SPNS2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義*

金榮 何新陽 劉成業(yè) 陳志強(qiáng) 周杭城 王曉秋

結(jié)直腸癌為最常見的消化道腫瘤之一，其發(fā)病率居全球第3位，致死率居第4位［1-3］。目前，以手術(shù)為中心的多學(xué)科綜合治療是根治結(jié)直腸癌的可能治療方法［4］，但術(shù)后患者仍存在較大的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，因此尋找一種能夠用于結(jié)直腸癌診療及評(píng)估患者預(yù)后的標(biāo)記物成為臨床研究的重點(diǎn)。研究表明，靶向抑制鞘氨醇-1-磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體2（spinster homolog 2，SPNS2）的表達(dá)，能顯著改善結(jié)直腸癌、肺癌和乳腺癌患者的預(yù)后［5］。SPNS2為鞘氨醇-1-磷酸（sphingo?sine-1-phosphate，S1P）的轉(zhuǎn)運(yùn)體，S1P是一種有效且具有生物活性的信號(hào)分子，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活、遷移、血管及淋巴管形成促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展，因此SPNS2對(duì)癌癥發(fā)展也存在一定的調(diào)控作用［6］。目前，關(guān)于SPNS2與結(jié)直腸癌相關(guān)性的研究還處于動(dòng)物模型階段，尚未開展臨床標(biāo)本檢測(cè)，本研究采用結(jié)直腸癌標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，能較為準(zhǔn)確驗(yàn)證SPNS2的表達(dá)差異與結(jié)直腸癌患者的各項(xiàng)臨床參數(shù)、術(shù)后生存時(shí)間等相關(guān)性，以期為評(píng)估結(jié)直腸癌患者的預(yù)后提供新指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例資料 收集2018年2月至2018年6月于安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院行手術(shù)治療的29例結(jié)直腸癌患者的癌組織和癌旁正常組織（距腫塊邊緣距離＞5 cm）冰凍標(biāo)本行RT-qPCR檢測(cè)。另選取2010年1月至2013年6月在安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院行結(jié)直腸癌手術(shù)的133例患者的結(jié)直腸癌和癌旁正常組織標(biāo)本，其中男性72例、女性61例。年齡為31～88歲，中位年齡63歲。標(biāo)本使用4%福爾馬林浸泡固定、石蠟包埋，切片，行免疫組織化學(xué)法檢測(cè)。納入本研究的病例均為原發(fā)性結(jié)直腸腫瘤，排除家族腫瘤遺傳史，術(shù)前均未行放化療。本研究均告知患者或患者家屬并征得其同意。

1.1.2 主要試劑與儀器 PCR試劑與儀器：TRIzol購自美國(guó)Life Technogies公司，PCR引物購自上海生工生物工程公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自德國(guó)Thermo Scien?tific公司，熒光定量PCR試劑盒購自德國(guó)Qiagen公司，熒光定量PCR儀購自德國(guó)Thermo Scientific公司。免疫組織化學(xué)試劑與儀器：一抗兔抗人SPNS2購自北京Bioss生物技術(shù)公司，新型酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物、免疫組織化學(xué)染色試劑盒和DAB顯色盒均購自福州邁新生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色及其評(píng)價(jià) 手術(shù)中取下的標(biāo)本切片厚5μm，經(jīng)二甲苯脫蠟、濃度梯度酒精水化；使用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌后，3%過氧化氫室溫下孵育10 min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性；放置于95℃枸櫞酸緩沖液（pH為6.0）中15 min，修復(fù)抗原；滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20 min，阻斷非特異性免疫反應(yīng)。待切片干燥后，將一抗兔抗人SPNS2稀釋濃度至1：100滴加于組織表面，4℃孵育過夜。室溫下復(fù)溫30 min，PBS洗滌，滴加新型酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物，孵育30 min后滴加現(xiàn)配DAB顯色劑顯色，蘇木精復(fù)染2 min，鹽酸酒精分化，流水沖洗10 min。常規(guī)脫水、透明、封片、鏡檢。

