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    單核細(xì)胞增生李斯特菌LadR蛋白對外排泵MdrL的調(diào)控機(jī)制研究

    2018-12-25 11:12:30徐雅夢姜曉冰于濤
    生物技術(shù)通報(bào) 2018年12期
    關(guān)鍵詞:外排質(zhì)粒試劑盒

    徐雅夢 姜曉冰 于濤

    (1. 河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,新鄉(xiāng) 453007;2. 新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,新鄉(xiāng) 453003)

    單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)是一種重要的食源性致病菌,該菌在自然界分布廣泛,易對熟肉制品、乳制品、海產(chǎn)品和蔬菜等食品造成污染。攝入被Lm污染的食品可引起李斯特菌?。↙isteriosis)的爆發(fā)和流行[1]。老人、孕婦、新生兒以及免疫力低下者是李斯特菌病的易感人群,臨床癥狀主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎、孕婦流產(chǎn)等[2]。李斯特菌病在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率較低,但是其致死率卻高達(dá)25.9%[3],嚴(yán)重威脅人類的健康。為了防止食品被致病菌污染,食品企業(yè)通常使用消毒劑來抑制或殺滅食品加工環(huán)境中的微生物。苯扎氯銨(Benzalkonium chloride,BC)屬于季銨鹽類消毒劑,被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)領(lǐng)域。BC的長期使用可能會促使耐藥菌株的出現(xiàn),影響其消毒效果。

    許多文獻(xiàn)報(bào)道,從食品加工環(huán)境和市售食品中分離的Lm菌株對BC敏感性下降[4-6]。目前研究者普遍認(rèn)為外排泵是介導(dǎo)Lm對BC耐受的主要機(jī)制。外排泵屬于膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,在細(xì)菌中廣泛存在。除了參與細(xì)胞的正常物質(zhì)運(yùn)輸和代謝,外排泵還能夠去除細(xì)菌細(xì)胞和胞膜中的有害物質(zhì),幫助細(xì)菌抵御外界不良環(huán)境的影響[7]。研究報(bào)道,一些外排泵可將抗生素、消毒劑、重金屬等作為底物排出菌體外使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[8]。我們先前的研究發(fā)現(xiàn),主要易化子超家族(Major facilitator superfamily,MFS)外排泵MdrL在Lm對BC耐受中起作用。根據(jù)Lm全基因組序列可知,ladR基因反向位于mdrL外排泵基因的上游,編碼的LadR蛋白由176個(gè)氨基酸分子組成,屬于PadR轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控蛋白家族。Huillet等[9]推測,mdrL基因的啟動子區(qū)域可能存在調(diào)控蛋白LadR的結(jié)合位點(diǎn),但這一推測并沒有被進(jìn)一步證實(shí)。本研究以Lm標(biāo)準(zhǔn)菌株EGD-e為研究對象,利用同源重組技術(shù)[10]構(gòu)建ladR基因缺失菌株ΔladR,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction,qRT-PCR)、凝膠阻滯試驗(yàn)(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)等調(diào)查LadR蛋白對外排泵MdrL的調(diào)控作用及調(diào)控方式。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株及質(zhì)粒 Lm標(biāo)準(zhǔn)菌株EGD-e由華中師范大學(xué)羅勤教授惠贈;穿梭質(zhì)粒pMAD和表達(dá)載體pET32a由本實(shí)驗(yàn)室保存;大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司。

    1.1.2 培養(yǎng)基及主要試劑 腦心浸液培養(yǎng)基(Brain Heart Infusion,BHI),購自北京陸橋生物技術(shù)有限公司;苯扎氯銨,購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒,購自北京天根生化科技有限公司;膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、T4連接酶、限制性內(nèi)切酶,購自美國Thermo Fisher;TaqDNA聚合酶和dNTP,購自大連寶生物工程有限公司;His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5×),購自碧云天生物技術(shù)研究所;引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

