骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物研究進(jìn)展

崔國寧，劉喜平，曾慶濤

（甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅蘭州730000）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）具有多向分化潛能［1］，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)通過提高外周血中的MSCs數(shù)量，可影響體內(nèi)微環(huán)境的改變而對損傷的炎癥組織有修復(fù)和重建作用［2-4］。但是，外周血骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞由于數(shù)量極少，很難檢測到［5］?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用某些技術(shù)可通過檢測相應(yīng)的標(biāo)記物來確認(rèn)為MSCs，現(xiàn)將研究進(jìn)展綜述如下。

1 MSCs標(biāo)記及相應(yīng)指標(biāo)

堿性成纖維生長因子（bFGF）具有諸多生物學(xué)效能，是形成心血管的特異性促進(jìn)因子，可以調(diào)控MSCs增殖與定向的分化［6］。目前研究與MSCs相關(guān)的指標(biāo)有bFGF、SRY基因、生物素-鏈霉親和素、5-溴脫氧尿嘧啶核苷、CM-DiL、Hoechst33342、SRY基因、Y染色體及CK20雙陽性細(xì)胞的分布等?？梢詷?biāo)記MSCs的技術(shù)有慢病毒載體介導(dǎo)的GFP轉(zhuǎn)染技術(shù)、DAPI標(biāo)記法等。

王彥生等［7］用RT-PCR和ELASE法檢測MSCs的bFGF基因陽性表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)能將外源性bFGF轉(zhuǎn)染至MSCs，并實現(xiàn)bFGF基因的表達(dá)。bFGF對創(chuàng)傷的修復(fù)具有明顯的促進(jìn)作用，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)可將bFGF基因成功轉(zhuǎn)染兔MSCs獲得穩(wěn)定表達(dá)，通過流式檢測 CD90、CD44 陽性表達(dá)，CD45 陰性表達(dá)［8］，說明bFGF基因表達(dá)情況可作為MSCs功能的反映。有研究示利用生物素-鏈霉親和素進(jìn)行MSCs標(biāo)記，MSCs表達(dá) CD29、CD90，不表達(dá) CD34、CD45，運用這種方法進(jìn)行標(biāo)記，操作簡單，修改率高，有望提高 MSCs的歸巢率，具有重要的價值［9］。朱峰等［10］用5-溴脫氧尿嘧啶核苷在體外標(biāo)記MSCs，其標(biāo)記最佳濃度及時間分別為 40 μmol/L，72 h；用CM-DiL標(biāo)記MSCs，其不僅能成功標(biāo)記而且具有標(biāo)記穩(wěn)定、可靠、表達(dá)率高、簡便等優(yōu)點［11］。Hoechst33342也可用于大鼠MSCs標(biāo)記，其最佳濃度為5 mg/L，細(xì)胞表型鑒定CD45陰性表達(dá)，CD44、CD90陽性表達(dá)［12］。對于MSCs在體內(nèi)示蹤研究，有研究采用慢病毒載體介導(dǎo)GFP轉(zhuǎn)染技術(shù)和應(yīng)用PCR檢測SRY 基因可追蹤移植的 MSCs［13］。

通過觀察其他細(xì)胞因子的變化，也可反映MSCs的情況，如張夏夢等［14］研究示通過觀察結(jié)腸組織Y染色體、CK20雙陽性細(xì)胞的分布，可以反映MSCs的分布情況。通過DAPI標(biāo)記也可反映MSCs在體內(nèi)的分布，朱勇等［15］通過研究SD大鼠MSCs在體外培養(yǎng)的表型鑒定及標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，貼壁培養(yǎng)法可作為SD大鼠MSCs常規(guī)培養(yǎng)法，用DAPI進(jìn)行標(biāo)記后，熒光下所有的MSCs均見藍(lán)色熒光，其敏感性好，標(biāo)記率高。趙科研等［16］研究示DAPI可良好標(biāo)記MSCs細(xì)胞核，呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，提示DAPI可作為MSCs示蹤劑。由此可看出，應(yīng)用于MSCs標(biāo)記的物質(zhì)很多（但沒有唯一的表面標(biāo)記物），通過監(jiān)測與其相關(guān)的基因的表達(dá)及其標(biāo)記物特征可反映MSCs在體內(nèi)的分布情況。

2 與MSCs相關(guān)的CD分子表達(dá)

