Illumina MiSeq高通量測序分析不同品種桑樹內(nèi)生細菌多樣性*

吳燕燕 徐偉芳 羅 琴 王玲莉 劉祎楊 陳 凱 謝 潔

(西南大學生物技術學院，重慶 400715)

桑樹(MorusL.)是一種兼具經(jīng)濟與生態(tài)效益的樹種，在中國蠶業(yè)發(fā)展和環(huán)境治理等方面均具重要作用。桑椹(Mulberry fruit)是桑樹的果實，因其口感獨特、滋味頗佳、營養(yǎng)豐富等特點而深受大眾喜愛。桑椹中含有大量黃酮和多酚類活性物質(zhì)，具有提高免疫力、抗氧化和抗衰老等功效[1-4]，近年來果桑產(chǎn)業(yè)呈現(xiàn)出良好的發(fā)展勢頭。然而，隨著果桑種植面積的不斷擴大，桑椹菌核病對果桑產(chǎn)業(yè)的危害日趨嚴重，給果桑生產(chǎn)帶來極大的經(jīng)濟損失。桑椹菌核病，又稱白果病，是一種土傳真菌性病害，可由桑實杯盤菌(Ciboriashiraiana)[5]、肉阜狀杯盤菌(Ciboriacarunculoides)[6]、桑椹核地杖菌(Scleromitrulashiraiana)[7]以及核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)[8]等多種病原真菌引起。有關桑樹抗病性的調(diào)查結果中顯示，不同桑樹品種對菌核病抗性差異較大。江西省蠶桑茶葉研究所果桑園內(nèi)5個桑樹品種中，臺果46C019發(fā)病程度最輕，抗病性最強[9]；黃傳書等通過對重慶市蠶業(yè)科學技術研究院桑園內(nèi)16個果桑品種的桑椹菌核病抗性能力的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，川桑7637抗性最強，紅果2號抗性最弱[10]；魏曉軍選育出的抗性品種臺灣46C019和蘇椹72號對防治桑椹菌核病的效果頗佳[11]?？剐杂N是目前防治菌核病的有效方法之一，但該防治策略仍存在“選育時間長、人力投入大及部分抗性品種果質(zhì)與經(jīng)濟性狀欠佳”等一系列弊端?；瘜W防治與農(nóng)藝防治亦是生產(chǎn)上常用的防控手段，但農(nóng)藥濫用易威脅食品與環(huán)境安全，土地翻耕等農(nóng)藝防控效果不佳[12]。因此，尋找綠色環(huán)保、安全有效的防治方法已迫在眉睫。

植物內(nèi)生菌是指其生活史中的某一段時期生活在健康植物各組織器官的細胞間隙或者細胞內(nèi)部，不引起宿主植物發(fā)生明顯病害的一類微生物[13-14]。內(nèi)生細菌作為宿主植物的重要組成部分，對調(diào)節(jié)宿主體內(nèi)的微生態(tài)平衡以及促進宿主植物的健康生長均發(fā)揮重要作用。近些年來利用內(nèi)生細菌防控植物病害的研究報道較多，但在實際生產(chǎn)中能夠廣泛應用的生防菌株卻十分有限[15-16]。為尋找抑菌效果顯著且穩(wěn)定的拮抗菌株，了解宿主植物內(nèi)生菌群落結構組成及多樣性特征十分必要。目前關于內(nèi)生菌多樣性的研究方法主要有基于傳統(tǒng)手段的組織分離培養(yǎng)法，以及基于宏基因組測序技術的非培養(yǎng)法，且至今所鑒定的內(nèi)生菌大多數(shù)依靠培養(yǎng)法分離獲得[17]。自然環(huán)境中存在大量的微生物，其數(shù)量高達106種，迄今依靠傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法能夠分離培養(yǎng)的微生物僅占總數(shù)的1.0%，而原核生物僅為0.1%[18]，利用傳統(tǒng)培養(yǎng)法研究植物內(nèi)生菌的多樣性存在明顯局限。大量未培養(yǎng)微生物(即難以在實驗室條件下生長的微生物)的存在嚴重制約了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法對植物內(nèi)生菌資源的全面認識。因此，避開傳統(tǒng)培養(yǎng)方法帶來的弊端，依靠分子生物學手段的非培養(yǎng)法應運而生。有報道顯示，植物內(nèi)生菌的分布特征與其定殖宿主植物的種類或品種緊密相關[19-25]。論文研究基于不同桑樹品種對菌核病菌抗性差異顯著的特點，利用基于Illumina MiSeq的第二代高通量測序技術，探索不同品種桑樹內(nèi)生菌的種群分布特征及多樣性，并探究內(nèi)生菌的分布與宿主植物抗病性之間是否存在相關性，為利用內(nèi)生菌改變宿主特性，開展抗病育種提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試桑樹材料