    1.1.3 儀器與設(shè)備 DH360型電熱恒溫培養(yǎng)箱,北京科偉永興儀器有限公司;THZ-82氣浴恒溫振蕩器,金壇天竟實(shí)驗(yàn)儀器廠;TGL-16B型離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠;ETC811型基因擴(kuò)增儀,北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司;DYY-8C型電泳儀,北京市六一儀器廠;LightCycler@96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀,瑞士Roche;UNIVERSAL HOOD II 凝膠成像分析系統(tǒng)、Gene PulserXcellTM電轉(zhuǎn)儀,美國 Bio-Rad。

    1.2 方法

    1.2.1ladR基因缺失突變株的構(gòu)建與分子鑒定 以EGD-e基因組DNA為模板,分別用1408-1/1408-2和1408-3/1408-4兩對引物擴(kuò)增ladR基因的上下游同源臂,引物序列見表1。利用重疊延伸PCR(Splicing by Overlap Extension,SOE-PCR) 技 術(shù)[11]融 合 上下游同源臂,融合片段經(jīng)切膠回收后與穿梭載體pMAD分別用限制性內(nèi)切酶BamH I和MluI進(jìn)行同步雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后進(jìn)行連接反應(yīng),將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pMAD-ΔladR轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中,將陽性轉(zhuǎn)化株送至北京博邁德基因技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

    采用青霉素G法制備EGD-e感受態(tài)細(xì)胞[12]。將測序正確的重組質(zhì)粒pMAD-ΔladR與EGD-e感受態(tài)細(xì)胞混勻,電擊后立刻加入500 μL BHI培養(yǎng)基于30℃培養(yǎng)3 h。將菌液均勻涂布于含紅霉素(5 μg/mL)、和X-gal的BHI平板上,30℃培養(yǎng)48 h。挑取藍(lán)色單菌落于含紅霉素(5 μg/mL)的BHI液體培養(yǎng)基,39℃培養(yǎng)24 h。稀釋菌液選擇合適梯度的稀釋液涂布于含紅霉素(5 μg/mL)和X-gal的BHI平板上,39℃培養(yǎng)48 h。挑取藍(lán)色單菌落于BHI液體培養(yǎng)基,30℃培養(yǎng)24 h。將菌液轉(zhuǎn)接至新鮮的BHI,39℃培養(yǎng)。稀釋菌液選擇合適梯度的稀釋液涂布于含X-gal的BHI平板上,39℃培養(yǎng)48 h。挑取白色單菌落用引物1408-1和1408-4進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測缺失條帶,最終獲得ΔladR突變株。

    表1 PCR擴(kuò)增所用引物

    1.2.2mdrL基因轉(zhuǎn)錄水平檢測 將野生株EGD-e和突變株ΔladR分別接種至BHI中(各6管),37℃振蕩培養(yǎng)至OD600nm≈0.6。將菌株平均分為兩組,第一組為不加任何藥物(作為對照組),第二組為加入BC(2 μg/mL),37℃繼續(xù)培養(yǎng)30 min。立即加入10%的反應(yīng)終止液(苯酚∶無水乙醇=1∶9)[13],冰上放置10 min。

    按照細(xì)菌RNA提取試劑盒的使用說明提取細(xì)菌總RNA,測定RNA的濃度和純度后用于后續(xù)試驗(yàn)。利用cDNA第一鏈合成試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,-20℃保存?zhèn)溆?。根?jù)GenBank的基因序列設(shè)計(jì)靶基因mdrL和參照基因16S rRNA的引物(表2)。以cDNA作為模板,使用RealMasterMix(SYBR Green)試劑盒進(jìn)行 qRT-PCR。采用 ΔΔCT法[14]進(jìn)行目的基因表達(dá)量的分析。

    1.2.3ladR基因的克隆 以EGD-e的基因組DNA作為擴(kuò)增模板,用引物ladR-q1和ladR-q2(表1)擴(kuò)增ladR全基因序列。ladR擴(kuò)增產(chǎn)物與表達(dá)載體pET32a分別用限制性內(nèi)切酶BamH I和XhoI進(jìn)行同步雙酶切,酶切后的產(chǎn)物經(jīng)純化后進(jìn)行連接反應(yīng),將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體pET32a-ladR轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3),挑選陽性轉(zhuǎn)化株送至北京博邁德公司測序。

