彌漫性表皮松解性掌跖角化病兩家系突變分析

王小伶 付芳惠 付希安 孫樂樂 于功奇 劉 紅 張福仁

彌漫性掌跖角化病是以手掌和足跖角化過度為特征的常染色體顯性遺傳病。本病多為嬰兒期發(fā)病，延續(xù)終生。輕者僅表現(xiàn)為掌跖部位皮膚粗糙，重者可出現(xiàn)彌漫性增厚斑塊、邊緣清晰的角質(zhì)增厚，呈黃色胼胝體樣，并且可蔓延至掌跖皮膚側(cè)緣或手足背。部分患者可伴有指節(jié)墊、指趾屈曲畸形等。根據(jù)其病理特點(diǎn)可分為彌漫性表皮松解性掌跖角化癥(EPPK)和彌漫性非表皮松解性掌跖角化癥兩種亞型，前者較為常見，由Voner在1901年首次報(bào)道[1]。

1992年Reis等[2]通過對德國1個7代共18例患者的EPPK大家系進(jìn)行遺傳連鎖分析，將EPPK的候選基因定位于17q.21.1-21.2號染色體KRT9基因。國內(nèi)外多位學(xué)者對掌跖角化病進(jìn)行了KRT9基因檢測，相繼報(bào)道27個突變點(diǎn)，證實(shí)KRT9基因?yàn)檎契沤腔〉闹虏』騕1]。目前，對于彌漫性松解性掌跖角化病臨床表型的研究相對較少，尚未找到基因型與臨床表型明確相關(guān)性[3]。最近，有學(xué)者在一EPPK家系中發(fā)現(xiàn)了Leu458Pro突變，與之前首次發(fā)現(xiàn)該突變家系的患者臨床表現(xiàn)有所差異，從而說明了同一個KRT9突變在不同家系之間的臨床表型存在差異，并且EPPK具有高度的遺傳異質(zhì)性[4]。本研究報(bào)道了兩個攜帶KRT9同一熱點(diǎn)突變的彌漫性松解性掌跖角化病家系并分析不同家系和同一家系不同個體的臨床表現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 對象 兩個家系均來自中國山東，無血緣關(guān)系。

家系1共5代27人，無近親結(jié)婚者。患者15例，男9例，女6例。無隔代遺傳，遺傳規(guī)律符合常染色體顯性遺傳(圖1a)。先證者(IV3)出生不久即發(fā)病，表現(xiàn)為手掌和足跖部位彌漫增厚的蠟黃色斑塊，延續(xù)到掌跖皮膚側(cè)緣，邊界清楚，呈暗紅色邊緣，散發(fā)臭味。先證者的女兒(V2),3歲,雙手手指腫脹，未出現(xiàn)指節(jié)墊，但已出現(xiàn)明顯的雙手指屈曲障礙(圖1b、1c)。先證者的祖父(II3),78歲,自出生后即發(fā)病，3歲后逐漸出現(xiàn)明顯的指節(jié)墊和指屈曲(圖1d、1e)，隨年齡增長癥狀逐漸加重。家系中其他患者癥狀與先證者相似，均未出現(xiàn)此類癥狀(圖1f、1g)。

家系2共4代24人，無近親結(jié)婚者?；颊?2例，男5例，女7例。無隔代遺傳，符合常染色體顯性遺傳規(guī)律(圖2a)。先證者(III6)自出生開始發(fā)病，隨著年齡增長皮膚逐漸粗糙、增厚，皮損泛發(fā)至整個手掌、足跖，表現(xiàn)為境界清楚的彌漫性角化過度性斑塊，表面輕度脫屑，部分區(qū)域皮損表面呈蠟狀平滑(圖2b、2c)，家系中其他患者癥狀與先證者相似。家系內(nèi)沒有出現(xiàn)指節(jié)墊、指趾屈曲畸形現(xiàn)象。

1a：家系圖；1b，1c：先證者女兒(V2)手指腫脹及屈曲障礙；1d,1e：先證者祖父(II3)的指節(jié)墊(箭頭所指)和屈曲畸形.1f，1g：家系1中其他患者臨床表現(xiàn)；1h：KRT9基因的測序圖,箭頭指向突變c.487C>T

