BRAF在10-姜酚抗黑色素瘤中作用的分子模擬及實驗研究*

張競之， 鄧 波， 江小梨， 張雙偉， 蔡 敏， 劉 彬

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 1中醫(yī)科, 2心血管疾病研究所， 廣東 廣州 510260； 3香港浸會大學(xué)深圳研究院， 廣東 深圳 518057)

黑色素瘤是最常見的皮膚腫瘤，其發(fā)病率和致死率不斷升高，由于黑色素瘤的高轉(zhuǎn)移性及高耐藥性，被認為是致死率最高的腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計，在發(fā)達國家黑色素瘤是男性最常見的3種腫瘤之一，占總腫瘤病例的8%[1]。我國黑色素瘤發(fā)病率較低，然而近年來由于飲食結(jié)構(gòu)變化及臭氧層破壞諸多因素的影響，我國黑色素瘤發(fā)病率發(fā)展迅速，據(jù)統(tǒng)計2000年我國黑色素瘤發(fā)病率為0.2/10萬，到2005～2007年其發(fā)病率達1/10萬[2-3]。目前針對黑色素瘤治療的藥物效果有限，探索新型有效的抗黑色素瘤藥物的研發(fā)具有重要意義。

生姜是姜科植物姜的根莖，具有解表散寒、溫中止嘔和化痰止咳等功效。姜酚是生姜的主要活性成分，包括6-姜酚(6-gingerol，6-G)、8-姜酚(8-gingerol，8-G)和10-姜酚(10-gingerol，10-G)[4]。研究表明姜酚類活性成分具有抗氧化、止嘔、抗腫瘤、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等作用[5]。姜酚類成分的抗腫瘤作用及其機制一直受到重視[4]。既往研究發(fā)現(xiàn)6-G和8-G均可顯著的抑制黑色素瘤細胞的增殖[6-7]，然而尚未見10-G對于黑色素瘤作用的報道。研究發(fā)現(xiàn)10-G具有比6-G和8-G更好的抗腫瘤活性，例如10-G 比6-G能更加顯著地抑制白血病細胞的增殖，并且其誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡的效果比6-G和8-G更加明顯[8]。這些提示10-G的抗黑色素瘤作用及機制具有一定研究價值。

BRAF是調(diào)控細胞增殖的關(guān)鍵蛋白[9]。研究發(fā)現(xiàn)大約50%的黑色素瘤患者出現(xiàn)了BRAF基因突變，其中超過90%為第600位谷氨酸代替纈氨酸的V600E型單核苷酸突變[10]。發(fā)生V600E突變后BRAF持續(xù)激活，通過不同的機制促進黑素瘤的發(fā)生和發(fā)展[11]。本研究將采用分子對接和分子動力學(xué)模擬技術(shù)以及細胞實驗研究BRAF蛋白在10-G抗黑色素瘤效果中的作用。

材 料 和 方 法

1 主要材料

10-姜酚中藥對照品購自成都曼思特生物科技有限公司(MUST-17033004；批號：23513-15-7；純度>99.04%)。DMEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶購自Gibco；胎牛血清購自BI；MTS細胞活力檢測試劑盒購自Promega；BCA蛋白定量試劑盒和ECL顯影劑購自美國Thermo；抗p-BRAF (Ser445)、BRAF、p-MEK1/2(Ser217/221)、p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)、p-P38(Thr180/Tyr182)和GAPDH抗體購自CST。

2 細胞培養(yǎng)

人皮膚黑色素瘤細胞株A375購自中國科學(xué)院細胞庫，用含10%胎牛血清、青霉素(1×105U/L)和鏈霉素(100 mg/L)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，細胞生長呈80%～90%融合狀態(tài)時，以0.25%胰蛋白酶消化傳代，隔日換液，每2～3 d傳代 1 次。

