AXL激酶抑制劑對鼻咽癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

程健，張磊，秦克旺

(1南方醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院,廣州510317;2廣東省第二人民醫(yī)院)

鼻咽癌(是一種發(fā)生于鼻咽部黏膜上皮的惡性腫瘤，具有發(fā)病部位解剖結構復雜、病理分化程度低、易發(fā)生轉移等特點。大多數(shù)鼻咽癌患者在首次確診時已有局部淋巴結或遠處轉移[1]。鼻咽癌的主要治療手段是放射治療，但療效欠佳。因此，尋找一種療效顯著、創(chuàng)傷小、不良作用少的治療手段刻不容緩。受體酪氨酸激酶是位于細胞表面的跨膜受體，其介導的信號通路在正常和惡性細胞中均發(fā)揮著重要作用。1991年，O’bryan等[2]在慢性粒細胞白血病細胞中發(fā)現(xiàn)了第一個受體酪氨酸激酶亞家族-TAM(TYRO3-AXL-MER)家族。TAM家族包括TYRO3(又名Rse、Sky、Brt、Dtk、Etk2或Tif)、AXL(又名Ufo、Ark或Tyro7)和MER(又名NYK、EYK或TYRO12)[3～5]，其中AXL基因位于第19號染色體，由20個外顯子組成。近年研究顯示，AXL在多種惡性腫瘤中都存在高表達，如肺癌、乳腺癌、結腸癌、胃癌、肝癌和卵巢癌等。大量研究結果表明，AXL可以促進腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲。由于AXL在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要促進作用，因此以AXL為靶點的抗癌藥物逐漸成為研究熱點。TP0903是一種小分子AXL靶向藥物，由美國亨斯曼癌癥研究所的Mollard等[3]通過分子對接模擬設計合成。盡管AXL激酶抑制劑作為一種新型抗癌藥物得到了眾多研究者的積極探索，但其在鼻咽癌中的作用鮮有報道。2016年9月～2017年10月,本研究應用AXL激酶抑制劑TP0903作用于人類鼻咽癌細胞，觀察其對鼻咽癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響，為鼻咽癌的分子靶向治療提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 鼻咽癌細胞5-8F、SUNE2均購自上海中科院細胞庫，TP0903購自Selleck公司，RPMI1640培養(yǎng)基、0.25%胰酶、胎牛血清購自美國Gbico公司，CCK-8試劑盒購自Sigma公司，6孔板、細胞培養(yǎng)瓶、Transwell小室均購自美國Coming公司，Matrigel基質膠購自美國BD公司。超凈臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)，CO2細胞培養(yǎng)箱(美國SHEL-LAB，型號為 2406-2)，顯微圖像分析系統(tǒng)(丹吉爾集團公司，型號：DEIAS-2000C)，酶標儀(芬蘭Labsystem公司，型號:Multiskan MK3)。

1.2 細胞培養(yǎng) 鼻咽癌5-8F、SUNE2細胞均用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置于恒溫37 ℃、5% CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換1次液，當細胞密度達80%左右時傳代，取對數(shù)生長期細胞進行試驗。

1.3 鼻咽癌細胞增殖能力的檢測 6孔板預試驗：取對數(shù)生長期鼻咽癌5-8F、SUNE2細胞，分別計數(shù)，然后按照每孔2.5×105細胞數(shù)量加入到6孔板中，按照預先設計好的實驗方案分為對照組和實驗組。24 h后向6孔板中加入不同濃度梯度的TP0903，對照組未加入TP0903(即所用的TP0903藥物濃度用0 μmol/L來表示，下同)，實驗組所用TP0903藥物濃度分別為0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 μmol/L進行處理；48 h后用甲醇固定，再用結晶紫染色。待染色結束后，通過觀察染色深淺的程度來判斷細胞密度，從而得到TP0903對鼻咽癌細胞的有效抑制濃度。CCK-8試驗：分別消化鼻咽癌細胞5-8F、SUNE2，計數(shù)后,按每孔5 000個細胞接種于96孔板，待細胞貼壁后加入TP0903，分為對照組(0 μmol/L TP0903)和實驗組。根據(jù)6孔板的實驗結果，鼻咽癌細胞SUNE2對TP0903比細胞5-8F更為敏感。所以在實驗組中，選用0.5、1.0、2.0、4.0 μmol/LTP0903作用于鼻咽癌細胞5-8F；同時選用0.125、0.25、0.5 μmol/L TP0903作用于鼻咽癌細胞SUNE2。每組設置5個復孔。TP0903分別培養(yǎng)24、48、72 h后，向培養(yǎng)板中每孔加入CCK-8液10 μL，避光孵育2 h后使用多功能酶標儀檢測450 nm波長的吸光度(A)值，計算細胞存活率，計算公式為：存活率(空白)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(0加藥)-A(空白)]。A(加藥):具有細胞、CCK溶液和藥物溶液的孔的吸光度；A(空白)：只有溶液而沒有細胞的孔的吸光度；A(0加藥)：具有細胞、CCK溶液而沒有藥物的孔的吸光度。重復操作此實驗3次。

