肝郁脾虛證多發(fā)性抽動癥大鼠模型的建立及評價

劉曉芳 薛小娜 王素梅 張 雯 衛(wèi) 利 王道涵 尹英敏

(1 北京中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院東方醫(yī)院,北京,100078; 2 北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院,北京,100029)

多發(fā)性抽動癥(Tourette Syndrome,TS),是一種兒童精神科常見的神經(jīng)精神障礙性疾病[1]。肢體肌肉、面部肌肉及頸部肌肉或者患兒出現(xiàn)迅速、反復、不規(guī)則的抽動,為TS常見的臨床特征。TS往往有沖動、強迫、多動、注意力不集中等各種伴隨癥狀[2]。本病在臨床缺乏比較有效的治療,嚴重影響了患兒的身心健康,目前受到臨床醫(yī)生與社會公眾的極大關(guān)注[1]。隨著研究的進展,目前迫切需求建立模擬小兒TS的動物模型,進行病因、病理機制、藥物篩選及藥效學等方面的評價研究,為揭示和有效診治TS提供研究工具。隨著中醫(yī)對TS的研究逐漸增多,目前模型不能很好反映中醫(yī)“辨證論治”思想精髓的缺點愈加突出。因此,本次實驗擬建立TS大鼠模型的同時,建立其中醫(yī)證型中的肝郁脾虛證,并對其以評價,以便對中醫(yī)治療兒童TS有進一步的深入研究。結(jié)合既往文獻及課題組前期實驗,依據(jù)中醫(yī)病因發(fā)病學原理,本課題組以亞氨基二丙腈(IDPN)腹腔注射誘導法后,用飲食失節(jié)、慢性束縛以及過度疲勞法建立TS肝郁脾虛證大鼠模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 30只3周齡雄性SPF級SD大鼠(于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司購買,許可證編號為:SCXK(京)2012-0001),要求其重量在40～60 g。自由攝食飲水,保持相對的溫度及濕度,注意環(huán)境通風(溫度控制在(22±2)℃,濕度控制在50%-70%)。

1.1.2 藥物 0.9%氯化鈉注射液(北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司，批號:0906201w),10 mL每支;亞氨基二丙晴1瓶(美國Sigma-Aldrich，批號:24859071)。

1.1.3 試劑與儀器 D-木糖酶測試分析試劑盒(南京建成生物科技有限公司,生產(chǎn)批號:A035)；人胃泌素酶聯(lián)免疫分析試劑盒(江萊生物科技有限公司,生產(chǎn)批號:2402503)；精密電子天平(美國雙杰兄弟集團有限公司,JJ2000型)；自發(fā)活動視頻分析系統(tǒng)(上海吉星軟件科技有限公司,DB018型)；DigBehv動物行為分析系統(tǒng)(SOFTRON,JLBehv-RRTM)；數(shù)碼攝錄一體機(HDR SR10E型,SONY)；微量振蕩器(北京拓普分析儀器有限公司,DEM-3)；酶標儀(Thermo Scientific，Multiskan MK3)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將自由分籠喂養(yǎng)的大鼠分成3組,每組10只,分別標注為肝郁脾虛組、空白組和模型組。讓各組大鼠自由飲水及進食失誤,以12 h為白晝黑夜節(jié)律。將各組大鼠適應性喂養(yǎng)1周后,參照全身用藥法[3]及前期課題實驗結(jié)論[4-7],模型組及中醫(yī)證型組大鼠腹腔注射300 mg/(kg·d)的IDPN,空白組則在腹腔內(nèi)注射同等的氯0.9%化鈉注射液。各組均注射7 d,1次/d。

1.2.2 給藥方法 參考李艷彥等人的方法[8-10],從腹腔注射IDPN之日起,肝郁脾虛組大鼠于每天上午9:00置于束縛盒中限制其活動3 h,下午3:00放于盛有溫水桶內(nèi)迫其游泳10 min左右。連續(xù)3周隔日給大鼠喂食。于造模第21天開始,停止上述造模因素,觀察其行為變化。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 自主活動次數(shù)測定 每周對各組大鼠進行1次自主活動觀察,記錄大鼠15 min內(nèi)的自主活動情況。

1.2.3.2 刻板運動觀察及評分 于造模后第1天、第7天、第14天、第21天、第28天進行刻板運動觀察及評分。評分時間為2 min,評分標準參照前期研究[2]。

1.2.3.3 中醫(yī)證型評價 1)外觀變化:觀察各組大鼠活動活躍度、毛色順滑、進食量多少及大便次數(shù)的變化。2)重量測定:于實驗第1天開始,每隔7天測定1次大鼠的重量。3)胃泌素及D-木糖酶定量測定:在實驗第28天測定各組大鼠血清的胃泌素及D-木糖酶。在大鼠眼眶球后取1 mL血,加入無菌試管中。室溫靜置2 h后將其離心,冷凍保存。采用D-木糖酶測試分析試劑盒以及人胃泌素酶聯(lián)免疫分析試劑盒檢測其含量。4)脾臟與胸腺指數(shù):胃泌素及D-木糖酶定量測定后,對各組大鼠解剖,取其脾臟、胸腺。將各組器官分別稱重后,根據(jù)公式計算各組大鼠的胸腺及脾臟指數(shù)

