嬰幼兒乳粉和保健食品中肉堿對(duì)映體的拆分及HPLC測(cè)定

斯菲菲 朱丹丹 黃渭

1.杭州立高檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)有限公司 浙江杭州 310053 2.杭州千島湖康諾邦健康產(chǎn)品有限公司 浙江杭州 311705 3.杭州協(xié)合醫(yī)療用品有限公司 浙江杭州 310002

L-肉堿與D-肉堿是兩種形式不同的肉堿立體對(duì)映異構(gòu)體，前者具有良好的生物活性，后者則能抑制線粒體內(nèi)的能量形成及脂肪酸氧化，并引起心肌和骨骼肌中的L-肉堿功能性損耗，從而易導(dǎo)致人體出現(xiàn)肌肉無(wú)力和心律失常等，并且，其還會(huì)降低人體的運(yùn)動(dòng)耐力，可見(jiàn)，D-肉堿對(duì)人體的生化過(guò)程會(huì)產(chǎn)生較多的毒副作用，基于此，就有必要對(duì)嬰幼兒乳粉和保健食品中肉堿對(duì)映體進(jìn)行測(cè)定，才能促進(jìn)其更好的生長(zhǎng)發(fā)育，免受D-肉堿的侵害[1]。

1 實(shí)驗(yàn)儀器及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

實(shí)驗(yàn)儀器：安捷倫1260熒光檢測(cè)器、安捷倫1260高效液相色譜儀、紫外檢測(cè)器、恒溫水浴箱、電子天平(精確度為萬(wàn)分之一)、超聲脫氣機(jī)、電子天平、0.45μm微孔濾膜、移液槍。實(shí)驗(yàn)試劑：D-肉堿內(nèi)鹽、L-肉堿標(biāo)準(zhǔn)品、三乙胺、磷酸、乙腈、碳酸氫鈉、無(wú)水碳酸鈉、鹽酸、1-(9-芴基)-氯甲酸乙酯、四氫呋喃、甲醇、無(wú)水乙醇。

1.2 方法

乳粉測(cè)定方法：將15g奶粉樣品置入30mL去離子水中溶解，并放入50°C水中進(jìn)行15分鐘水浴，再用超聲波處理10分鐘，將獲取的樣品試劑與0.1mol/L鹽酸溶液混合均勻，靜置10分鐘后用自然濾紙過(guò)濾，用去離子水洗滌濾渣，然后，用1mol/L碳酸氫鈉溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)，至PH為6左右。完成上述樣品預(yù)處理后，用10mL容量瓶取60μL樣品溶液，并加入30μL碳酸緩沖液及1-（9-芴基）-氯甲酸乙酯試劑，再將容量瓶塞塞上并緩慢旋轉(zhuǎn)，然后，將容量瓶放置在45°水浴中浸泡1小時(shí)取出，待樣品溶液冷卻至室溫后，用去離子水將此溶液定容至10mL，再用0.45μm微孔濾膜加壓過(guò)濾，最后對(duì)制備的樣品溶液進(jìn)行HPLC紫外檢測(cè)。

保健食品測(cè)定方法：稱取5g保健食品樣品，用無(wú)水乙醇溶解，再置于100mL容量瓶中，用超聲波處理10分鐘后，再用無(wú)水乙醇定容至100mL，采用3000r/min離心機(jī)對(duì)樣品溶液離心10min，取0.5mL上清液進(jìn)行衍生化反應(yīng)。將0.5mLD/L肉堿標(biāo)準(zhǔn)液移取至具塞試管中，再依次將0.5mL5g/L三乙胺三氯甲烷溶液、0.5mL2g/L氯甲酸乙酯三氯甲烷溶液及0.5mL4.5g/LL-Ala-β-NA乙醇溶液加入到試管中，混合均勻后將其放置在35°水浴鍋內(nèi)1小時(shí)，取出后，再加入50mmol/L碳酸氫鈉水溶液，作離心處理后，將上層水轉(zhuǎn)移至帶刻度試管中，用碳酸氫鈉溶液定容，并用0.45μm微孔濾膜加壓過(guò)濾，最后進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 乳粉樣品中肉堿對(duì)映體的檢測(cè)情況

