百草枯所致肺纖維化患者Ⅱ型肺泡表面抗原6粘糖蛋白與肺泡表面活性蛋白A、D及白介素6的相關(guān)性研究

王 英，劉 敏，于波濤，王敬東

百草枯是一種非選擇性接觸型除草劑，因其除草效能高而在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中普遍應(yīng)用。百草枯進(jìn)入人體后可迅速進(jìn)入各循環(huán)系統(tǒng)并對(duì)多種器官造成不同程度損傷［1-2］。肺部是百草枯主要靶器官之一，而肺泡上皮細(xì)胞可攝取大量百草枯并蓄積在肺組織，因此肺組織中百草枯濃度是血液的數(shù)十倍以上［3］。研究表明，百草枯可通過誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞及肺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞并導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)沉積，造成肺泡壁厚度增加并對(duì)肺泡結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，最終引發(fā)肺纖維化［4-5］。目前，臨床上主要采用免疫抑制劑及抗氧化劑治療百草枯所致肺纖維化，但整體治療效果較差［6-8］，因此積極尋找新的治療靶點(diǎn)以提高百草枯所致肺纖維化患者治愈率具有重要臨床意義。本研究旨在探討百草枯所致肺纖維化患者Ⅱ型肺泡表面抗原6（KL-6）粘糖蛋白與肺泡表面活性蛋白A（SP-A）、肺泡表面活性蛋白D（SP-D）及白介素6（IL-6）的相關(guān)性，為百草枯所致肺纖維化患者治療靶點(diǎn)研究提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) 百草枯所致肺纖維化患者早期（3 d～1周）主要表現(xiàn)為肺紋理增多，肺野毛玻璃樣改變甚至雙肺廣泛高密度影，“白肺”形成，肺實(shí)質(zhì)改變或小囊腫等；中期（1～2周）主要表現(xiàn)為肺大片實(shí)變，肺泡結(jié)節(jié)及部分肺纖維化；后期（2周后）主要表現(xiàn)為局限性或彌漫性網(wǎng)狀纖維化、低氧血癥。

1.2 一般資料 選取2016年6月—2017年2月青島市中心醫(yī)院收治的百草枯所致肺纖維化患者65例作為觀察組，排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）存在免疫缺陷性疾病者；（2）存在惡性腫瘤者；（3）中毒至入院時(shí)間＞2 h者；（4）既往有肺、肝、腎等臟器疾病者；（5）臨床資料不完整者；（6）合并其他藥物中毒者；（7）入組前服用過免疫抑制劑、免疫增強(qiáng)劑者。另選取同期在青島市中心醫(yī)院體檢健康志愿者30例作為對(duì)照組。兩組患者性別、年齡、體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見表1），具有可比性。本研究經(jīng)青島市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過，所有受試者或其家屬簽署知情同意書。

表1 兩組患者一般資料比較Table1 Comparison of general information between the two groups

1.3 方法

1.3.1 血清KL-6粘糖蛋白水平檢測(cè)方法 抽取兩組受試者清晨空腹靜脈血3 ml，4 000 r/min離心10 min（離心半徑13 cm），留取上清液1 ml并置于-20 ℃冰箱保存待測(cè)；采用化學(xué)發(fā)光酶免疫檢測(cè)法檢測(cè)血清KL-6粘糖蛋白水平，具體如下：將稀釋后血清標(biāo)本及KL-6粘糖蛋白校準(zhǔn)液分注入含KL-6抗體的抗體結(jié)合粒子溶液（250 μl），混勻后37 ℃孵育10 min，去除反應(yīng)液、洗凈后加入堿性磷酸酶標(biāo)記抗體250 μl，37 ℃孵育10 min，再次去除反應(yīng)液、洗凈后加入底物200 μl，混勻后37 ℃反應(yīng)5 min，測(cè)定波長477 nm處發(fā)光強(qiáng)度最大條帶即為血清KL-6粘糖蛋白水平。KL-6粘糖蛋白試劑盒購自富士瑞必歐株式會(huì)社并嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，所用儀器為LUMI PULSE G1200全自動(dòng)免疫分析儀，并設(shè)置復(fù)孔取均值。