2 結(jié)果

2.1 行為學測定 從實驗第4天開始,除空白組外,其余組大鼠在受到外界各種刺激后,出現(xiàn)各種特殊行為,如直立、攀爬。實驗第8天,除空白組外,其余組大鼠均出現(xiàn)不同程度的頭部抽動,同時舔、嗅、活動增多等行為,部分大鼠出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)行為。

2.2 自主活動儀檢測 空白組大鼠與其余組大鼠比較,自主活動數(shù)明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。模型組與中醫(yī)證型組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠的自主活動

2.3 刻板運動觀察評分 模型組與肝郁脾虛組比較未見明顯差異(P>0.05)。除空白組外,其余各組大鼠第28天與第7天比較,其刻板運動有顯著性差異(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠刻板運動評分分)

2.4 中醫(yī)證型測定與評價 肝郁脾虛組大鼠造模后開始出現(xiàn)煩躁易怒的狀態(tài)。3周后,肝郁脾虛組

表3 各組大鼠體重比較

大鼠逐漸出現(xiàn)活動及飲食減少,情緒低落,體重增加緩慢(P<0.05),大便次數(shù)增多,質(zhì)地較稀的癥狀。見表3。

2.5 胸腺及脾臟指數(shù)測定 肝郁脾虛組以及模型組與空白組比較,其胸腺、脾臟指數(shù)差異分別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。肝郁脾虛組大鼠與模型組大鼠之間比,各組指數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠胸腺及脾臟指數(shù)比較

2.6 D-木糖濃度測定與胃泌素測定 中醫(yī)證型組大鼠與其余各組比較,其D-木糖濃度測定與胃泌素測定差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 胃泌素及D-木糖濃度

3 討論

多年來,本課題組一直致力于小兒TS的臨床與基礎實驗研究。導師王素梅教授認為,小兒TS病機多屬土虛木亢,風痰內(nèi)擾,臨證時采用扶土抑木法從肝脾論治,取得一定療效。課題組利用“名老中醫(yī)臨床診療信息采集系統(tǒng)”及名老中醫(yī)經(jīng)驗智能分析平臺,對王素梅教授于2005年10月至2006年5月之間建立的102例TS病歷,進行信息結(jié)構(gòu)化、數(shù)據(jù)分析,結(jié)果表明:共757次診次中,中醫(yī)辨證分型以肝郁脾虛最多見,共334例次,占44.12%[11-13]。課題組通過文獻查閱亦發(fā)現(xiàn),抽動癥患者以肝郁脾虛型為最多見。因此,本課題組認為,建立TS肝郁脾虛證動物模型對本病的中醫(yī)辨證論治有著重大意義。

參照文獻及SD大鼠本身的特點,本實驗造模方法基于以下考慮:動物在慢性束縛中,其活動被禁,引起情緒受抑,情志不遂,氣機不暢,導致肝郁;迫其每日游泳活動10 min,使有勞累感;給予飲食的時而增加與時而缺失類似饑飽失調(diào),兩者相加,與中醫(yī)的飲食勞倦類似,導致脾胃受損。本次實驗過程中觀察到,肝郁脾虛證的大鼠體重有明顯的減輕,其外觀表證發(fā)生明顯的變化。除了出現(xiàn)頭部抽動、旋轉(zhuǎn)行為外,大鼠由開始的易怒煩躁轉(zhuǎn)為情緒低落,同時飲食減少,大便由正常轉(zhuǎn)為稀溏;活動漸少,體重增加緩慢,與中醫(yī)臨床中肝郁脾虛證型表現(xiàn)出的癥狀較接近。

脾臟與胸腺的功能,對動物有重要意義。脾臟與胸腺的各種改變,目前認為是中醫(yī)脾虛證的病理學依據(jù)之一[14-15]。本次實驗中,中醫(yī)證型組動物的脾臟與胸腺指數(shù)與空白組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),與模型組大鼠比較，差異無統(tǒng)計學意義,表明模型組與肝郁脾虛組大鼠均有免疫力的下降。

胃泌素在人體及動物的消化系統(tǒng)中有重要作用。目前有相關(guān)文獻表明,其水平下降程度與肝郁脾虛證的嚴重程度有一定的相關(guān)性[16]。本實驗中統(tǒng)計學有差異性,說明本脾虛證TS模型具有胃蠕動減弱的病理基礎。血清D-木糖含量水平的變化可以較客觀地反映兒童的消化吸收代謝功能,是一個與機體的小腸吸收功能有正相關(guān)性的檢測指標。血清D-木糖水平的變化可以客觀地反映人體的消化功能[17-19]。從中醫(yī)角度而言,脾失健運,無法運化水谷精微,使機體無法吸收其精華。表現(xiàn)在生物學糖代謝方面,則會出現(xiàn)D木糖數(shù)值降低。本次實驗中中醫(yī)證型組大鼠與其余各組大鼠比較統(tǒng)計學有差異性,說明其具有腸道吸收功能減弱的表現(xiàn)。

SD大鼠腹腔注射IDPN所誘導的TS模型抽動癥狀穩(wěn)定,表面效度良好,可維持較長時間[20-22]。結(jié)合飲食失節(jié)、慢性束縛以及過度疲勞法建立肝郁脾虛證TS大鼠模型,具有兒童TS中醫(yī)證型中的肝郁脾虛證的相似癥狀。但根據(jù)兒童TS的臨床表現(xiàn),其生物學特性目前存在一定的差距,且本次實驗尚缺乏對肝郁癥的生物學檢查方法和相關(guān)指標,我們將在下一步的深入研究中繼續(xù)探索以彌補本次不足。