結(jié)果判定：每張切片選擇5個(gè)高倍鏡視野（×200），由兩名病理科醫(yī)生共同判定，對(duì)每張切片陽性細(xì)胞染色比例及染色強(qiáng)度進(jìn)行分級(jí)評(píng)分，根據(jù)兩項(xiàng)評(píng)分之和進(jìn)行結(jié)果判定。陽性細(xì)胞染色比例評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無陽性細(xì)胞為0分，＜20%陽性細(xì)胞為1分，20%～50%陽性細(xì)胞為2分，＞50%細(xì)胞為3分。陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分（無染色），1分（淡黃色），2分（棕黃色），3分（棕褐色）。兩者之和：0～2分為陰性（不表達(dá)或低表達(dá)）；3～6分為陽性（高表達(dá)）。

1.2.2 RT-qPCR檢測(cè) 將凍存于-80℃冰箱的癌組織和癌旁正常組織標(biāo)本分別使用TRIzol試劑處理，提出癌組織和癌旁組織中的總RNA。使用RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，隨后取出cDNA作為熒光定量的模板，使用QuantiNova SyBr Green PCR Kit試劑盒進(jìn)行PCR檢測(cè)，分析擴(kuò)增曲線、溶解曲線以及相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性1 min，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。SPNS2基因的特異引物：上游引物序列5'-CATGTTCTTCCTCGCCACTG-3'；下游引物序列5'-GCACCACCTCAGACTTTCAC-3'；引物長(zhǎng)度為111 bp；基因的定量分析使用β-actin作為對(duì)照，上游引物序列5'-CCCTGGAGAAGAGCTACGAG-3'；下游引物序列5'-GGAAGGAAGGCTGGAAGAGT-3'；引物長(zhǎng)度為96 bp。采用2-ΔΔCt法計(jì)算SPNS2基因表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織SPNS2蛋白表達(dá)水平的差異以及SPNS2蛋白表達(dá)和結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系均采用χ2檢驗(yàn)；結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織SPNS2的mRNA表達(dá)水平差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier生存曲線分析SPNS2的過表達(dá)與結(jié)直腸癌患者總生存率（overall survival，OS）的關(guān)系；運(yùn)用單因素分析及Cox回歸多因素分析明確影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的相關(guān)因素。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SPNS2蛋白在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)情況

免疫組織化學(xué)法檢測(cè)表明，SPNS2在結(jié)直腸癌組織中的陽性率為81.2%（108/133），在癌旁正常組織中的陽性率為22.6%（30/133），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=69.136，P＜0.001，表1，圖1）。

表1 SPNS2蛋白在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá) （例）

圖1 SPNS2蛋白在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)

2.2 SPNS2 mRNA在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果表明，SPNS2 mRNA在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平明顯高于其對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織，表達(dá)水平均值分別為4.68±4.21和1.12±0.86，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.974，P＜0.001，圖2）。

2.3 SPNS2蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

經(jīng)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)133例結(jié)直腸癌組織中的SPNS2蛋白表達(dá)水平與相對(duì)應(yīng)患者的臨床病理特征關(guān)系的結(jié)果表明，SPNS2蛋白的陽性表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)、腫瘤大小和浸潤(rùn)深度密切相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），但與患者的年齡、性別無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

圖2 SPNS2 mRNA在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

2.4 SPNS2蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系

將結(jié)直腸癌組織中的SPNS2蛋白表達(dá)水平作為因變量繪制Kaplan-Meier生存曲線（圖3），結(jié)果表明SPNS2陰性表達(dá)患者的OS明顯長(zhǎng)于陽性表達(dá)患者（χ2=13.080，P＜0.001）。單因素分析表明，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)、腫瘤大小、SPNS2表達(dá)異常、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度、分化程度與結(jié)直腸癌患者預(yù)后相關(guān)（P＜0.05），患者的年齡、性別等與患者預(yù)后無顯著相關(guān)性（表3）。多因素分析結(jié)果表明，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)、SPNS2表達(dá)異常、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度是結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素（P＜0.05，表4）。