紅果2號、川桑7637、新倫教三種果桑品種樣品于2015年4月上旬采自重慶市蠶業(yè)科學研究院桑園(29°50′39″N, 106°25′55″E)，長果桑于同一時間段采自重慶市西南大學生物技術學院桑園“桑之源”(29°49′1″N, 106°24′57″E)。每個桑樹品種采集3～5個長勢一致的兩年生健康枝條，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑和儀器

DNA marker、Taq酶、dNTP、10×PCR Buffer、Mg2+購自寶生物工程(大連)有限公司；QIAquick凝膠回收試劑盒購于QIAGEN公司；其余常規(guī)化學試劑均為國產(chǎn)分析純；PCR儀(Bio-Rad，美國)，Applied Biosystems?Gene Amp?PCR System 9700(Bio-Rad，美國)等。

1.2 方法

1.2.1 桑樹表面消毒

按照文獻[26-28]的方法進行桑樹的表面消毒，具體操作方法為：將桑枝剪成5cm莖段，流水沖洗晾干后，完全浸潤于75.0%乙醇中，取出后于酒精燈上燃盡莖段表面的乙醇，將其置于PDA培養(yǎng)基上滾動一周，使莖段表面均接觸培養(yǎng)基，將該PDA平板置于22℃培養(yǎng)48h，確認表面消毒徹底。

1.2.2 內(nèi)生菌富集與宏基因組DNA提取

內(nèi)生菌富集[29-30]：將20g消毒的桑樹樹皮剪碎，加入160mL無菌水，置于組織搗碎機搗碎后，紗布過濾離心 (200×g，5min，4℃)，取上清130mL，依次加入NaCl和SDS分別至終濃度為0.9%，0.063%，輕輕混勻后4℃靜置1h，取上清離心(5000×g，10min，4℃)，然后將所獲沉淀重懸于160mL無菌水，再按上述濃度加SDS和NaCl，靜置30min，4℃離心10min(5000×g)，收集的沉淀即為富集的菌體，將其按30mg/ mL的比例加入TE緩沖液懸浮備用。

以富集的菌體為材料，參考文獻[28]中的改良CTAB法提取宏基因組DNA，并以此為模板，利用引物799F (5’-AACAGGATTAGATACCCTG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)進行PCR擴增。PCR反應條件為：95℃預變性5min；94℃變性30s，50℃退火45s，72℃延伸1min，30個循環(huán)；72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠檢測[31-32]，將獲得單一且明亮條帶的擴增16S rRNA基因產(chǎn)物對應的總DNA樣品視為合格樣品，并將濃度≥50ng/uL的DNA樣品送至成都羅寧生物科技有限公司進行上機測序與后續(xù)生物信息分析。

