血清miR-374a在宮頸癌患者中的表達(dá)變化及其與臨床病理特征的關(guān)系

亓穎芝,郎曉艷,周靜,李春鳳,李靜,蘆鑫

(山東大學(xué)第二醫(yī)院,濟(jì)南250033)

宮頸癌是一種女性常見惡性腫瘤[1]。近年，我國(guó)宮頸癌發(fā)病率和病死率明顯上升。miRNA是一類大小為18～25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA，通過與mRNA的非編碼區(qū)3′UTR相互結(jié)合，來(lái)發(fā)揮對(duì)靶mRNA的降解或抑制其翻譯[2]，其廣泛分布于血清、尿液、腦脊液等體液中，且穩(wěn)定存在。有文獻(xiàn)[3]報(bào)道，miR-374a在結(jié)腸癌中表達(dá)水平較癌旁組織明顯上調(diào)[4]；其在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)也明顯升高；Cai等[5]發(fā)現(xiàn)，miR-374a可以激活Wnt/β-catenin分子通路，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移。因此，推測(cè)miR-374a可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。但是目前關(guān)于miR-374a表達(dá)水平與宮頸癌患者臨床病理特征的相關(guān)性尚未見報(bào)道，本研究進(jìn)行了相關(guān)探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年8月～2017年4月入住山東大學(xué)第二醫(yī)院婦科擬手術(shù)治療的宮頸癌患者68例，均經(jīng)病理檢查確診。術(shù)前均未行化療、放療等其他治療。年齡33～65歲。病理分級(jí)：G1級(jí)20例、G2級(jí)33例、G3級(jí)15例；臨床分期按國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟分期標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ期30例、Ⅱ期38例；組織類型：鱗癌40例、腺癌28例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例，無(wú)45例；根據(jù)是否感染人類乳頭瘤病毒(HPV)劃分:陽(yáng)性50例，陰性18例;腫瘤直徑≥4 cm 23例，<4 cm 45例。選取體檢健康者36例作為對(duì)照組，年齡35～60歲。無(wú)宮頸部位的病變或者癌癥史。所有血液標(biāo)本收集后置于-80 ℃低溫保存。

1.2 血清miR-374a的檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(QRT-PCR)法。提取RNA：術(shù)前抽取宮頸癌患者靜脈血，總RNA于患者和正常體檢者血清中提取，提取方法按照天根miRcute miRNA提取分離試劑盒說明書操作。提取后使用紫外分光光度儀檢測(cè)樣品的濃度與純度，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。合成cDNA：按照First Strand cDNA Synthesis Kit說明書加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所需要的各種試劑，將總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)條件如下:16 ℃、15 min, 40 ℃、45 min,85 ℃、15 s。QRT-PCR：以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，按照SYBR Premix EX TaqTM試劑盒說明書操作，20 μL反應(yīng)體系中加入miR-374a引物，在熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，其反應(yīng)條件為:預(yù)變性95 ℃、5 min，95 ℃、15 s，58 ℃、30 s，72 ℃、30 s，35個(gè)循環(huán)。U6-上游引物： 5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′;U6-下游引物：5 ′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。MiR-374a-上游引物：5 ′-TTATAATACAACCTGATAAGTG-3′；MiR-374a-下游引物： 5 ′-TGTCAACGATACGCTACGTAA-3′。采用相對(duì)定量方法對(duì)miRNA進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量計(jì)算，U6作為內(nèi)參，以2-ΔΔCT法計(jì)算宮頸癌患者及健康對(duì)照者血清miR-374a表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清中miR-374a的表達(dá)水平比較 宮頸癌組與對(duì)照組血清miR-374a相對(duì)表達(dá)水平分別為2.89±0.91、1.01±0.23。與對(duì)照組相比，宮頸癌組血清miR-374a表達(dá)水平升高(P<0.05)。

2.2 血清miR-374a表達(dá)水平與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 宮頸癌患者血清miR-374a表達(dá)水平與臨床分期、病理分級(jí)、是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P均<0.05)；與患者年齡、宮頸癌組織學(xué)類型、是否HPV感染、腫瘤直徑無(wú)關(guān)(P均>0.05)。見表2。