3 方法

3.1MTS法檢測細胞活力 調(diào)整細胞密度至5×107/L，接種于96 孔板中，每孔100 μL。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入含有不同濃度(10、20和40 μmol/L)10-姜酚的培養(yǎng)基，每孔100 μL，并設(shè)空白對照組，每組設(shè)6個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄舊培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 含MTS的工作液(0.1% FBS ∶MTS=100 μL ∶20 μL)，37 ℃恒溫箱內(nèi)避光孵育120 min，在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm 波長處測量吸光度，上述實驗重復(fù)3次。

3.2細胞計數(shù) 調(diào)整細胞密度至2×108/L，接種于6 孔板中，每孔1 mL。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入含有不同濃度(10、20和40 μmol/L)10-姜酚的培養(yǎng)基，每孔1 mL，并設(shè)空白對照組，每組設(shè)3個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄舊培養(yǎng)基，PBS洗3次，加入0.75 mL 0.25%的胰酶消化，30 s 后加入0.75 mL完全培養(yǎng)基終止，收集細胞到EP管中，取100 μL細胞懸液加到900 μL完全培養(yǎng)基中，Millipore Scepter細胞計數(shù)儀檢測細胞濃度，細胞數(shù)量=細胞濃度(cells/L)×0.0015 L×10(稀釋比例)。

3.3分子對接 使用AutoDock軟件分析10-G與BRAF之間的關(guān)系。從PDB數(shù)據(jù)庫獲得野生型BRAF(PDB ID：1UWH)和V600E突變型BRAF(PDB ID：1UWJ)的空間結(jié)構(gòu)。從ZINC數(shù)據(jù)庫取得10-G(ZINC ID：ZINC43009609)的3D分子結(jié)構(gòu)。采用Autodock Vina軟件進行分子對接模擬，在分子對接前去除原始空間結(jié)構(gòu)中的水和配體。采用軟件YASARA進行能量最小化。用BRAF與已知的BRAF抑制劑BAY 43-9006(索拉非尼，sorafenib)的結(jié)合位點預(yù)測10-G與BRAF之間的關(guān)系。將10-G與BRAF進行分子對接，采用結(jié)合能評估結(jié)合能力的大小。采用Pymol 2.7軟件進行3D作圖。

3.5Western Blot檢測蛋白水平 60 mm 培養(yǎng)皿培養(yǎng)細胞，PBS 漂洗后收集細胞，RIPA 裂解液裂解，提取總蛋白，用BCA 蛋白定量試劑盒定量，加入上樣緩沖液，10% SDS-PAGE 分離，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉1 h，加入 I 抗4 ℃孵育過夜，1×TBST 液洗滌3 次，加入 II 抗，37 ℃孵育1 h，1×TBST 液洗滌3 次。ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，膠片曝光。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。重復(fù)測量數(shù)據(jù)比較采用重復(fù)測量方差分析；多組比較采用單因素方差分析。若具有方差齊性，則各組間多重比較采用LSD法；若方差不齊，則采用Welch穩(wěn)健估計，再采用Dunnett’s T3方法兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 10-G抑制A375細胞活力

細胞活力檢測結(jié)果顯示，10-G劑量依賴性地降低黑色素瘤細胞的活力，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.01)，見圖1A。細胞計數(shù)結(jié)果示10-G能劑量依賴性地降低A375細胞數(shù)量，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖1B。

Figure 1.Treatment with 10-G dose-dependently inhibited the viability of A375 cells. A: cell viability (n=6); B: cell counting (n=3). Mean±SD. ** P<0.01 vs control group.

