疏血通注射液體外抗栓及抗凝作用研究

陳艷明 ，夏 珂 ，何 楊 ，趙赟霄 ，張忠兵 ，江 淼 *，鄭順亮 ，王思瑤 ，周劍波 ，白 芳

疏血通注射液（以下簡稱疏血通）是由水蛭和地龍的提取物精制而成的中藥注射制劑。疏血通注射液在臨床心、腦血管血栓性疾病治療中具有較好的抗凝、溶栓功效［1-3］，但其具體的分子生物學(xué)機制尚未完全明了。本研究觀察疏血通作用下正常人外周血中與凝血、纖溶及血小板功能相關(guān)的指標變化，判斷其主要作用方向，探討疏血通注射液可能的抗凝、溶栓機制，并估算其有效作用濃度。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2015年5—7月，收集來自江蘇省血液研究所的6例健康獻血者的外周血，中位年齡37歲，男女各半。健康獻血者血常規(guī)指標、凝血指標、纖溶指標、血小板功能檢測以及體外血栓形成檢測均在參考范圍內(nèi)。

1.2 藥品 疏血通購自牡丹江友搏藥業(yè)股份有限公司，制劑形式：干粉。

1.3 儀器及試劑 全自動血凝儀（法國Stago公司）；全自動五分類血球計數(shù)儀（日本SYSMEX公司）；血小板聚集儀（美國Chrono-log公司）；血栓彈力儀（日本Hitachi公司）；流式細胞儀（法國Beckman公司）；B104-S分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；凝血檢測試劑（法國Stago公司）；血球計數(shù)試劑（日本SYSMEX公司）；組織纖溶酶原激活物（t-PA）測定ELISA試劑盒（英國Abcam公司）；纖溶酶原激活物抑制劑1（PAI-1）測定ELISA試劑盒（英國Abcam公司）。

1.4 實驗方法 采用同一健康獻血者的血液或血漿，以疏血通1份+血液或血漿9份（疏血通終濃度為20 μg/μl）作為加藥組，0.9%氯化鈉溶液1份+血液或血漿9份作為對照組。檢測兩組血常規(guī)指標、凝血指標、纖溶指標、血小板功能、體外血栓形成情況。

1.4.1 血常規(guī)指標檢測 EDTA抗凝全血，在Sysmax全自動血常規(guī)儀上檢測白細胞計數(shù)（WBC）、紅細胞計數(shù)（RBC）、血小板計數(shù)（PLT）、紅細胞比容（HCT）。

1.4.2 凝血指標檢測 （1）枸櫞酸鈉抗凝全血，混勻后室溫孵育15 min，隨后在全自動血凝儀上檢測活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶原時間（PT）、凝血酶時間（TT）。（2）血塊退縮試驗：EDTA抗凝全血混勻后以200×g離心5 min分離出富血小板血漿（PRP），取PRP 0.6 ml加入10 ml玻璃試管中，37 ℃溫育3 min后加入0.05 mol/L CaCl2溶液，37 ℃溫育2 h后棄去血凝塊，計算血塊收縮率。血塊收縮率（%）=剩余血清體積/PRP體積×100%。（3）糾正試驗：枸櫞酸鈉抗凝全血，兩組血漿1∶1混合后在全自動血凝儀上檢測APTT、PT、TT。

1.4.3 纖溶指標檢測 （1）枸櫞酸鈉抗凝全血混勻后室溫孵育15 min，隨后在全自動血凝儀上檢測D-二聚體、纖維蛋白原（FIB）。（2）優(yōu)球蛋白溶解時間（ELT）測定：枸櫞酸鈉抗凝全血混勻后以1 600×g離心10 min，分離出乏血小板血漿（PPP），測定ELT。（3）t-PA測定：EDTA抗凝全血充分混勻后以1 600×g離心10 min分離出PPP后，用0.9%氯化鈉溶液以1∶10稀釋，采用ELISA試劑盒檢測t-PA。（4）PAI-1測定：血漿及分離同（3），用0.9%氯化鈉溶液以1∶80倍稀釋，采用ELISA試劑盒檢測PAI-1。