表2 結(jié)直腸癌組織中的SPNS2表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

表3 結(jié)直腸癌患者影響預(yù)后的單因素分析

表4 結(jié)直腸癌患者影響預(yù)后的Cox多因素分析

3 討論

SPNS2最初定義于對(duì)果蠅的研究，其生理功能最早發(fā)現(xiàn)于對(duì)斑馬魚的研究［7-8］。SPNS2主要參與S1P的外排，結(jié)構(gòu)與甘油-3-磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相似，是一個(gè)具有12個(gè)跨膜區(qū)域的蛋白質(zhì)，含有504個(gè)氨基酸殘基［9-10］，屬于主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族（major facilita?tor superfamily，MFS）的一員。

關(guān)于S1P的研究，Adada等［11］通過相關(guān)蛋白、基因、細(xì)胞學(xué)的研究表明，S1P是表皮生長(zhǎng)因子（epider?mal growth factor，EGF）促近腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)侵襲的一種新途徑。通過建立結(jié)直腸腫瘤模型，對(duì)S1P在結(jié)直腸腫瘤中的研究結(jié)果表明，S1P在結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，而在正常結(jié)直腸表面上皮細(xì)胞中不表達(dá)，進(jìn)一步通過免疫組織化學(xué)法、基因轉(zhuǎn)染、細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)等研究表明S1P可以促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖［12-13］。2012年，Hisano等［14］首次在哺乳動(dòng)物中研究SPNS2與S1P的關(guān)系，結(jié)果表明SPNS2是哺乳動(dòng)物中第一個(gè)生理S1P轉(zhuǎn)運(yùn)體，是淋巴細(xì)胞從胸腺流出的關(guān)鍵決定因素。Weyden等［15］對(duì)于SPNS2的研究結(jié)果表明，當(dāng)缺乏SPNS2時(shí)，會(huì)使S1P對(duì)于淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控能力下降，導(dǎo)致組織內(nèi)淋巴細(xì)胞循環(huán)減少，T細(xì)胞、NK細(xì)胞比例升高，從而更有效地殺傷腫瘤細(xì)胞，并且在整體上減少腫瘤的轉(zhuǎn)移，該研究先后在小鼠的肺、肝臟組織中得到證實(shí)，并且利用結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞株MC-38進(jìn)行驗(yàn)證，也得到SPNS2可以促進(jìn)結(jié)直腸腫瘤轉(zhuǎn)移的結(jié)果。

本研究對(duì)于SPNS2在結(jié)直腸腫瘤中采用人體腫瘤組織進(jìn)行驗(yàn)證，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)SPNS2蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)，表明SPNS2蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，進(jìn)一步分析SPNS2蛋白的表達(dá)結(jié)果與結(jié)直腸癌患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)SPNS2陽性表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)、腫瘤大小、浸潤(rùn)深度密切相關(guān)，與患者的年齡、性別無關(guān)。此外，本研究還采用RT-qPCR檢測(cè)結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中SPNS2 mRNA的表達(dá)，結(jié)果與蛋白表達(dá)結(jié)果相一致，癌組織中SPNS2 mRNA的表達(dá)明顯高于癌旁組織。單因素分析結(jié)果表明，SPNS2的表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)、腫瘤大小、腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與結(jié)直腸癌患者的OS密切相關(guān)。進(jìn)一步通過多因素Cox回歸分析顯示，SPNS2的表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)、浸潤(rùn)深度、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移可作為結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。

綜上所述，SPNS2在結(jié)直腸癌中的陽性表達(dá)與結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，SPNS2可作為新型結(jié)直腸腫瘤標(biāo)記物，在臨床上可作為評(píng)估患者預(yù)后、監(jiān)測(cè)術(shù)后腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的指標(biāo)及診療的新靶點(diǎn)，為改善結(jié)直腸癌的診療效果提供新的研究方向。