風味導向的白酒功能微生物組合發(fā)酵

紀媚，鄧楠，邱陽，馬曉茜，杜海，徐巖

(江南大學 釀酒科學與酶技術研究中心，工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)(宿遷市江南大學產業(yè)技術研究院，江蘇 宿遷，223814)

白酒是中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品之一，主要是由谷物類原料在微生物的作用下形成的具有水果香、花香等豐富的風味物質的蒸餾酒[1]。白酒發(fā)酵過程中復雜的微生物種群是決定白酒風味特征的重要因素。微生物種類及數(shù)量的差異會直接影響白酒的產量和質量。

鑒于微生物在白酒釀造中的重要作用，近幾十年來國內開展了大量的針對釀酒微生物的研究工作。主要包括培養(yǎng)法和免培養(yǎng)法，其中免培養(yǎng)法僅能通過分子手段觀察白酒釀造相關微生物的組成、結構等信息，如ZHANG等[2-3]通過變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技術分析濃香型白酒發(fā)酵過程中的細菌及真菌種群。而基于培養(yǎng)法的研究對生產實踐有更直接的幫助，如吳衍庸等[4]從濃香型白酒生產窖泥中篩選到窖泥甲烷菌和己酸菌，對提高濃香型白酒主體香己酸乙酯有重要意義。同時，由于白酒發(fā)酵過程中涉及到非常復雜的微生物相互作用及代謝，通過常規(guī)的單菌培養(yǎng)方式并不能呈現(xiàn)出白酒生產實際中真實的微生物代謝情況。因此，組合發(fā)酵方式成為了研究白酒釀造微生物功能的有力工具。如WU等[5-6]分析釀酒酵母、異常畢赤酵母和東方伊薩酵母組合發(fā)酵方式，最終可以生產出具有汾酒特征的產品。張艷等[7]通過組合發(fā)酵方式證明了醬香型白酒發(fā)酵過程中部分乳酸菌可以促進酵母的生長代謝，乳酸菌和酵母菌的相互作用可以影響酒中酸、醇、酯類物質的生成。然而目前組合發(fā)酵研究基本上是通過篩選酒醅中豐度較高的菌群進行組合，對不同菌株的酶活、代謝風味特性缺乏深入的考慮與理性的設計。

針對以上問題，基于本研究室以往篩選到的白酒功能菌株，根據(jù)不同菌株的酶活、風味特征進行組合發(fā)酵，建立了理性設計組合發(fā)酵的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

酵母菌包括釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、異常畢赤酵母(Pichiaanomala)、東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)、扣囊復膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)等共24株、細菌包括芽孢桿菌(Bacillussp.)等共16株、霉菌包括曲霉屬(Aspergillussp.)、青霉屬(Penicilliumsp.)、根霉屬(Rhizopussp.)等共16株。菌株來源為本實驗室已有的保藏菌株。

1.1.2 試劑及藥品

蛋白胨、瓊脂粉、酵母粉為Oxoid原裝進口，其他試劑購于國藥集團。

1.1.3 培養(yǎng)基

菌株的活化分別使用NB培養(yǎng)基(細菌)、YPD培養(yǎng)基(酵母)、PDA培養(yǎng)基(霉菌)；測量糖化力使用2%淀粉察氏培養(yǎng)基；測量蛋白水解力使用酪蛋白培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基為高粱汁培養(yǎng)基。

NB培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏5，蛋白胨10，NaCl 5；

YPD培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨20，葡萄糖20，瓊脂粉20；

PDA培養(yǎng)基(g/L)：PDA試劑粉46.1；

2%淀粉察氏培養(yǎng)基(g/L)：淀粉20，NaNO33，KCl 0.5，K3PO41，F(xiàn)eSO40.01，MgSO45，瓊脂粉5；

酪蛋白培養(yǎng)基(g/L)：酪蛋白10，蛋白胨5，酵母膏2.5，KH2PO40.3，MgSO47H2O 0.5，NaCl 1，瓊脂粉20。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株糖化力指標的測定

將菌種活化后在淀粉平板背面劃分區(qū)域。霉菌較大，一般分為2格；細菌和酵母較小，可分為4格。記錄好要接種的菌，用移液管槍頭蘸取少量菌，接種于相應的格內。每種菌株至少做2組。細菌于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)1～2 d，酵母菌和霉菌于30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)2～3 d。

用移液槍吸取適量盧戈氏碘液滴加到淀粉培養(yǎng)基內，分別觀察菌落大小及透明圈大小，并分別測量其直徑，得到菌落直徑與淀粉透明圈直徑比值，即可得到菌株糖化力大小。

1.2.2 菌株蛋白水解力指標的測定[8]