1.4 鼻咽癌細胞遷移能力檢測 劃痕試驗：取生長良好的5-8F、SUNE2細胞，分別以每孔5×105個細胞接種于6孔板中，直至細胞長至飽和狀態(tài)后，吸去上層培養(yǎng)液，PBS緩沖液洗滌2次，用無菌Tip頭在細胞板上劃痕，再用PBS緩沖液洗滌3次。向每孔加入含1.5%胎牛血清培養(yǎng)基，并向每孔中加入TP0903。分為對照組(0 μmol/L)和實驗組(藥物濃度為0.25、0.5 μmol/L)，分別于0、24 h在倒置顯微鏡下獲取圖像后用Image J 2x軟件統(tǒng)計各組劃痕寬度。結果以劃痕寬度百分比(%)表示，劃痕寬度百分比(%)=(24 h的劃痕寬度/0 h劃痕寬度)×100%。重復操作此實驗3次。Transwell小室趨化試驗：取生長良好的鼻咽癌細胞，消化、計數(shù)后，分別以5×104個細胞接種于Transwell小室的上室，并向上室中加入TP0903，分為對照組(0 μmol/L TP0903)和實驗組(藥物濃度為0.25、0.5 μmol/L)。然后加入無血清的1640培養(yǎng)基200 μL。在下室中加入與上室含有相同濃度梯度的TP0903，然后加入含10%胎牛血清1640完全培養(yǎng)基600 μL。培養(yǎng)箱孵育24 h后，取出小室，用棉簽擦去上室濾膜上未穿過的細胞，以中性甲醛固定，結晶紫染色，洗滌，待其干燥后，將小室倒置在100倍光鏡下隨機選擇中央及四周8個視野計數(shù)細胞數(shù)，統(tǒng)計后取其均值，重復操作此實驗3次。

1.5 鼻咽癌細胞侵襲能力的檢測 采用Transwell小室侵襲試驗。實驗前在Transwell濾膜上室面包被人工基底膜膠，取生長良好的鼻咽癌細胞，消化、計數(shù)后，分別以5×104個細胞接種于Transwell小室的上室，對照組不加入TP0903，實驗組向上室中加入TP0903(藥物濃度為0.25、0.5 μmol/L)。然后加入無血清的1640培養(yǎng)基200 μL。實驗組在下室中加入與上室相同濃度梯度的TP0903，然后加入含10%胎牛血清1640完全培養(yǎng)基600 μL。培養(yǎng)箱孵育24 h后，取出小室，用棉簽擦去上室濾膜上未穿過的細胞，中性甲醛固定，結晶紫染色，洗滌，干燥后，小室倒置在100倍的光鏡下隨機選擇中央及四周8個視野計數(shù)細胞數(shù)，取其均值，實驗重復3次。

2 結果

2.1 兩組鼻咽癌細胞5-8F、SUNE2增殖能力比較 6孔板預試驗結果顯示，隨著濃度梯度的不斷增大，細胞密度逐漸降低;且相同濃度的TP0903對鼻咽癌細胞SUNE2的抑制作用更強。CCK-8試驗結果證實了TP0903對鼻咽癌細胞的增殖能力有抑制作用，且藥物作用濃度越大，細胞存活率越低。鼻咽癌細胞5-8F:實驗組中0.5、1.0、2.0、4.0 μmol/L TP0903作用后細胞存活率分別為95.72%±3.12%、81.02%±9.38%、64.99%±12.17%、55.92%±12.91%。對照組為1。與對照組比較，1.0、2.0、4.0 μmol/L TP0903作用后，細胞存活率均降低，且兩兩比較，P均<0.05。鼻咽癌細胞SUNE2：實驗組中0.125、0.25、0.5 μmol/L TP0903作用后，細胞存活率分別為88.46%±11.90%、85.68%±7.20%、28.00%±16.91%，對照組為1。與對照組比較，4.0 μmol/L TP0903作用后，細胞存活率降低(P<0.05)。