1.3.2 血清SP-A、SP-D、IL-6水平檢測(cè)方法 抽取兩組受試者清晨空腹靜脈血3 ml，3 500 r/min離心10 min（離心半徑13 cm），留取上清液1 ml并置于-80 ℃冰箱保存待測(cè)；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清SP-A、SP-D、IL-6水平，具體如下：首先將抗人SP-A抗體包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品或血清標(biāo)本中SP-A與包被抗體結(jié)合后洗去游離成分，按順序加入生物素化的抗人SP-A抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素，抗人SP-A抗體與結(jié)合在包被抗體上的人SP-A結(jié)合后形成免疫復(fù)合物，洗去游離成分并加入顯色底物，在辣根過氧化物酶的催化下顯色底物變?yōu)樗{(lán)色，加入終止液后顯色底物變?yōu)辄S色，采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長處光密度（OD）值并通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清SP-A水平。血清SP-D、IL-6水平檢測(cè)原理、步驟及計(jì)算方法同血清SP-A水平，試劑盒均購自伊萊瑞特生物科技有限公司并嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料分析采用χ2檢驗(yàn)；百草枯所致肺纖維化患者血清KL-6粘糖蛋白水平與血清SP-A、SP-D、IL-6水平的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清KL-6粘糖蛋白、SP-A、SP-D、IL-6水平觀察組患者血清KL-6粘糖蛋白、SP-A、SP-D、IL-6水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

2.2 相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，百草枯所致肺纖維化患者血清KL-6粘糖蛋白水平與血清SP-A（r=0.573）、SP-D（r=0.466）、IL-6（r=0.521）水平均呈正相關(guān)（P＜0.05）。

表2 兩組受試者血清KL-6粘糖蛋白、SP-A、SP-D、IL-6水平比較Table2 Comparison of serum levels of KL-6 mucoprotein，SP-A，SP-D and IL-6 between the two groups

表2 兩組受試者血清KL-6粘糖蛋白、SP-A、SP-D、IL-6水平比較Table2 Comparison of serum levels of KL-6 mucoprotein，SP-A，SP-D and IL-6 between the two groups

注：KL-6=Ⅱ型肺泡表面抗原6，SP-A=肺泡表面活性蛋白A，SP-D=肺泡表面活性蛋白D，IL-6=白介素6

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3 討論

百草枯中毒可累及多個(gè)臟器，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征（MODS）。肺臟是百草枯主要靶器官之一，百草枯中毒后可形成“百草枯肺”，早期表現(xiàn)為急性肺損傷（ALI）或急性呼吸窘迫綜合征（ARDS），后期則出現(xiàn)肺泡內(nèi)和肺間質(zhì)纖維化，而百草枯所致肺纖維化患者病死率為50%～70%［9-10］。肺出血、水腫、肺部間質(zhì)炎癥、膠原合成及成纖維細(xì)胞增殖是百草枯所致肺纖維化的主要病理特征［11］，但目前百草枯導(dǎo)致肺纖維化的具體機(jī)制尚不完全明確，氧自由基造成的直接損傷及成纖維細(xì)胞、炎性細(xì)胞造成的間接損傷可能是百草枯導(dǎo)致肺纖維化的主要原因［12］。

