KDM5B基因在乳腺癌中的表達(dá)及其臨床意義*

熊志勇， 吳玨堃， 林良奕

(1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院甲狀腺乳腺外科， 廣東 廣州 510630; 2中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院嶺南醫(yī)院普外科， 廣東 廣州 510530)

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，死亡率較高[1]。乳腺癌的發(fā)生與遺傳、激素影響、生活方式等因素相關(guān)，但其具體發(fā)病機(jī)制尚未明確。組蛋白修飾在生物體生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，其與基因沉默、基因激活、腫瘤生成、染色體形態(tài)建成以及遺傳物質(zhì)修復(fù)等生物學(xué)問題密切相關(guān)[2]；在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中組蛋白修飾也發(fā)揮了重要的作用，組蛋白修飾染色質(zhì)，使之形成更緊湊的形式，從而抑制基因轉(zhuǎn)錄。雌激素受體(estrogen receptor,ER)與組蛋白調(diào)控的通路可以各級串?dāng)_，如 ERa 的表達(dá)和活性。在一些乳腺癌中，可通過組蛋白脫乙酰抑制或減少雌激素受體的表達(dá)，這可能是內(nèi)分泌抵抗的一種機(jī)制[3]。賴氨酸特異性組蛋白脫甲基酶5(lysine-specific demethylase 5, KDM5)家族蛋白均含有JMJC結(jié)構(gòu)域，能夠去除組蛋白H3上第4位賴氨酸的三和二甲基標(biāo)記。KDM5家族包括KDM5A、KDM5B、KDM5C和KDM5D等，其均與腫瘤密切相關(guān)[4]。

研究表明，KDM5B及其負(fù)調(diào)控因子微小RNA-448(microRNA-448, miR-448)通過肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1) 的過表達(dá)在三陰性乳腺癌的轉(zhuǎn)移和進(jìn)展中起關(guān)鍵作用[5]。但目前KDM5B基因在乳腺癌中表達(dá)的臨床意義尚需進(jìn)一步研究。本研究通過腫瘤基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫及臨床乳腺癌樣本，分析KDM5B在乳腺癌中的表達(dá)差異的臨床意義及對預(yù)后生存的影響，為進(jìn)一步闡明KDM5B在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 數(shù)據(jù)資料收集

從TCGA數(shù)據(jù)庫收集113例正常乳腺組織和1 090例乳腺癌數(shù)據(jù)集，下載KDM5B基因表達(dá)譜資料。TCGA中樣本數(shù)據(jù)來源的腫瘤病人自愿捐贈腫瘤組織及正常組織樣本，由人類的腫瘤生物標(biāo)本核心資源庫承擔(dān)的腫瘤組織標(biāo)本和正常組織標(biāo)本的采集、處理和分配工作，組織樣本經(jīng)過嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)處理確保質(zhì)量,可以用于進(jìn)一步分析及測序，并由相關(guān)中心采用高通量測序技術(shù)進(jìn)行基因和基因組排序。利用Bioconductor/TCGAbiolinks函數(shù)包從TCGA數(shù)據(jù)庫(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga)下載并預(yù)處理乳腺癌數(shù)據(jù)集的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，利用Kaplan-Meier plotter(http://kmplot.com/analysis/index.php?p=service&cancer=breast)在線分析KDM5B基因的表達(dá)與乳腺癌及三陰性乳腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性。

2 一般資料

收集中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院甲乳外科2015～2016年乳腺癌切除標(biāo)本共90例，每例標(biāo)本包括腫瘤組織及癌旁乳腺組織(距離腫瘤組織邊緣2 cm以上)。所有病例術(shù)前均未接受放療、化療等治療。新鮮組織標(biāo)本離體后半小時內(nèi)放入液氮速凍，后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存。所有乳腺癌病例均有病理學(xué)診斷證實，全部病例均為女性，平均年齡(43.8±11.2)歲?；颊咭押炇鹩舍t(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)的患者知情同意書，符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)規(guī)定。

3 Real-time PCR檢測乳腺癌組織及癌旁乳腺組織中KDM5B的mRNA表達(dá)

按RNA提取試劑盒的步驟提取RNA，用分光光度計進(jìn)行RNA濃度和純度分析。將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用Primer 5.0軟件設(shè)計KDM5B及內(nèi)參照β-actin的引物序列，見表1。將1 μL cDNA、0.5 μL目的基因上游引物、0.5 μL目的基因下游引物、8 μL SYBR和8 μL雙蒸水建立20 μL的反應(yīng)體系，按“98 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，42次循環(huán)；72 ℃ 10 min”的反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增。用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。