圖1 家系1

2a：家系圖；2b，2c：先證者掌跖部位增厚，表面有裂紋；2d：KRT9基因的測序圖,箭頭指向突變c.487C>T

圖2 家系2

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA制備 本研究獲得山東省皮膚病性病防治研究所倫理委員會批準(zhǔn)。在所有研究對象簽署知情同意的前提下，抽取兩個家系8例患者、4名健康者及200名健康對照的外周靜脈血5 mL，置于EDTA抗凝管中。應(yīng)用TGuide大體積血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)按照操作步驟提取基因組DNA。使用全波長紫外/可見光掃描分光光度計(jì)ND-8000(NanoDrop公司)檢測DNA濃度和純度，根據(jù)DNA原液濃度將DNA原液用滅活的去離子水ddH2O標(biāo)化為30 ng/μL，純度(A260/A280)>1.8。

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 擴(kuò)增KRT9基因的7個外顯子，利用Primer3.0軟件設(shè)計(jì)上下游引物，由北京華大基因研究中心合成。其中1號外顯子的上游引物為:5’-TTGGCTACAGCTACGGCGGAGGAT-3’；下游引物為:5’-TGGTCCTTGAGATCATCAATAGTG-3’。采用12.5 μL反應(yīng)體系:Taq Mix(為dNTP、Taq酶和緩沖液的混合物)6.5 μL，ddH2O 5 μL，上下游引物各0.25 μL,樣本DNA 0.5 μL。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性,10 min，進(jìn)行35 個擴(kuò)增循環(huán),每個循環(huán)包括94℃變性30 s，復(fù)性59℃ 45 s，72℃延伸1 min，最后72℃延伸10 min。12 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析 PCR產(chǎn)物。

1.2.3 DNA測序 采用乙醇醋酸鈉純化法獲得純化的PCR產(chǎn)物，使用ABI 3500XL DNA測序分析儀(美國Applied Biosystem公司)進(jìn)行雙脫氧鏈終止法(Sanger測序法)測序得到最終的測序結(jié)果。將NCBI下載的參考序列輸入NCBI Nucleotide BLAST 中與測序結(jié)果進(jìn)行對比分析。

2 結(jié)果

兩個家系中所有參與研究的患者均在KRT9基因1號外顯子上檢測到c.487C>T(p.163R>W)錯義突變(圖1h、2d),其他外顯子未發(fā)現(xiàn)有害突變。兩個家系中的正常人及200名正常對照組中未發(fā)現(xiàn)此錯義突變。應(yīng)用基因突變致病性預(yù)測工具對此錯義突變點(diǎn)進(jìn)行功能預(yù)測，PolyPhen2值為0.999(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/bgi.shtml)；Sorting Intolerant From Tolerant(SIFT)值為0(http://sift.bii.a-star.edu.sg)。提示此突變?yōu)檫@兩個家系的致病突變，且該位點(diǎn)既往在彌漫性掌跖角化病患者中多次報(bào)道。

家系1中5例患者均攜帶c.487C>T突變，而其臨床表現(xiàn)有所不同。所有患者均出現(xiàn)掌跖角化過度，但先證者的祖父(II4)有明顯的指節(jié)墊及屈曲畸形，先證者的女兒(V2)自出生不久出現(xiàn)手指腫脹，屈曲障礙，家系中其他患者均無此類癥狀。

家系2中的3例患者均檢測出與家系1患者相同的基因突變，而所有患者除了掌跖部位過度角化外，均無指節(jié)墊及屈曲畸形。但先證者和其女兒(IV4)臨床癥狀較其他患者的臨床癥狀稍輕，患者自述本人和其女兒患病期間服用過阿維A，服藥期間可輕度緩解，停藥即復(fù)發(fā)，并且日常經(jīng)常涂抹護(hù)手霜等乳化劑。