    1.2.4 LadR蛋白的表達(dá)與純化 將LadR蛋白表達(dá)菌株接種于5 mL含Amp(100 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基,37℃過夜培養(yǎng)。過夜培養(yǎng)物按1∶100分別接種至50 mL含Amp(100 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基,37℃振蕩培養(yǎng)至OD600nm≈0.6。將菌液分兩組,一組不做任何處理,另一組加入終濃度為0.5 mmol/L[15]的 IPTG,37℃ 繼 續(xù) 培 養(yǎng) 8 h。 離 心(4 000×g,5 min)收集細(xì)胞。按照His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒的步驟提取純化重組蛋白His6-LadR。取10 μL純化蛋白進(jìn)行SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)[16]。利用 BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定重組蛋白His6-LadR的濃度。

    1.2.5 凝膠阻滯試驗(yàn) 利用引物pmdrL-F/pmdrL-R擴(kuò)增mdrL的啟動子區(qū)域,同時(shí)隨機(jī)挑選一段編碼區(qū)DNA(recA)作為陰性對照。將純化后的DNA(200 ng)與純化后的重組蛋白His6-LadR在EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液中混合,室溫放置20 min。利用6%非變性PAGE電泳進(jìn)行結(jié)合活性檢測[17]。

    2 結(jié)果

    2.1 ladR基因缺失菌株的構(gòu)建與分子鑒定

    用引物1408-1/1408-2擴(kuò)增得到ladR基因上游同源臂480 bp,用引物1408-3/1408-4擴(kuò)增ladR下游同源臂168 bp。通過SOE-PCR得到648 bp的上、下游同源臂融合片段ΔladR,條帶均與預(yù)期結(jié)果一致(圖1-A)。融合片段ΔladR與穿梭質(zhì)粒pMAD連接獲得重組質(zhì)粒pMAD-ΔladR。雙酶切驗(yàn)證結(jié)果如圖1-B。

    測序正確的重組質(zhì)粒pMAD-ΔladR電轉(zhuǎn)至EGD-e感受態(tài)。篩選得到的陽性菌株用檢測引物1408-1/1408-4只能擴(kuò)增出648 bp的片段(圖1-C)。測序結(jié)果表明已成功缺失ladR基因,獲得ΔladR突變株。

    圖1 ladR基因缺失株的構(gòu)建

    2.2 mdrL基因轉(zhuǎn)錄水平分析

    由圖2可明顯看出,與野生株相比,突變株ΔladR的mdrL基因的轉(zhuǎn)錄水平提高約51倍。BC脅迫下,野生株EGD-e的mdrL基因轉(zhuǎn)錄水平提高約1.6倍,突變株ΔladR的mdrL基因的轉(zhuǎn)錄水平約1.4倍。該結(jié)果表明LadR對mdrL基因有負(fù)調(diào)控作用。

    圖2 qRT-PCR檢測mdrL基因轉(zhuǎn)錄水平

    2.3 ladR基因的克隆

    以EGD-e基因組DNA為模板擴(kuò)增得到長度為525 bp的ladR全基因片段(圖3);構(gòu)建得到的重組質(zhì)粒pET32a-ladR經(jīng)雙酶切驗(yàn)證及測序,驗(yàn)證結(jié)果一致表明已成功獲得表達(dá)菌BL21(DE3)-ladR。

    圖3 表達(dá)菌BL21(DE3)-ladR的構(gòu)建

    2.4 LadR蛋白的表達(dá)及純化

    IPTG誘導(dǎo)后,表達(dá)宿主菌在35 kD附近出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶,與預(yù)期的蛋白分子量大小(36.5 kD)十分相近(圖4),表明目的蛋白在宿主菌已得到成功表達(dá)。利用His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒處理后可以得到高純度的His6-LadR蛋白;經(jīng)BCA蛋白濃度測定試劑盒測定可知其濃度為1 mg/mL。

    M:蛋白maker;1:純化蛋白;2:陰性對照;3~5:IPTG誘導(dǎo)

    2.5 凝膠阻滯試驗(yàn)