1.2.3 PCR擴增、Miseq文庫構建及測序

以1.2.2確定的合格基因組DNA為模板，利用16S rDNA V3-V4區(qū)特異引物338F/806R，使用高效和高保真酶(TOYOBO KOD-Plus-Neo DNA Polymerase)進行PCR擴增。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測、QIAquick凝膠回收試劑盒(QIAGEN公司)回收擴增產(chǎn)物，并使用GE Nano Vue系統(tǒng)(GE Healthcare)進行熒光定量檢測。利用Illumina MiSeq平臺(Illumina，SanDiego，USA)標準操作規(guī)程將純化后的擴增片段構建雙末端讀長(PE，Paired-end Reads)2×300的文庫并測序。

1.2.4 生物信息分析流程

Miseq測序得到的雙端序列數(shù)據(jù)，首先根據(jù)PE之間的重疊關系，利用FLASH軟件拼接[33]、QIIME軟件過濾[34]、UCHIME去除嵌合體后[35]，得到有效優(yōu)化序列。然后利用UPARSE算法對優(yōu)化序列在97%水平上進行OTU聚類分析[36]，挑選出OTU代表性序列，并利用Greengene和Silva等數(shù)據(jù)庫進行物種注釋[37-38]，去除注釋為葉綠體、線粒體及非細菌界的OTUs。最后利用Mother軟件做稀釋曲線分析[39]，通過對OTU進行豐度和α-多樣性分析，得到微生物細菌群落結構組成及多樣性特征。

圖中C、Q、X、H分別代表長果桑、川桑7637、新倫教、紅果2號，M代表DNA marker 2000圖1 富集菌體DNA的質(zhì)量檢測

2 結果與分析

2.1 內(nèi)生細菌宏基因組DNA的提取

提取的桑樹樹皮組織總DNA片段較為完整，基因組片段大于15kb。通過細菌16S rDNA V6～V10區(qū)特異性PCR擴增，均獲得大小為750bp左右的目的片段(圖1)。經(jīng)表面消毒的桑枝滾動的培養(yǎng)基在培養(yǎng)后，于22℃溫度下培養(yǎng)48h，無菌落生長，說明實驗中得到的結果為合格的桑樹內(nèi)生菌的基因組。

2.2 序列長度分布

從4個桑樹品種中共測得128715條PE，經(jīng)拼接和過濾處理后，獲得92282條優(yōu)化序列，除新倫教外，其余3個品種得到的優(yōu)化序列均超過2萬條(表1)，且所有桑樹品種的優(yōu)化序列長度集中分布在420～429bp范圍內(nèi)(圖2)，約占總序列的90.02%。

表1 樣品序列長度統(tǒng)計表

圖2桑樹內(nèi)生細菌擴增序列長度分布情況

2.3 OTU數(shù)目統(tǒng)計

從4個果桑樣品中共獲得5858個細菌OTUs，不同品種桑樹OTU數(shù)量存在差異(圖3)：抗性品種川桑7637的內(nèi)生細菌OTU數(shù)最高，可達2228個，長果桑次之，含1907個OTUs，易感品種紅果2號(1739)和新倫教(1713)則整體相對較低。4個品種共有內(nèi)生細菌OTUs數(shù)為239個，遠低于各品種果桑特有內(nèi)生細菌OTUs數(shù)(川桑7637，1513個；長果桑，1209個；紅果2號，1060個；新倫教，1034個)。

圖3 (A)不同品種桑樹內(nèi)生菌OTU分布Venn圖,(B)不同品種桑樹內(nèi)生細菌OTU數(shù)目統(tǒng)計;圖中C、Q、X、H分別代表長果桑、川桑7637、新倫教、紅果2號

2.4 樣品多樣性分析

基于OTU的稀釋曲線結果顯示，隨著測序數(shù)量的增加，稀釋曲線斜率逐漸降低，趨于平坦，且所有樣品均已進入平臺期，說明測序數(shù)量已經(jīng)足夠大，可以基本反映樣品中絕大多數(shù)微生物信息(圖4)。另外，基于Shannon和Chao1多樣性指數(shù)曲線結果顯示4個樣本的多樣性指數(shù)差異較大，川桑7637>長果桑>新倫教>紅果2號，即桑椹菌核病抗性品種川桑7637內(nèi)生細菌的種群豐富度最大，多樣性最高，其次是長果桑，而易感品種新倫教和紅果2號種群豐富度和多樣性相對較低。