2 10-G與BRAF的分子對接

3 10-G與BRAFV600E復(fù)合物的分子動力學(xué)模擬

我們進一步采用分子動力學(xué)模擬技術(shù)探索BRAFV600E與10-G結(jié)合的穩(wěn)定性。BRAFV600E/10-G復(fù)合物的表面模擬模型見圖3A，左側(cè)為分子動力學(xué)模擬初始模型，右側(cè)為第100 ns的結(jié)合模型。經(jīng)過100 ns的分子動力學(xué)模擬，10-G仍位于BRAFV600E的抑制劑結(jié)合位點。圖3B展示了重原子均方根偏差root-mean-square deviation，RMSD)的變化軌跡。BRAFV600E/10-G復(fù)合物及非結(jié)合態(tài)BRAFV600E的RMSD均圍繞3 ?波動。在最后20 ns，BRAFV600E/10-G復(fù)合物的RMSD穩(wěn)定地低于非結(jié)合態(tài)BRAFV600E。

Figure 3.Molecular dynamics simulation of BRAFV600E/10G complex. A: binding conformation of BRAFV600E/10G at 0 ns and 100 ns; B: the root-mean-square diviation (RMSD) of heavy atoms.

4 10-姜酚抑制黑色素瘤細胞BRAF、MEK和P38磷酸化水平

我們將10-G(10、20和40 μmol/L)處理黑色素瘤A375細胞3 h后，Western blot檢測p-BRAF、總BRAF、p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-P38和GAPDH的蛋白水平。中、高劑量的10-G顯著降低黑色素瘤細胞p-BRAF的蛋白水平，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，低劑量的10-G對BRAF的磷酸化沒有影響。低、中、高劑量組的10-G均能顯著抑制MEK1/2和p-P38的磷酸化，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，但對ERK1/2的蛋白水平?jīng)]有影響，見圖4。

Figure 4.10-G inhibited the activation of BRAF, MEK and P38. Mean±SD. n=3.** P<0.01 vs control group.

討 論

姜酚是造成姜的辛辣味道的主要物質(zhì)，是由含有β-羥基酮結(jié)構(gòu)的烷基鏈同系物組成的酚類化合物[12]?，F(xiàn)代藥物學(xué)關(guān)于姜酚的藥理作用研究發(fā)現(xiàn)，姜酚具有降血糖、血脂[13]，抗氧化、抗炎[14]以及抗腫瘤功能[15]。姜酚類化合物的抗腫瘤功能研究主要集中于6-G和8-G，關(guān)于10-G抗腫瘤作用的研究較少。目前僅在乳腺癌[15]和宮頸癌[16]上進行過10-G的抗腫瘤研究。黑色素瘤是最常見的皮膚腫瘤，惡性程度較高，是引起死亡人數(shù)最多的皮膚腫瘤，嚴重威脅人類健康。本項目對10-G的抗黑色素瘤作用進行了初步的探索。結(jié)果顯示10-G能劑量依賴性地降低黑色素瘤A375細胞的細胞活力，減少細胞數(shù)量。這些結(jié)果提示，10-G具有抗黑色素瘤作用。

BRAF位于絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)通路上游，具有參與細胞的增殖、遷移和分化的作用，其上游受到RAS的調(diào)控[17]。V600E突變是BRAF在黑色素瘤中主要的突變類型，BRAFV600E的活性是野生型BRAF的10倍[18]。更重要的是V600E突變的BRAF能不依賴RAS信號持續(xù)激活，進而激活下游信號通路，促進腫瘤血管生成，促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移，下調(diào)腫瘤細胞的凋亡反應(yīng)以及機體的免疫反應(yīng)[11]。因此抑制BRAF的激活特別是BRAFV600E的激活，對于治療黑色素瘤具有重要意義。針對BRAF的特異性抑制劑具有良好的抗腫瘤藥物開發(fā)前景[17]。

