最終可以清晰地了解自身。