圖4 不同桑樹品種的稀釋曲線和多樣性指數(shù)曲線；C、X、Q、H分別代表長果桑、新倫教、川桑7637、紅果2號

2.5 群落結構組成分析

在門的分類水平看(圖5A)，4個桑樹樣品中共檢測出細菌21個門(相對豐度≥0.1%)，不同品種桑樹所測到的細菌種類相似，但在各品種中所占比例不同。整體而言，數(shù)量最多的5個門為變形菌門(Proteobacteria，36.10%)、厚壁菌門(Firmicutes，14.51%)、酸桿菌門(Acidobacteria，13.38%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，11.85%)以及放線菌門(Actinobacteria，6.35%)，尤以變形菌門的優(yōu)勢最為明顯，其在長果桑、川桑7637、新倫教、紅果2號各品種中所占比例分別為74.17%、68.87%、78.90%和79.97%。盡管浮霉狀菌門(Planctomycetes，3.86%)、綠彎菌門(Chloroflexi，3.72%)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes，1.21%)和疣微菌門(Verrucomicrobia，1.18%)等常見的門類細菌含量較少，但在所有桑樹樣品中均有一定比例的分布。

在綱的分類水平看(圖5B)，4個桑樹樣品共檢測出細菌18個綱(相對豐度≥0.5%)。γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria，14.48%)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria，13.21%)、梭菌綱(Clostridia，11.93%)、擬桿菌綱(Bacteroidia，7.48%)4個綱所占比例較大。其中，γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)的優(yōu)勢尤為明顯，其在長果桑、川桑7637、新倫教、紅果2號各品種中所占比例分別為62.40%、48.38%、59.24%和50.34%；α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)次之，其在紅果2號中可達26.89%，在長果桑、新倫教中所占比例均大于8%。

在目的分類水平看(圖5C)，從長果桑、川桑7637、新倫教、紅果2號4個桑樹樣品中共檢測出梭菌目(Clostridiales，11.74%)、假單胞菌目(Pseudomonadales，8.59%)、根瘤菌目(Rhizobiales，8.04%)、(Bacteroidales，7.48%)等22個目(相對豐度≥0.5%)。假單胞菌目是所有品種桑樹的優(yōu)勢菌目，其在長果桑、川桑7637、新倫教、紅果2號中所占比例分別為57.91%、42.65%、54.30%和45.63%。鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)在不同品種桑樹中所占的比例差異較大，其在長果桑、川桑7637、新倫教、紅果2號各品種中所占比例分別為5.12%、2.69%、12.19%和23.96%。

在科的分類水平看(圖5D)，假單胞菌科(Pseudomonadaceae，8.35%)、鞘氨醇單胞菌科(Sphingomonadaceae，2.00%)，腸桿菌科(Enterobacteriaceae，1.83%)、擬桿菌(Bacteroidaceae，1.23%)和甲基桿菌科(Methylobacteriaceae，0.92%)等25個科在4個桑樹品種內(nèi)生細菌中均有分布(相對豐度≥0.5%)。甲基桿菌科在川桑7637中所占比例較大(4.78%)，而在紅果2號內(nèi)的比例卻不足1%。