將活化后的菌種以同樣的方法接種于酪蛋白平板上，培養(yǎng)條件及時間與上述相同。可以直接觀察并測量菌落直徑與淀粉透明圈直徑，得到其比值，即可得到菌株蛋白水解力大小。

1.2.3 酵母菌發(fā)酵風味評定

發(fā)酵液中風味物質的分析:運用頂空固相微萃取技術(HS-SPME)和氣相色譜-質譜(GC-MS)方法分析。樣品處理方法及GC-MS分析條件見文獻[9]。

將酵母菌菌種活化。吸取5 mL高粱汁于試管中，用接種環(huán)鉤取1環(huán)菌，接種于高粱汁中，每個菌株接種2管。放于30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)1周。1周后，取出發(fā)酵液，通過感官評定篩選出發(fā)酵液具有優(yōu)良風味的菌株。

1.2.4 菌株組合固態(tài)發(fā)酵

白酒生產中微生物的相互作用對微生物群落的有效應用具有重要的作用。例如，霉菌與酵母的相互作用影響著糖化與產酒的速度；產酒酵母與產香酵母的相互作用影響著白酒的品質與產量；產香細菌與產酒酵母的相互作用也能影響著白酒的品質與產量[10]。

根據(jù)前期所得菌種水解力及風味分析，結合菌種特性[11]，做出4個組合方案。將4個組合中的菌株活化，制成菌懸液。用70 ℃的去離子水浸泡20 kg高粱顆粒18 h，將水瀝干后于蒸鍋中蒸2 h，等量分裝到4個發(fā)酵罐中。取1 mL上述菌株的菌懸液分別加入到4個發(fā)酵罐中，于室溫下密封培養(yǎng)2個月。將培養(yǎng)物取出蒸餾，白酒中的風味活性化合物應用液液萃取后再GC-O結合GC-MS技術檢測[9]。

2 結果與分析

已有研究發(fā)現(xiàn)，酵母菌在發(fā)酵過程中主要起到產酒精、產香的作用[12]，而細菌和霉菌的糖化力和蛋白水解力較高，主要起到分解大分子，為風味物質的產生提供前體物質，輔助酵母的生長和產香的作用[13]。不同菌株之間的相互作用可以提高酵母的發(fā)酵能力。吳群等[14]在對芝麻香型白酒釀造功能霉菌及其與酵母的相互作用的研究中證實了此觀點。研究表明隨著霉菌麩曲的用量增加，霉菌酵母的生物量都會比較大。同時淀粉的糖化速度也會加快，還原糖的充足供應加快了釀酒酵母的增殖速度，使發(fā)酵溫度升高并產有機酸等從而影響整個白酒發(fā)酵體系的微生物群落結構，而微生物群落結構的變化會影響最終白酒的風味變化[14]。

2.1 菌株糖化力和蛋白水解力比較

白酒主要原料是高粱等淀粉質原料，使用傳統(tǒng)的大曲作為糖化發(fā)酵劑，經發(fā)酵和蒸餾而制成的一種飲料酒[15]。在白酒發(fā)酵過程中，糖化劑以及菌株蛋白水解力的性能是決定白酒品質重要因素。因此優(yōu)勢的組合菌株需要有良好的糖化力和蛋白水解力。

圖1顯示了部分菌株的糖化力和蛋白水解力。糖化力總體比較高的菌株有：拜爾接合酵母BJY-6(ZygosaccharomycesbailiiBJY-6)、異常畢赤酵母HX-2(PichiaanomalaHX-2)、枯草芽孢桿菌80(Bacillussubtilis80)等。由圖1-a可以分析得到，拜爾接合酵母BJY-6(ZygosaccharomycesbailiiBJY-6)和異常畢赤酵母HX-2(PichiaanomalaHX-2)的糖化力在酵母中比較有優(yōu)勢。總體糖化力的比較中，細菌糖化力較高，其次是霉菌，而酵母總體糖化力水平略低(圖1-a)。

蛋白水解力總體比較高的菌株有：死谷芽孢桿菌HX-30(BacillusvallismortisHX-30)、紫紅紅曲5024(Monascuspurpureus5024)、地衣芽孢桿菌HX-50(BacilluslicheniformisHX-50)。芽孢桿菌的蛋白水解力都較強，其次是霉菌，酵母的蛋白水解能力較其他菌株較弱(圖1-b)。

圖1 部分菌株糖化力(a)和蛋白水解力比較圖(b)Fig.1 Comparison of saccharifying activity (a) and proteolytic activity of selected strains (b)