KL-6粘糖蛋白分子量較大，是黏蛋白1（MUC1）家族成員之一［13］。KL-6粘糖蛋白主要在Ⅱ型肺泡上皮、胰腺及乳腺導(dǎo)管組織中表達(dá)，其中Ⅱ型肺泡上皮中KL-6粘糖蛋白表達(dá)水平較高。研究表明，KL-6粘糖蛋白可促進(jìn)成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ并誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，促進(jìn)α平滑肌肌動(dòng)蛋白生成及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變，誘導(dǎo)大量細(xì)胞外基質(zhì)成分產(chǎn)生［14-15］；KL-6粘糖蛋白對(duì)特發(fā)性肺纖維化有一定診斷價(jià)值并可在一定程度上判斷疾病的嚴(yán)重程度［16］，但目前關(guān)于百草枯中毒所致肺纖維化患者KL-6粘糖蛋白的臨床意義研究較少見。本研究結(jié)果顯示，觀察組患者血清KL-6粘糖蛋白水平高于對(duì)照組，提示血清KL-6粘糖蛋白水平可作為診斷百草枯所致肺纖維的參考指標(biāo)，分析百草枯所致肺纖維化患者血清KL-6粘糖蛋白水平升高機(jī)制如下：百草枯中毒導(dǎo)致基底膜損傷及Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞含量增加，KL-6粘糖蛋白分泌隨之增多并釋放入肺泡襯褶，肺泡襯褶損傷及血管通透性增加導(dǎo)致KL-6粘糖蛋白釋放入血而引起血清中KL-6粘糖蛋白水平升高［17-19］。

肺泡表面活性蛋白屬親水性大分子物質(zhì)，主要來源于肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，包括A、B、D等多種亞型，其中SP-A、SP-D表達(dá)量占該類蛋白總表達(dá)量的一半以上［20］。正常情況下，SP-A、SP-D無法通過肺組織血?dú)馄琳隙M(jìn)入血液循環(huán)，因此健康人血清SP-A、SP-D水平較低。既往研究表明，肺纖維化大鼠血清白介素4（IL-4）及SP-A水平明顯高于正常大鼠，且肺纖維化程度越重，血清IL-4及SP-A水平越高［21-22］；不同階段肺纖維化大鼠血清SP-D水平均高于正常大鼠，且血清SP-D水平隨肺纖維化程度加重而升高［16，22-23］。本研究結(jié)果顯示，觀察組患者血清SP-A、SP-D水平高于對(duì)照組，與上述研究結(jié)果一致，分析其主要原因與肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞分泌肺泡表面活性蛋白增多、肺組織血?dú)馄琳显馄茐亩鴮?dǎo)致SP-A、SP-D進(jìn)入血液循環(huán)有關(guān)。

有研究表明，百草枯進(jìn)入體內(nèi)后可通過脂質(zhì)過氧化物損傷組織細(xì)胞并引發(fā)應(yīng)激反應(yīng)，刺激白介素1（IL-1）、IL-6及腫瘤壞死因子α等炎性遞質(zhì)大量釋放，繼而導(dǎo)致巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等浸潤、聚集并進(jìn)一步促進(jìn)炎性遞質(zhì)及細(xì)胞因子釋放，造成組織損傷加重［24-26］。IL-6主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞及單核細(xì)胞分泌產(chǎn)生，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，血清IL-6水平升高不僅會(huì)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞造成直接損傷，還可能催化、放大炎性反應(yīng)并進(jìn)一步加重血管內(nèi)皮細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，觀察組患者血清IL-6水平高于對(duì)照組，分析原因可能與百草枯導(dǎo)致肺纖維化過程中大量增生的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞分泌大量IL-6有關(guān)［27-28］。本研究結(jié)果還顯示，百草枯所致肺纖維化患者血清KL-6粘糖蛋白水平與血清SP-A、SP-D、IL-6水平均呈正相關(guān)，提示KL-6粘糖蛋白可作為診斷百草枯所致肺纖維化的參考指標(biāo)，這也為百草枯所致肺纖維化的治療提供了新的靶點(diǎn)。

綜上所述，百草枯所致肺纖維化患者血清KL-6粘糖蛋白、SP-A、SP-D、IL-6水平明顯升高，且血清KL-6粘糖蛋白水平與血清SP-A、SP-D、IL-6水平呈正相關(guān)，KL-6粘糖蛋白可作為診斷百草枯所致肺纖維化的參考指標(biāo)及治療靶點(diǎn)；但本研究樣本量較小且觀察指標(biāo)較少，結(jié)果結(jié)論尚需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究證實(shí)。

作者貢獻(xiàn)：王英進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫論文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；劉敏、于波濤進(jìn)行試驗(yàn)實(shí)施、評(píng)估、資料收集；王敬東進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。