圖5 不同樣本在不同水平上的細菌群落組成。(A)門，(B)7綱，(C)目，(D)科；圖中 C、X、Q、H分別代表長果桑、新倫教、川桑7637、紅果2號

屬水平上的細菌種群分布特征顯示，4個桑樹樣品共有3857條序列被視為未知序列或尚未被分類到屬的序列，這些無法歸類的序列占總序列數(shù)的65.84%，說明還有很多潛在新菌種待發(fā)現(xiàn)。在可歸類序列中，主要分布于假單胞菌屬(Pseudomonas，8.01%)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas，1.78%)、擬桿菌屬(Bacteroides，1.14%)、芽孢桿菌屬(Bacillus，0.77%)以及甲基桿菌屬(Methylobacterium，0.75%)，且這些菌屬在不同樣品中所占比例有所差異。對豐度最高的前40個OTUs分析發(fā)現(xiàn)(表2)，假單胞菌屬為所有品種桑樹中所占比例最大的菌屬，其在長果桑、川桑7637、新倫教、紅果2號中所占比例分別為57.89%、43.08%、54.47%、45.81%，是果桑優(yōu)勢菌屬；甲基桿菌屬(Methylobacterium)在川桑7637中所占比例較大(4.79%)，而在其他三個品種果桑內(nèi)的比例卻不足1%；嗜血桿菌屬(Haemophilus)、巨單胞菌屬(Megamonas)等菌屬亦在桑樹中占有一定的比例。

表2 不同品種桑樹內(nèi)生細菌在屬水平上的群落結構組成

表中“g__”表示在門或科水平上無法歸類的屬。

3 討論與分析

植物內(nèi)生菌種類繁多，廣泛存在于植物的各種器官和組織中，是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，對宿主植物生長發(fā)育發(fā)揮重要作用。已有報道顯示，內(nèi)生菌的多樣性與植物種類、季節(jié)以及生長的地理環(huán)境等因素息息相關[40-41]。本研究調(diào)查了四個不同果桑品種內(nèi)生菌多樣性特征，結果發(fā)現(xiàn)，川桑7637、長果桑、新倫教和紅果2號這4個桑樹樣品均富含大量內(nèi)生細菌，各品種間的群落結構組成相似，但多樣性特征存在較大差異，抗性品種(川桑7637及長果桑)的內(nèi)生菌群多樣性顯著高于易感品種(紅果2號及新倫教)。此現(xiàn)象表明桑樹內(nèi)生菌的種群分布亦受宿主基因型的影響，推測菌體對宿主的這種選擇偏好性可能與宿主自身的生理結構、營養(yǎng)代謝途徑以及其分泌的次生代謝產(chǎn)物有關。

本實驗室前期利用培養(yǎng)法對桐鄉(xiāng)青桑樹品種內(nèi)生菌群落結構組成的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)是主要的桑樹內(nèi)生菌資源[28]。然而，本研究利用第二代高通量測序技術對4個桑樹品種內(nèi)生菌多樣性進行調(diào)查分析顯示，四個桑樹品種均含21個門類細菌，其中變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)以及放線菌門(Actinobacteria)為優(yōu)勢菌群。通過傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法所發(fā)現(xiàn)的植物內(nèi)生細菌種類及數(shù)量遠遠低于高通量測序得到的菌群數(shù)量，說明大量低豐度菌群及未培養(yǎng)微生物在培養(yǎng)法分離中被忽略，而未培養(yǎng)微生物中蘊藏著大量的未知功能基因和生物潛能，在生物能源開發(fā)利用和環(huán)境保護領域具有重要的應用潛力[42]，Illumina MiSeq的第二代高通量測序技術具有測序通量高，操作簡單快速，測序信息準確和成本低等特點，為低豐度及未培養(yǎng)微生物的研究帶來了新的思路和方式。

本研究利用基于Illumina MiSeq的第二代高通量測序技術，比較了桑椹菌核病不同抗性桑樹品種的內(nèi)生細菌群落結構組成和多樣性特征，解決了不可培養(yǎng)及低豐度菌種在傳統(tǒng)方法中無法鑒別的局限。后續(xù)研究將在本研究基礎上通過改良菌株的培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)方法等手段，盡可能富集到更多的內(nèi)生菌資源，并從多樣的桑樹內(nèi)生菌資源庫中分離篩選具高效穩(wěn)定抑菌功效的拮抗菌株，為桑樹病害的生物防治提供參考依據(jù)。