1.4.4 血小板功能檢測 （1）血小板聚集試驗：枸櫞酸鈉抗凝全血充分混勻后以200×g離心5 min分離出PRP，剩余樣品以1 600×g離心10 min分離出PPP，在血小板聚集儀上以光學(xué)比濁法分別檢測4種誘導(dǎo)劑〔二磷酸腺苷（ADP）、瑞斯托霉素、膠原、凝血酶〕誘導(dǎo)的血小板聚集率。（2）血小板黏附試驗：枸櫞酸鈉抗凝全血，分別加入疏血通或者 0.9%氯化鈉溶液，37 ℃溫育15 min后加入50 μl鈣黃綠素溶液，37 ℃再溫育15 min。將上述血液以1 500 r/s的恒定剪切力流過事先包被膠原蛋白的玻璃平板（包被方法：人胎盤Ⅲ型膠原在pH值為3.0的醋酸溶液中溶解后以PBS溶液調(diào)整濃度至50 μg/ml，取200 μl涂布于載玻片中央，4 ℃靜置過夜），血液流盡后以0.9%氯化鈉溶液輕輕漂洗玻璃平板，將平板置于20倍熒光纖維鏡下計算血小板黏附率。（3）P-選擇素測定：枸櫞酸鈉抗凝全血充分混勻后室溫靜置15 min，取全血10 μl加入PE標記的抗P-選擇素抗體2 μl，37 ℃溫育15 min后加0.9%氯化鈉溶液0.5 ml，在流式細胞儀上檢測P-選擇素。

1.4.5 體外血栓形成檢測 枸櫞酸鈉抗凝全血，充分混勻后室溫孵育15 min，隨后在血栓彈力儀上檢測體外血栓形成情況，檢測R值、K值、α角、MA值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以（s）表示，兩組間比較采用配對t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血常規(guī)指標 對照組WBC、PLT高于加藥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。兩組RBC、HCT比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，見表1）。

2.2 凝血指標 對照組APTT、PT、TT、血塊收縮率分別為（37.7±3.9）s、（12.7±0.4）s、（17.2±0.9）s、（55.8±8.0）%，加藥組APTT、PT、TT、血塊收縮率分別為（46.8±5.7）s、（16.6±0.5）s、（34.9±2.0）s、（55.6±6.8）%，糾正試驗的APTT、PT、TT分別為（41.3±4.2）s、（14.0±0.5）s、（23.5±0.8）s。加藥組APTT、PT、TT長于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t配對=4.916、10.405、10.571，P值均＜0.001）；對照組與加藥組血塊收縮率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t配對=0.133，P=0.897）。糾正試驗的APTT、PT、TT長于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t配對=4.499、8.614、8.085，P=0.001、＜0.001、＜0.001）；糾正試驗的APTT、PT、TT短于加藥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t配對=4.891、9.749、7.113，P值均＜0.001）。

2.3 纖溶指標 加藥組D-二聚體、t-PA高于對照組，F(xiàn)IB、ELT、PAI-1低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

2.4 血小板功能 加藥組ADP、瑞斯托霉素、膠原、凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集率低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。兩組血小板黏附率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。加藥組P-選擇素高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表3）。

2.5 體外血栓形成 加藥組R值、K值長于對照組，α角、MA值小于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表4）。

表1 兩組血常規(guī)指標比較（s，n=6）Table1 Blood routine index changes between two groups

表1 兩組血常規(guī)指標比較（s，n=6）Table1 Blood routine index changes between two groups

注：WBC=白細胞計數(shù)，RBC=紅細胞計數(shù)，PLT=血小板計數(shù)，HCT=紅細胞比容

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表2 兩組纖溶指標比較（s，n=6）Table2 Changes in fibrinolysis related indicators between two groups

表2 兩組纖溶指標比較（s，n=6）Table2 Changes in fibrinolysis related indicators between two groups

注：FIB=纖維蛋白原，ELT=優(yōu)球蛋白溶解時間，t-PA=組織纖溶酶原激活物，PAI-1=纖溶酶原激活物抑制劑1

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表4 兩組體外血栓形成變化（s，n=6）Table4 Changes of in vitro thrombosis between two groups

表4 兩組體外血栓形成變化（s，n=6）Table4 Changes of in vitro thrombosis between two groups

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表3 兩組血小板功能比較（s，n=6）Table3 Changes in platelet function between two groups