通過(guò)分析樣品的衍生溶液色譜分析圖可知，L-肉堿和D-肉堿衍生物峰的保留時(shí)間分別為28min、25min。為證實(shí)檢測(cè)方法的實(shí)用性和有效性，筆者根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)方法對(duì)三種市售嬰幼兒乳粉(貝因美嬰兒乳粉、雀巢全脂甜奶粉、多美滋多學(xué)一加奶粉)進(jìn)行了檢測(cè)，經(jīng)檢測(cè)，三種乳粉中均檢測(cè)出L-肉堿，含量分別為28.5、12.9、29.0（mg/100g），其中，貝因美和多美滋乳粉中的L-肉堿含量均符合營(yíng)養(yǎng)標(biāo)簽的標(biāo)識(shí)值（≥10mg/100g）,三種乳粉中均未檢測(cè)出D-肉堿，說(shuō)明本次檢測(cè)的三種市售嬰幼兒乳粉均符合嬰幼兒乳粉食用標(biāo)準(zhǔn)要求。

2.2 保健食品中肉堿對(duì)映體的檢測(cè)情況

為驗(yàn)證檢驗(yàn)方法的實(shí)用性和有效性，并突出衍生化反應(yīng)條件及色譜條件對(duì)檢測(cè)方法的應(yīng)用，筆者分析采用HPLC-UV法對(duì)10種嬰幼兒保健食品進(jìn)行檢測(cè)，保健食品的進(jìn)樣量均為10μL，經(jīng)檢測(cè)，10種保健食品中L-肉堿含量分別為10.9、10.6、6.4、25.0、16.6、12.2、8.1、20.8、-、-（g/100g），其中 - 代表未檢測(cè)到 L- 肉堿，10種保健食品中均未發(fā)現(xiàn)D-肉堿，說(shuō)明檢測(cè)的10種保健食品均符合嬰幼兒保健品要求。

3 討論

L-肉堿與D-肉堿是兩種形式不同的肉堿立體對(duì)映異構(gòu)體，其中，L-肉堿（左旋肉堿）因具有良好的營(yíng)養(yǎng)保健功效，因此，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用作為嬰幼兒配方食品的營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，而D-肉堿（右旋肉堿）已被證實(shí)對(duì)人體有害，而在實(shí)際提取含肉堿的工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中，若對(duì)L-肉堿提純不凈，便會(huì)導(dǎo)致D-肉堿存在食物或人們食用的食品中，從而對(duì)人體的健康安全構(gòu)成一定的威脅，因此，需積極探尋有效的方法測(cè)定肉堿對(duì)映體的含量[2]。

目前，醫(yī)學(xué)臨床常采用HPLC法對(duì)肉堿含量進(jìn)行測(cè)定，該種檢測(cè)方法具有操作簡(jiǎn)便、可靠性和靈敏度高等特點(diǎn)，能夠快速檢測(cè)和篩選出人體或食品中是否缺乏肉堿，但是，采用HPLC直接分析法不具有立體異構(gòu)特異性。

本研究中，通過(guò)對(duì)三種市售嬰幼兒乳粉（貝因美嬰兒乳粉、雀巢全脂甜奶粉、多美滋多學(xué)一加奶粉）進(jìn)行了檢測(cè)，經(jīng)檢測(cè)，三種乳粉中均檢測(cè)出L-肉堿，未檢測(cè)出D-肉堿，說(shuō)明本次檢測(cè)的三種市售嬰幼兒乳粉均符合嬰幼兒乳粉食用標(biāo)準(zhǔn)要求。通過(guò)采用HPLC-UV法對(duì)10種嬰幼兒保健食品檢測(cè)，均未發(fā)現(xiàn)D-肉堿，說(shuō)明檢測(cè)的10種保健食品均符合嬰幼兒保健品要求，說(shuō)明HPLC測(cè)定方法能有效拆分L-肉堿與D-肉堿，并分別檢測(cè)其含量，從而為嬰幼兒食品安全檢測(cè)提供有效的參考。