近年來，分子對接及分子動力學(xué)模擬技術(shù)廣泛應(yīng)用于藥物研發(fā)及篩選中，可以顯著提高藥物開發(fā)的精準度和效率[19]。本研究通過分子對接模擬技術(shù)預(yù)測10-G與BRAFWT或BRAFV600E進行對接來預(yù)測復(fù)合物模型，分析表明10-G 與BRAF及BRAFV600E之間都具有較強的結(jié)合活性。我們還發(fā)現(xiàn)10-G與BRAFV600E的結(jié)合能低于10-G與BRAFWT的結(jié)合能(結(jié)合能越低提示結(jié)合能力越強)，這提示10-G與突變型BRAF的結(jié)合能力高于野生型BRAF。我們還進一步采用了分子動力學(xué)模擬技術(shù)對10-G與BRAFV600E結(jié)合的穩(wěn)定性進行評價，結(jié)果顯示10-G與BRAFV600E的結(jié)合是穩(wěn)定的。本研究采用BRAF抑制劑索拉非尼與BRAF蛋白的結(jié)合位點預(yù)測10-G與BRAF的結(jié)合位點。索拉非尼是2型BRAF抑制劑，能與BRAF激酶區(qū)的ATP結(jié)合域結(jié)合，通過與Cys531形成氫鍵促使索拉非尼占領(lǐng)BRAF的ATP結(jié)合域，還與Glu500和Asp593形成氫鍵穩(wěn)定BRAF非活性構(gòu)象[20]。本研究發(fā)現(xiàn)10-G能與Cys531和Glu500形成氫鍵，這與索拉非尼一致，MD模型也證實了10-G能穩(wěn)定BRAF構(gòu)象，這提示10-G的藥理學(xué)機制可能與索拉非尼接近，是一種潛在的BRAF抑制劑。

為了進一步驗證10-G與BRAF之間的關(guān)系，我們觀察了10-G對黑色素瘤A375細胞BRAF激活的影響。結(jié)果顯示，10-G能顯著抑制BRAF的Ser445磷酸化水平。BRAF的Ser445磷酸化是BRAF激酶活化的標志，RAS激酶能磷酸化Ser445抑制BRAF激酶的自我抑制(auto-inhibition)使得BRAF持續(xù)激活[21]。BRAF抑制劑能穩(wěn)定BRAF的非活性構(gòu)象，使該構(gòu)象的BRAF活化環(huán)(activation loop，A-loop)處于關(guān)閉狀態(tài)，影響了上游的RAS對Ser-445的磷酸化，進而抑制了BRAF的激活[21-22]。我們推測10-G可能通過穩(wěn)定BRAF非活性結(jié)構(gòu)，影響RAS對BRAF Ser445位點的磷酸化。上述結(jié)果證實10-G具有抑制BRAF激活的作用，該機制可能在10-G的抗黑色素瘤過程中的發(fā)揮重要作用。此外，BRAF V600E突變已被證實在膠質(zhì)瘤[23]、直結(jié)腸癌[24]和甲狀腺癌[25]中起了重要作用。這提示10-G可能具有防治這些腫瘤的潛力。

本研究中我們還進一步探索了10-G對BRAF下游的MEK和ERK激酶激活的影響。結(jié)果顯示BRAF能劑量依賴性地抑制MEK1/2的磷酸化，但是不能影響ERK1/2的磷酸化水平。既往研究發(fā)現(xiàn)10-G在結(jié)腸癌上通過激活ERK1/2誘導(dǎo)了結(jié)腸癌的凋亡[26]。我們推測10-G可能通過未知的途徑上調(diào)了ERK1/2的磷酸化水平，抵消了抑制MEK1/2對ERK1/2活性的影響。我們進一步檢索了STRING蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)MEK具有調(diào)控P38活性的作用。因此我們進一步檢測了10-G對P38激酶磷酸化的影響，并發(fā)現(xiàn)10-G能顯著抑制黑色素瘤P38的磷酸化?；谝陨辖Y(jié)果我們推測10-G可能通過抑制MEK而抑制P38的激活，從而發(fā)揮抗黑色素瘤作用。

綜上所述，在本研究中，我們明確了10-G能抑制黑色素瘤的細胞活力，同時發(fā)現(xiàn)10-G可能是一個潛在的突變型BRAF抑制劑，其抗黑色素瘤作用與抑制BRAF密切相關(guān)。本次研究結(jié)果提示抑制BRAF可能是10-G及姜酚抗黑色素瘤的新靶點。