表3 兩組血小板功能比較（s，n=6）Table3 Changes in platelet function between two groups

注：ADP=二磷酸腺苷

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3 討論

疏血通有效成分為水蛭和地龍?zhí)崛∥?，水蛭的活性成分——水蛭素，是一種特效的凝血酶抑制劑［4］。地龍主要成分為蚓激酶，蚓激酶具有類組織型纖溶酶原激活物的作用［5］，兩者結(jié)合具有強大的抗血栓形成和纖溶活性作用。疏血通有抗凝、抗栓、促纖溶等作用，但利用人血液進行系統(tǒng)的體外抗凝、抗栓、促纖溶研究較少。

本研究結(jié)果顯示，對照組WBC、PLT高于加藥組，可能是疏血通引起血小板之間或者血小板-白細胞聚集，這樣的細胞比白細胞大，血球計數(shù)儀不能識別這樣的聚集細胞導(dǎo)致儀器讀數(shù)下降，無臨床意義。加藥組APTT、PT、TT長于對照組，提示該藥對內(nèi)源性凝血途徑和外源性凝血途徑均有影響，與黃越冬等［6］的研究結(jié)果一致，有利于延緩血栓的形成。加藥組D-二聚體、t-PA高于對照組，F(xiàn)IB、ELT、PAI-1低于對照組，這些纖溶指標的變化提示加入疏血通后，血液中纖溶活性增強，且促進了血栓溶解。

疏血通在較高濃度下對多種誘導(dǎo)物引起的血小板聚集以及血小板黏附均有抑制作用，提示藥物中的某些成分可能影響了血小板聚集的共同通路。血小板的磷脂表面以及血小板膜糖蛋白ⅡbⅢa、糖蛋白Ⅰb等均可能是作用靶點。血塊收縮率無明顯變化，提示與血小板骨架相關(guān)的黏附分子不受影響。

本研究結(jié)果顯示，加藥組ADP、瑞斯托霉素、膠原、凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集率低于對照組，P-選擇素高于對照組，提示疏血通能明顯促進血小板表面P-選擇素的表達，藥物中的水蛭素可能是產(chǎn)生這一效應(yīng)的原因。最新的研究認為，血小板表面P-選擇素的表達增加可以促進白細胞向血栓形成部位遷移、積聚，并最終與血小板、纖維蛋白原等交聯(lián)形成復(fù)合血栓，這種類型的血栓比純血小板血栓相對疏松，更易于被u-PA等纖溶促進物降解，這一機制有利于機體控制血管內(nèi)血栓的過度生長，并且能降低缺血再灌注損傷，這或許能為臨床上疏血通對腦卒中患者腦神經(jīng)的保護提供一些理論線索［7］。

在本實驗中疏血通起作用的有效濃度約為20 μg/μl，該濃度與藥品提供方之前在大鼠等動物中進行的體內(nèi)試驗有效濃度相當(dāng)，當(dāng)濃度低于10 μg/μl時大多數(shù)前述有變化的指標與對照相比不再有意義［8］。在人體內(nèi)用藥，或許需要一定的用藥時間的累積才能達到有效濃度，因此對該藥在體內(nèi)的藥效學(xué)與藥動學(xué)之間的關(guān)系有必要做更多的研究。另一方面，通過對該藥中有效成分的進一步提取，有可能明顯降低給藥量。

綜上所述，疏血通可多方向、多靶點發(fā)揮抗凝、抗栓、促纖溶等作用。由于本文作者是在抗凝、抗栓、促纖溶藥效層面對疏血通抗栓作用的研究，尚未深入到機制研究層面，因此研究者后續(xù)可以針對此不足研究疏血通作用于凝血瀑布的具體絲氨酸蛋白酶、血小板功能及P-選擇素或PAI-1的生成或結(jié)合來闡明疏血通的抗栓作用機制。

作者貢獻：夏珂、張忠兵、江淼進行研究設(shè)計與實施、資料收集整理，撰寫論文并對文章負責(zé)；陳艷明、何楊、趙赟霄進行研究實施、評估、資料收集；鄭順亮、王思瑤、周劍波、白芳進行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。