CD分子作為MSCs表面標(biāo)記物已經(jīng)被基礎(chǔ)研究廣泛應(yīng)用，目前被大多數(shù)學(xué)者認(rèn)可的陽性表面標(biāo)記物為 CD44、CD90、CD29、CD105 等。有研究取3代細(xì)胞用流式細(xì)胞術(shù)檢測MSCs表面標(biāo)記物，CD34、CD44、CD45、CD90 陽性率分別為0.78%、99.38%、0.43%、98.78%［17］。李榮富等［18］用流式細(xì)胞術(shù)檢測MSCs細(xì)胞表面抗原的表達(dá)率，發(fā)現(xiàn)CD44和CD90表達(dá)率＞98%，而CD45、CD34表達(dá)率＜1%，符合MSCs表面抗原表達(dá)特征。王剛等［19］用細(xì)胞免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)P2代細(xì)胞表面分子CD44、FN表達(dá)為陽性（CD44、FN陽性率分別為92.09%、90.55%），而CD14、CD34為陰性。對于 CD34的檢測，張夏夢等［20］研究示MSCs組在連續(xù)切片后，在結(jié)腸組織可見到Y(jié)染色體、CD34雙陽性細(xì)胞，說明CD34作為MSCs表面標(biāo)記物是陽性表達(dá)。程斌等［21］通過改良法提取MSCs，流式檢測其表面標(biāo)記CD29、CD44陽性表達(dá)、CD45陰性表達(dá)即可鑒定為MSCs。李曉峰等［22］采用全骨髓貼壁法進(jìn)行MSCs培養(yǎng)及鑒定，取第3代MSCs進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)CD90、CD105呈陽性表達(dá)，CD34、CD45呈陰性表達(dá)。采用同樣的方法，曹華等［23］研究示其可獲得穩(wěn)定生長、增殖能力強的MSCs，MSCs表面的CD34呈陰性，CD44呈陽性表達(dá)?？迪嫫嫉龋?4］研究發(fā)現(xiàn)全骨髓貼壁法可培養(yǎng)獲得高純度的MSCs，培養(yǎng)第3代MSCs表面表達(dá) CD90、CD29，不表達(dá) CD34、CD45。易敏等［25］通過對兔MSCs進(jìn)行分離培養(yǎng)及鑒定，發(fā)現(xiàn)骨髓貼壁法是一種簡便經(jīng)濟的培養(yǎng)方式，通過鑒定發(fā)現(xiàn)CD44高表達(dá)，CD14、CD45低表達(dá)。宋珂等［26］對大鼠MSCs進(jìn)行分離培養(yǎng)與鑒定后檢測其內(nèi)源性因子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)從P1代至P5代均有內(nèi)源性 bFGF、Shh、Cbfa1、ALP、OC 表達(dá)，MSCs細(xì)胞表面表達(dá)CD29及CD90，不表達(dá)CD45。青瑩等［27］對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hUCMSCs）進(jìn)行培養(yǎng)及鑒定發(fā)現(xiàn)，第 3代 hUCMSCs表面 CD29、CD44、CD105、CD45、CD34表達(dá)率分別為 99.04%、98.8%、85.09%、0.19%、0.58%，通過檢測內(nèi)源性Hh信號通路中主要因子表達(dá)，Shh水平相對較高。徐艷華等［28］發(fā)現(xiàn)MSCs生長迅速，呈均一的成纖維樣細(xì)胞，表達(dá) CD29、CD90、不表達(dá) CD45。

另外，在腫瘤環(huán)境的影響下，MSCs表面標(biāo)記物并不是那么絕對，如CD166在正常胃黏膜、腺瘤及腺癌組織中存在表達(dá)，CD271在正常胃黏膜、腺瘤及腺癌組織中幾乎不表達(dá)，不能作為胃癌腫瘤細(xì)胞的特異性標(biāo)記［29］。而在結(jié)腸癌微環(huán)境與MSCs共培養(yǎng)的研究中發(fā)現(xiàn)其可誘導(dǎo)MSCs向結(jié)腸癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，MSCs表面標(biāo)記物CD13、CD133表達(dá)率分別為 89.7%，90.5%［30］。

由此可發(fā)現(xiàn)應(yīng)用CD分子的陽性表達(dá)來對MSCs標(biāo)記已經(jīng)取得重大成就，但是MSCs具有非單一性特點，具有多種表面標(biāo)志物，當(dāng)前尚沒有篩選出其獨特的MSCs表面標(biāo)志分子，以此來作為MSCs的專屬鑒定，這為MSCs之鑒定帶來一定阻力。另外，在腫瘤微環(huán)境干預(yù)下，研究發(fā)現(xiàn)CD166、CD271不能作為腫瘤細(xì)胞的特異性標(biāo)記。再者，當(dāng)前研究的MSCs表面CD分子中，CD34到底是陽性表達(dá)還是陰性表達(dá)，尚存在爭議，有待基礎(chǔ)驗證。反映MSCs的表面標(biāo)記物、基因、CD分子等如表1所示。

3 結(jié) 語

MSCs是近年來研究的熱點，其在體內(nèi)向骨髓細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及軟骨細(xì)胞等多方向分化，這為我們治療各種難治性疾病帶來了希望。正因為其具有多向分化性，所以到目前為止仍舊未篩選出其獨特的表面標(biāo)記物。當(dāng)前研究比較成熟的是MSCs內(nèi)基因表達(dá)的檢測以及MSCs表面分子的檢測，通過已知，可以幫助我們更好把握MSCs相關(guān)功能及其移植治療作用的發(fā)揮。

表1 MSCs表面標(biāo)記物及反映MSCs的基因、CD分子

近年隨著干細(xì)胞研究的不斷深入，干細(xì)胞逐漸被應(yīng)用于各種難治性疾病的治療。實驗中關(guān)于MSCs鑒定所采用最低標(biāo)準(zhǔn)是：標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)條件下，MSCs能夠貼壁成梭形生長；MSCs能表達(dá)CD90、CD44、CD29，不表達(dá) CD45、CD34、CD14 或者 CD79alpha、CD11b、HLA-DR 等［31］。本文總結(jié)了與MSCs有關(guān)的表面標(biāo)記物、反映MSCs的基因及目前廣泛應(yīng)用的CD分子標(biāo)記等，可幫助我們把握MSCs的相關(guān)功能。另外，慢病毒載體介導(dǎo)的GFP轉(zhuǎn)染技術(shù)、DAPI標(biāo)記等技術(shù)可以對MSCs進(jìn)行輔助標(biāo)記，以示蹤MSCs在體內(nèi)的分布情況，當(dāng)有熒光到達(dá)的地方，可能就是我們示蹤的MSCs。當(dāng)前研究為我們進(jìn)一步探討MSCs奠定了堅實基礎(chǔ)，干細(xì)胞的深入研究為組織工程學(xué)中組織器官的修復(fù)、替代開辟了一條嶄新的治療思路，進(jìn)一步探求與MSCs密切相關(guān)的標(biāo)記物成為我們研究MSCs要解決的重點問題。