    EMSA結(jié)果(圖5-A)顯示,LadR蛋白可與mdrL基因啟動子區(qū)域結(jié)合,并且該結(jié)合作用在一定范圍內(nèi)隨LadR蛋白濃度升高而增強(qiáng);而在所有蛋白濃度下,陰性對照recA基因均未出現(xiàn)阻滯條帶(圖5-B)。結(jié)果表明,LadR蛋白可與mdrL啟動子序列發(fā)生特異性結(jié)合作用。

    圖5 重組蛋白His6-LadR與啟動子區(qū)域結(jié)合活性

    3 討論

    Tamburro等[18]研究報(bào)道,BC脅迫下mdrL基因出現(xiàn)明顯過表達(dá)現(xiàn)象,推測MdrL外排泵在Lm對BC耐受中起作用。Romanov等[19-20]通過檢測不同Lm菌株中mdrL基因的表達(dá)量發(fā)現(xiàn),BC脅迫下mdrL基因的轉(zhuǎn)錄水平升高4-20倍,該結(jié)果表明在BC刺激下不同菌株的mdrL基因表達(dá)量呈現(xiàn)差異性。我們先前的研究結(jié)果顯示,與野生株EGD-e相比,mdrL基因缺失突變株ΔmdrL在亞致死濃度BC脅迫下的生長遲滯期延長、平均最大生長率和平均最大光密度值均降低;在致死濃度BC作用下的存活率降低2個(gè)log值,表明MdrL外排泵在Lm對BC耐受中起作用。本研究結(jié)果顯示,BC作用下,mdrL基因在野生株EGD-e中的轉(zhuǎn)錄水平提高約1.6倍,表明BC能夠誘導(dǎo)mdrL基因的表達(dá)。不過,與前人的研究結(jié)果相比,本研究中mdrL基因轉(zhuǎn)錄水平升高的倍數(shù)較低。其原因可能有三點(diǎn):一是菌株自身的差異性;二是BC刺激的時(shí)期不同;三是BC作用的濃度不同。

    Huillet等[9]利用 Northern blot技術(shù)檢測mdrL基因的表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)LadR蛋白對mdrL基因具有負(fù)調(diào)控作用,并推測在正常生長條件下(BHI培養(yǎng)基),LadR與mdrL基因的啟動子區(qū)域結(jié)合,從而抑制mdrL外排泵基因的轉(zhuǎn)錄。本論文在前人研究的基礎(chǔ)上,深入調(diào)查LadR蛋白對MdrL外排泵的調(diào)控機(jī)制。qRT-PCR結(jié)果顯示,無BC刺激時(shí),mdrL基因在ladR基因缺失突變株中的轉(zhuǎn)錄水平比野生株EGD-e高51倍,表明LadR蛋白可能負(fù)調(diào)控mdrL基因的轉(zhuǎn)錄;BC作用下,mdrL基因在突變株中的轉(zhuǎn)錄水平比EGD-e高1.4倍,我們推測在BC脅迫下,除了LadR蛋白可能還存在其他的調(diào)控蛋白參與mdrL的調(diào)控。EMSA試驗(yàn)[21]結(jié)果顯示,LadR蛋白能夠與mdrL基因啟動子區(qū)域結(jié)合,并且其結(jié)合活性隨蛋白濃度的增加而增強(qiáng),當(dāng)?shù)鞍诐舛却笥?.4 mg/mL時(shí),結(jié)合活性沒有明顯變化。LadR蛋白與recA基因的編碼區(qū)沒有發(fā)生結(jié)合作用,表明LadR與mdrL基因啟動子區(qū)域的結(jié)合具有特異性。

    4 結(jié)論

    本研究以Lm標(biāo)準(zhǔn)菌株EGD-e為研究對象,深入調(diào)查LadR對MdrL外排泵的調(diào)控作用及其調(diào)控方式。結(jié)果表明,BC能夠誘導(dǎo)mdrL基因的表達(dá)。LadR蛋白負(fù)調(diào)控mdrL基因的表達(dá);在正常生長條件下,LadR與mdrL基因的啟動子區(qū)域結(jié)合,抑制外排泵基因mdrL的表達(dá)。

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