表2 血清miR-374a表達(dá)水平與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

宮頸癌是最常見婦科惡性腫瘤，在女性惡性腫瘤中發(fā)病率居第二位[6]。因此從分子水平對(duì)宮頸癌發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入研究有助于發(fā)現(xiàn)新診療方法，提高宮頸癌的療效。宮頸癌患者血清中循環(huán)miRNA的表達(dá)譜與正常健康對(duì)照者相比有一定的差異，并且循環(huán)miRNA在血清中穩(wěn)定且不易降解，有可能成為宮頸癌早期篩查及診斷的無(wú)創(chuàng)標(biāo)志物。循環(huán)miRNA是胞外分泌的膜包裹顆粒非編碼小RNA，可以與蛋白質(zhì)結(jié)合，也可以游離存在[7]。Nagamitsu等[8]研究宮頸癌患者血清中的miRNA，找出6個(gè)與正常對(duì)照組相比表達(dá)差異明顯的miRNA，進(jìn)一步試驗(yàn)后得出miR-483-5p、miR-1246、miR-1275和miR-1290可作為宮頸癌的診斷標(biāo)記物。Wang等[9]發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者血清中miR-646、miR-141和miR-542-3p在手術(shù)前后表達(dá)有差異，推測(cè)這些miRNAs可成為宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)的新指標(biāo)。Jia等[10]同樣檢測(cè)宮頸癌患者和正常對(duì)照組血清中循環(huán)miRNA的表達(dá)水平，得出宮頸癌組有12個(gè)miRNA的表達(dá)量明顯升高。其中5種miRNA聯(lián)合檢測(cè)宮頸癌的特異性和靈敏度高于鱗狀細(xì)胞癌抗原(SCC)和CA125，推斷相對(duì)于SCC和CA125，血清中miRNAs診斷宮頸癌更有優(yōu)勢(shì)。因此循環(huán)miRNAs可成為宮頸癌早期無(wú)創(chuàng)診斷的新腫瘤標(biāo)志物，甚至有可能取代傳統(tǒng)非特異性的SCC和CA125等血清標(biāo)志物。

miR-374a是位于X染色體上q13的miRNA。近年很多研究證實(shí)，miR-374a在許多腫瘤，如胃癌、肺癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤中表達(dá)異常，并參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，發(fā)揮重要的基因調(diào)控作用。目前miR-374a在宮頸癌患者血清中的表達(dá)尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，宮頸癌組miR-374a表達(dá)水平升高，推測(cè)其可能參與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展。miR-374a有可能成為宮頸癌早期篩查及診斷的新標(biāo)志物。

Xu等[11]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中miR-374a表達(dá)水平明顯升高，miR-374a可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力，該研究還得出miR-374a通過靶向C激酶信號(hào)抑制劑1而發(fā)揮作用。Cai等[5]研究發(fā)現(xiàn)，miR-374a在乳腺癌轉(zhuǎn)移細(xì)胞株中通過靶向WIF1、PTEN、WNT5A，激活Wnt/β-catenin信號(hào)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移；而且miR-374a在發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者中表達(dá)水平明顯升高，并與生存率密切相關(guān)，提示miR-374a在乳腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要作用。

本研究首次檢測(cè)了宮頸癌患者血清中miR-374a的表達(dá)水平，并進(jìn)一步分析了miR-374a與宮頸癌患者各臨床病理特征之間的關(guān)系，miR-374a在宮頸癌不同臨床分期中的表達(dá)水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Ⅱ期患者血清中miR-374a的表達(dá)水平高于Ⅰ期患者；在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的相對(duì)表達(dá)水平高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，G2～G3級(jí)宮頸癌患者中miR-374a的表達(dá)水平高于G1級(jí)患者，提示miR-374a可能為一種新的腫瘤標(biāo)志物，并且miR-374a血清水平的高低可能有助于鑒別癌癥患者的臨床分期、病理分級(jí)、是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。由此推測(cè)miR-374a可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，與腫瘤促進(jìn)因子作用相似。但是miR-374a在調(diào)控宮頸癌發(fā)生發(fā)展中具體分子機(jī)制仍不清楚，miR-374a調(diào)控靶基因信號(hào)通路有待于進(jìn)一步研究。