茶色素對(duì)家兔腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用研究

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茶色素(tea pigment，TP)是近年來(lái)研究和開(kāi)發(fā)頗為熱門(mén)的一種生化制品，含有多酚類(lèi)化合物、糖類(lèi)、氨基酸、黃酮類(lèi)、生物堿、甾體化合物等多種組分，根據(jù)顏色又可分為茶黃素、茶紅素、茶褐素3類(lèi)[1]。作為一種天然色素，早在20世紀(jì)60年代就有學(xué)者進(jìn)行提取和開(kāi)發(fā)應(yīng)用研究，并認(rèn)為具有維生素P(E)樣作用[1]。隨著對(duì)茶色素研究逐漸增多，人們對(duì)茶色素的保健功能有了更多的了解，從而為茶色素在藥用工業(yè)的應(yīng)用開(kāi)辟了美好的前景?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，茶色素具有多方面的藥理作用，并在多種相關(guān)疾病防治上具有確切療效。本研究通過(guò)建立家兔全腦缺血再灌注損傷模型，采用病理及免疫組化法觀察茶色素對(duì)腦缺血再灌注損傷海馬區(qū)腦組織中促凋亡蛋白Bax、抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)的影響，旨在為進(jìn)一步擴(kuò)大茶色素的臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為缺血性腦血管病病人的治療增加新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 茶色素膠囊由江西綠色制藥有限公司提供，每粒含茶色素0.24 g。Bax一抗、Bcl-2一抗及SABC試劑盒由武漢博士德公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康成年家兔24只，雌雄不拘，體重2.0 kg～2.5 kg，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型對(duì)照組、茶色素用藥組，各8只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，茶色素用藥組給予茶色素200 mg/kg灌胃，假手術(shù)組和模型對(duì)照組給予等量生理鹽水灌胃，每日1次，共10 d。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前禁食12 h，不禁水。家兔編號(hào)，稱(chēng)重，從耳緣靜脈注射25%氨基甲酸乙酯4 mL/kg，麻醉后仰臥位固定于兔手術(shù)臺(tái)上，頸部剪毛，行頸部正中縱形切口，約2 cm，分離深筋膜及頸部肌群，暴露頸部正中氣管，在氣管兩側(cè)左右分離見(jiàn)血管神經(jīng)鞘，分離兩側(cè)頸總動(dòng)脈及與之伴行神經(jīng)。用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉兩側(cè)頸總動(dòng)脈實(shí)現(xiàn)腦缺血，缺血30 min后，撤除動(dòng)脈夾實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組只分離頸總動(dòng)脈和神經(jīng)，不夾閉頸總動(dòng)脈，30 min后頸總動(dòng)脈放血處死，開(kāi)顱取腦。模型對(duì)照組和茶色素用藥組于實(shí)現(xiàn)再灌注后縫合頸部肌肉和皮膚，放回兔籠飼養(yǎng)，并于再灌注后24 h放血處死取腦組織。

1.4 病理及免疫組織化學(xué)檢查 開(kāi)顱后取腦組織，左側(cè)半球用預(yù)冷的生理鹽水沖去殘血，置于10%的甲醛固定液中待做石蠟切片，進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，測(cè)定家兔海馬區(qū)Bax及Bcl-2的表達(dá)。正常細(xì)胞胞漿胞膜不著色，Bax陽(yáng)性細(xì)胞胞漿呈棕黃色，Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞胞漿胞膜呈棕黃色。在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察，于海馬神經(jīng)元密集區(qū)域隨機(jī)計(jì)算5個(gè)高倍視野下的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，并得陽(yáng)性率，即海馬神經(jīng)元陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占海馬神經(jīng)元細(xì)胞總數(shù)的百分比。

2 結(jié) 果

2.1 茶色素對(duì)腦缺血再灌注損傷后海馬區(qū)促凋亡蛋白Bax表達(dá)的影響 模型對(duì)照組與茶色素用藥組胞漿內(nèi)Bax蛋白陽(yáng)性率高于假手術(shù)組，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；茶色素用藥組胞漿內(nèi)Bax

蛋白陽(yáng)性率低于模型對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表1、圖1。

表1 3組Bax蛋白陽(yáng)性率比較(±s) %

圖1 3組Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)

2.2 茶色素對(duì)腦缺血再灌注損傷后海馬區(qū)抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)的影響 模型對(duì)照組與茶色素用藥組Bcl-2蛋白陽(yáng)性率明顯高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；茶色素用藥組Bcl-2蛋白陽(yáng)性率高于模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見(jiàn)表2、圖2。

表2 3組Bcl-2蛋白陽(yáng)性率比較(±s) %

圖2 3組Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)

3 討 論

茶色素含有多種組分，根據(jù)顏色可分為茶黃素、茶紅素、茶褐素3類(lèi)。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，茶色素具有調(diào)節(jié)血脂、抗氧化、抗腫瘤、抗心腦血管疾病以及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗菌、抗病毒等多方面的藥理作用，并在多種相關(guān)疾病防治上具有確切療效。

茶色素中的酚性類(lèi)衍生物、兒茶素、表兒茶素等在體外可直接發(fā)揮抗氧化作用，體內(nèi)則可顯著增加血清蛋白、血紅蛋白、細(xì)胞漿的抗氧化能力；動(dòng)物模型中能抵抗過(guò)氧化作用對(duì)DNA造成的損害作用[2-3]。茶色素可顯著提高血清超氧化物歧化酶(SOD)的活力和降低血清丙二醛(MDA)的含量，其抗氧化作用至少不弱于茶多酚。

有研究顯示，茶色素能降低高血壓性腦梗死病人的高脂血癥，對(duì)糾正血管內(nèi)皮素紊亂，特別對(duì)提高一氧化氮濃度作用更明顯[4]。Davies等[5]報(bào)道，茶色素明顯減少成年中度高血壓病人血清脂質(zhì)、載脂蛋白(Lpo)濃度，其中總膽固醇(TC)下降6.5%，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)下降11.1%，載脂蛋白A (LpoA)下降16.4%，載脂蛋白B(LpoB)、載脂蛋白A-I(LpoA-I)含量明顯降低；并認(rèn)為膽固醇和LDL-C下降對(duì)預(yù)防心血管疾病具有重要意義。亦有資料報(bào)道，茶色素有抗菌、抗病毒的作用[6]。茶色素抑制細(xì)菌和病毒的作用機(jī)制包括對(duì)大腸桿菌DNA聚合酶、RNA聚合酶或病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制[7]。茶色素除具有以上作用外，還具有抗突變、抗齲齒、預(yù)防糖尿病等作用。此外，有研究表明茶色素對(duì)去甲腎上腺素和氯化鉀引起的血管收縮有明顯的抑制作用，可使血管張力降低，且高濃度比低濃度作用更明顯[8]。

茶色素在腦缺血再灌注領(lǐng)域有很大的應(yīng)用價(jià)值，細(xì)胞凋亡是腦缺血再灌注損傷后細(xì)胞死亡的一種重要形式，細(xì)胞凋亡是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Bcl-2和Bax兩種凋亡蛋白在腦缺血再灌注損傷中的表達(dá)，并探討了茶色素對(duì)兩種凋亡蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果表明茶色素可以減輕全腦缺血30 min、再灌注24 h后Bax的表達(dá)，增強(qiáng)Bcl-2的表達(dá)，起到減少細(xì)胞凋亡，保護(hù)腦組織的作用。

茶色素作為一種純中藥制劑，安全范圍大，作用緩和，具有極高的藥用價(jià)值。