3 討論

表皮松解性掌跖角化病是一種常染色體顯性遺傳性皮膚病，主要由編碼角蛋白的KRT9基因突變所致。角蛋白是構(gòu)成皮膚細(xì)胞骨架的重要成分，屬于角蛋白中間絲(KIF)超家族的成員，對上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整性至關(guān)重要[5]。角蛋白分為I型和II型角蛋白，其中心部位是桿狀功能區(qū),兩側(cè)分別是氨基末端和羧基末端功能區(qū)。從氨基端到羧基端，角蛋白被分為了頭、桿、尾三部分，其中桿區(qū)含有4個α螺旋結(jié)構(gòu)的亞區(qū)，其間由非螺旋結(jié)構(gòu)的連接區(qū)(L1，L12及L2)隔開[6]。KRT9基因全長4492 bp，其中cDNA為2353 bp，共編碼622個氨基酸，第163位密碼子發(fā)生突變即位于KRT9的桿區(qū)1A部位。目前，位于KRT9基因的1A螺旋區(qū)的第1外顯子的和2B螺旋區(qū)上的突變已經(jīng)有研究者報(bào)道過。據(jù)人類國際中間絲數(shù)據(jù)庫 (human intermediate filament database)統(tǒng)計(jì)，引起EPPK的KRT9基因突變共有26種，21種突變位于1A區(qū)域，另外5種突變位于2B區(qū)域。本文報(bào)道的p.163R>W錯義突變占所有突變的31.8%,已成為導(dǎo)致該病的熱點(diǎn)突變，這可能與KRT9基因中CpG島發(fā)生甲基化和去甲基化時出現(xiàn)錯誤有關(guān)，從而使第163位精氨酸密碼子中的堿基C變?yōu)門。并且這種堿基轉(zhuǎn)換的頻率很高，是其他隨機(jī)突變發(fā)生頻率的42倍[7]。

KRT9基因?qū)е碌膹浡运山庑哉契沤腔【哂懈叨鹊倪z傳異質(zhì)性。除了導(dǎo)致患者掌跖部位的彌漫性增厚，部分患者會有屈曲障礙和指節(jié)墊的發(fā)生。據(jù)研究表明，指節(jié)墊和屈曲障礙是伴隨患者的臨床癥狀而存在的，它們都有一定的遺傳傾向，有學(xué)者對患有指節(jié)墊癥狀的患者的皮損做了定量RT-PCR分析顯示：基底上層出現(xiàn)表皮松解，這是一種由角蛋白突變引起的皮膚病的典型表現(xiàn)，并且表皮松解局限在由K9表達(dá)的特定層，因此他們認(rèn)為指節(jié)墊是由于KRT9基因的過表達(dá)導(dǎo)致[8]。本研究家系1的患者中，先證者的女兒自出生不久就出現(xiàn)手指腫脹，屈曲障礙，先證者的祖父則有明顯的指節(jié)墊及屈曲畸形，值得注意的是家系中其他患者均無此類癥狀。并且同樣檢測出p.163R>W突變的家系2中所有患者也均無指節(jié)墊和屈曲畸形。這說明KRT9的同一個突變在不同家系或同一個家系的不同個體之間的臨床表型存在很大差異。

除了基因突變對臨床表型的作用，后天的行為習(xí)慣及病情干預(yù)也會對臨床表現(xiàn)有一定的作用。在一個伴有指節(jié)墊的EPPK家族中，一名右利手患者右手的角化增厚以及指節(jié)墊癥狀比左手癥狀嚴(yán)重，觀察結(jié)果表明，角化病和指節(jié)墊可能與摩擦有關(guān)[9]。本研究家系1中的患者V2和患者II3，自幼年便出現(xiàn)指屈曲障礙的現(xiàn)象，隨年齡的增長逐漸加重。再次證明EPPK患者的指節(jié)墊及指屈曲畸形現(xiàn)象與遺傳因素相關(guān)，而后天環(huán)境可能影響其嚴(yán)重程度。所以，EPPK的表型譜是由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用而影響了人體內(nèi)的角蛋白的表達(dá)。迄今，彌漫性掌跖角化病尚無有效的治療措施。據(jù)報(bào)道，口服阿維A可以緩解手指屈曲障礙[10]。我們研究中的家系2患者未出現(xiàn)指節(jié)墊及手指屈曲障礙可能與在疾病發(fā)展過程中曾經(jīng)口服過一定時間的阿維A,且日常經(jīng)常涂抹護(hù)手霜等潤膚劑有關(guān)。因此，早期監(jiān)測手指屈曲及指節(jié)墊癥狀，并進(jìn)行及時的治療干預(yù)，對于預(yù)防EPPK患者的手指畸形很有必要。

總之，我們的研究發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)致彌漫性表皮松解性掌跖角化病兩家系的致病突變，并分析了KRT9基因同一個突變導(dǎo)致的不同的臨床表型。我們推測，KRT9在EPPK、指節(jié)墊、屈曲畸形的發(fā)展過程中扮演著復(fù)雜的角色，需要進(jìn)一步研究EPPK與其他遺傳和環(huán)境因素之間的關(guān)系，以減輕EPPK給患者造成的心理及生活上的不便。