表1 Real-time PCR實驗引物設(shè)計序列

4 數(shù)據(jù)集的篩選和臨床資料參數(shù)相關(guān)性研究

提取TCGA數(shù)據(jù)集中乳腺癌病例中的臨床參數(shù)和生存資料數(shù)據(jù)。根據(jù)KDM5B表達(dá)量的資料，將數(shù)據(jù)按照中位數(shù)二等分，分別設(shè)為高表達(dá)組和低表達(dá)組。為分析KDM5B的表達(dá)與乳腺癌預(yù)后的相關(guān)性，我們從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載了乳腺癌KDM5B mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)和相應(yīng)腫瘤患者生存時間數(shù)據(jù)，利用Kaplan-Meier plotter對這些腫瘤的數(shù)據(jù)集進(jìn)行在線生存分析。

5 統(tǒng)計學(xué)方法

計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析。均數(shù)比較采用t檢驗和方差分析，基因表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系采用卡方檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 KDM5B基因在乳腺癌中的表達(dá)

利用TCGA的數(shù)據(jù)我們分析了113例正常乳腺組織和1 090例乳腺癌中KDM5B mRNA的表達(dá)情況，KDM5B在乳腺癌中的相對表達(dá)水平顯著高于正常乳腺組織(P<0.01)，見圖1。

Figure 1.The mRNA expression level of KDM5B in breast can-cer tissues in TCGA database. Mean±SD. **P<0.01 vs tumor group.

通過使用real-time PCR技術(shù),我們在90例乳腺癌患者的組織中均檢測到KDM5B的表達(dá)，KDM5B在乳腺癌中的相對表達(dá)水平顯著高于癌旁乳腺組織(P<0.01)，見圖2。

Figure 2.The mRNA expression level of KDM5B in breast cancer tissues and adjacent tissues from 90 breast cancer patients. Mean±SD.n=90.**P<0.01 vs tumor group.

2 KDM5B表達(dá)與臨床病理資料的相關(guān)性

在TCGA的乳腺癌數(shù)據(jù)中，KDM5B的表達(dá)與人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2, HER2)、患者年齡、雌激素受體(estrogen receptor, ER)、病理組織類型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，與孕激素受體(progesterone receptor, PR)、絕經(jīng)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無顯著相關(guān)。在所收集的乳腺癌樣本中，KDM5B的表達(dá)與HER2、年齡和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，與ER、PR、絕經(jīng)、病理組織類型和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無顯著相關(guān)，見表2。

表2 KDM5B表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性

3 KDM5B表達(dá)與乳腺癌及三陰性乳腺癌預(yù)后的相關(guān)性

KDM5B的表達(dá)與乳腺癌預(yù)后的相關(guān)性分析表明，KDM5B的表達(dá)與乳腺癌患者的總生存期(HR=1.39,P=0.005)和無病生存期(HR=1.32,P<0.001)均有相關(guān)性，乳腺癌患者標(biāo)本中KDM5B表達(dá)越高，其總生存時間和無病生存時間越短，見圖3、4。

Figure 3.Effect of KDM5B expression on overall survival of breast cancer patients.

Figure 4.Effect of KDM5B expression on disease-free survival of breast cancer patients.

討 論

表觀遺傳是指基因的核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達(dá)的可遺傳的變化，表觀遺傳改變通過對基因表達(dá)進(jìn)行重新編程從而有助于腫瘤發(fā)生[6]，表觀遺傳標(biāo)記的變化是可逆的這一特性，使表觀遺傳調(diào)節(jié)劑成為非常有吸引力的藥物靶標(biāo)[7]，因此，從表觀遺傳改變切入腫瘤的研究有望研發(fā)新的抗腫瘤藥物。研究顯示KDM5B表達(dá)與STING在多種腫瘤類型中的表達(dá)成反比，與腫瘤內(nèi)CD8+T細(xì)胞的水平成反比，這些結(jié)果證實了免疫應(yīng)答的一種新的表觀遺傳調(diào)控途徑，提示KDM5是抗病原體治療和抗癌免疫治療的潛在靶點[8]。KDM5B與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括有頭頸部鱗癌[9]、肺癌[10]和乳腺癌[8]等。因此，對KDM5B在乳腺癌中相關(guān)機(jī)制及臨床意義的深入研究，有助于提高乳腺癌的診治及預(yù)測水平。

本研究利用TCGA的數(shù)據(jù)及臨床乳腺癌樣本分析了乳腺癌中KDM5B mRNA的表達(dá)，顯示KDM5B在乳腺癌顯著高于正常乳腺組織；進(jìn)一步結(jié)合臨床病理資料分析，在TCGA的乳腺癌數(shù)據(jù)中，KDM5B的表達(dá)與HER2、年齡、ER、病理組織類型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，而與PR、絕經(jīng)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無顯著相關(guān)。在我們收集的乳腺癌樣本中，KDM5B的表達(dá)與HER2、年齡和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，與ER、PR、絕經(jīng)、病理組織類型和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)。HER2表達(dá)陽性的乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險更大，我們的結(jié)果與前期研究報道[5]的KDM5B與MALAT1具有相關(guān)性這一結(jié)果相一致。生存分析顯示KDM5B表達(dá)越高，乳腺癌患者總生存時間和無病生存時間越短。