2.2 兩組鼻咽癌細胞5-8F、SUNE2的遷移能力比較 劃痕試驗結果顯示，實驗組鼻咽癌細胞的遷移距離較對照組縮短(P均﹤0.05)。見表1。Transwell小室趨化試驗結果顯示，與對照組比較，實驗組穿過Transwell小室的細胞數(shù)均減少，以0.5 μmol/L TP0903處理為著(P均﹤0.05)。見表2。

表1 兩組鼻咽癌細胞5-8F、SUNE2遷移能力比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

表2 鼻咽癌細胞5-8F、SUNE2的遷移數(shù)量比較(個，

注：與對照組比較，*P<0.01；與0.25 μmol/L比較，#P<0.05。

2.3 兩組鼻咽癌細胞5-8F、SUNE2侵襲能力比較 Transwell小室侵襲試驗結果顯示，TP0903處理鼻咽癌細胞后，實驗組和對照組相比，實驗組穿過Transwell小室的細胞數(shù)量減少，以0.5 μmol/L TP0903處理為著(P均﹤0.05)。見表3。

3 討論

近年腫瘤的分子靶向治療取得了空前進步。AXL作為多種惡性腫瘤的新靶點引起學術界廣泛關注。大量研究報道，AXL在多種惡性腫瘤組織及細胞中存在高表達，其表達量與腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力密切相關。Gay等[4]在人類乳腺癌中的研究結果顯示，AXL能夠通過增強內皮細胞的增殖和遷移能力來促進乳腺癌腫瘤性血管的生成，進而引起腫瘤細胞不斷生長和惡性轉化。Koorstra等[5]研究發(fā)現(xiàn)，AXL的表達影響了胰腺癌患者的預后，AXL陽性表達者生存率低于陰性表達者。上皮-間質轉化(EMT)是指上皮細胞在某些特定條件下，獲得了游走遷移能力和浸潤性，轉化為具有間質樣表型細胞的生物學過程，是腫瘤細胞發(fā)生增殖、遷徙、轉移等過程中的重要生物學行為。近期研究報道，AXL過表達與腫瘤細胞的間質樣表型密切相關，其可通過誘導多種腫瘤細胞的EMT途徑來增強腫瘤細胞的侵襲能力，增加轉移概率，并產生耐藥性，嚴重影響患者預后。Wu等[6]在非小細胞肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，過表達的AXL可以調節(jié)E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白的表達量，誘導EMT過程的發(fā)生，從而促進腫瘤細胞的遷移。Lee等[7]在口腔鱗癌細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，AXL可通過磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路介導EMT過程的發(fā)生。此外，Lee等[8]研究發(fā)現(xiàn)，AXL可通過細胞內絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節(jié)激酶信號通路誘導肝癌細胞EMT過程的發(fā)生，進而增強細胞的轉移和侵襲能力；抑制AXL的表達，肝癌細胞的轉移和侵襲能力也隨之減弱。提示AXL與EMT過程的發(fā)生有密切關聯(lián)。

表3 兩組鼻咽癌細胞5-8F、SUNE2的侵襲能力比較( 個，

注：與對照組比較，*P<0.01；與0.25 μmol/L比較，#P<0.05。

本研究通過6孔板試驗和CCK-8試驗證實，AXL抑制劑TP0903能夠抑制鼻咽癌細胞增殖；與此同時，細胞劃痕試驗和Transwell小室遷移試驗結果表明TP0903抑制劑能夠降低腫瘤細胞的遷移能力。進一步，5-8F與SUNE2細胞系在加入TP0903共孵育24 h后，Transwell小室侵襲能力明顯降低，提示腫瘤細胞入侵能力下降。以上實驗結果表明，AXL抑制劑TP0903對鼻咽癌細胞增殖、遷移和侵襲能力有明顯的抑制作用，且抑制效果與濃度呈正比。結合既往報道中AXL與EMT過程密切關聯(lián)，推測其作用機制可能與AXL激酶抑制劑抑制了鼻咽癌細胞的EMT路徑有關。

本研究結果表明，TP0903能夠抑制鼻咽癌-8F和SUNE2細胞系的增殖、遷移及侵襲能力，為鼻咽癌的分子靶向治療提供了基礎理論支持；但AXL激酶抑制劑究竟是如何影響鼻咽癌細胞的增殖、遷移、侵襲的能力，其具體信號通路及作用機制還有待進一步探討。