2.2 選取優(yōu)勢酵母測定發(fā)酵風味

2.2.1 感官評定酵母發(fā)酵液

在傳統(tǒng)釀造白酒的過程中，微生物對白酒的產量、口感、香味等起到非常重要的作用。其中酵母菌在原料淀粉的糖化、酒精的生成、香氣風味物質的形成、酒醅的發(fā)酵質量及其產品品質的優(yōu)劣等方面都起著舉足輕重的作用[16]。邵明凱等人在醬香型白酒風味研究中發(fā)現(xiàn)，酵母菌是白酒釀造中的重要的微生物群落，它對乙醇和對白酒風味貢獻最大的酯類物質的產生有重要作用。其研究中還表明，醬香型白酒發(fā)酵過程中酵母群落多樣性豐富，其差異是造成好和差輪次白酒風味和品質上不同的重要原因[17]。許焰等[18]通過研究醬香型白酒中的拜耳接合酵母發(fā)現(xiàn)其能夠產生更多的的酸類，酯類和醛類物質，并可生產19種特有的風味化合物，包括2-庚醇、2-壬醇、己醇、香葉醇、2-庚酮和丁酸等，其中一些風味物質對醬香型白酒中風味形成有重要影響。以上研究都表明了酵母在白酒釀造過程中對白酒風味物質產生的重要性。因此選取優(yōu)質酵母是釀造好白酒的重要一步，所以感官評價了部分優(yōu)勢酵母高粱發(fā)酵風味，為選取白酒微生物的組合發(fā)酵提供參考(表1)。

表1 酵母發(fā)酵液風味Table 1 The flavor of yeast fermentation

注：這里只列出優(yōu)勢酵母的高粱發(fā)酵風味。

YU等[19]對畢赤酵母屬和釀酒酵母屬的8種單菌株分別進行了液態(tài)和固態(tài)接種發(fā)酵，結果顯示苯乙醇、異丁醇等醇類，醋酸、己酸、辛酸、十二烷酸等酸類，乙酸乙酯、己酸乙酯、壬酸乙酯、十六酸乙酯等酯類在固態(tài)和液態(tài)發(fā)酵中都可以產生。王丹丹[20]將釀酒酵母和產酯酵母在水解液中液態(tài)發(fā)酵產生的微量成分與固態(tài)酒醅發(fā)酵28 d時的微量成分進行對比。發(fā)現(xiàn)液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵都可以產生醇、酸、酯等主要的風味物質，醇類主要有正丙醇、異丁醇、異戊醇；酸類主要有乙酸；酯類主要有乙酸乙酯、乳酸乙酯。因此，通過酵母液態(tài)發(fā)酵來評估酵母的風味特征，在一定程度上，能夠與其固態(tài)發(fā)酵的風味特征一致。

2.2.2 酵母高粱汁發(fā)酵液風味物質含量的測定

目前根據(jù)酵母的作用可以將酵母大致分成兩大類。一類是Saccharomycescerevisiae，主要完成酒精發(fā)酵，用于產酒精[21]。另一類是non-Saccharomyces，其發(fā)酵能力可能略有欠缺，但能夠合成多種酶，將原料中的前體物質轉換成風味物質如酯、酸、高級醇和醛等產物，可以賦予發(fā)酵食品優(yōu)良的風味、質地、色澤等品質[22]。

由圖2分析，酵母產酸能力雖然較低，但其產醇類物質以及酯類物質能力較強。其中IssatchenkiaorientalisHH-2 (東方伊薩酵母)產酸能力最強；產醇能力較強的為SaccharomycescerexisiaeK-7(釀酒酵母)、IssatchenkiaorientalisHX-11(東方伊薩酵母)和IssatchenkiaorientalisQC-1(東方伊薩酵母)；PichiaanomalaL3(異常畢赤酵母)的產酯能力最高，遠遠高于其他酵母，PichiaanomalaHX-2(異常畢赤酵母)的產酯能力約為IssatchenkiaorientalisQC-1(東方伊薩酵母)的一半，IssatchenkiaorientalisC-16(東方伊薩酵母)和PichiaanomalaY6(異常畢赤酵母)的產酯能力相近。定量測定酵母高粱汁發(fā)酵液風味物質含量對于選取組合酵母具有參考意義。

圖2 優(yōu)勢酵母高粱汁發(fā)酵液中酸、醇、酯含量比較圖Fig 2 Comparison of acid, alcohol and ester content in fermented sorghum juice by yeast

2.3 微生物組合發(fā)酵的白酒風味

2.3.1 設計組合方案

綜合前述對于細菌、霉菌、酵母糖化力及蛋白水解力的比較以及主要優(yōu)勢酵母風味評定分析，做出了如下4種組合方案并用于實驗室小型白酒固態(tài)發(fā)酵實驗。其中每種組合中都優(yōu)先選擇優(yōu)良酵母參與組合發(fā)酵。目前已有相關實驗分析，與單獨培養(yǎng)發(fā)酵相比,酵母的混菌發(fā)酵,能夠在白酒釀造中表現(xiàn)出更好的釀造水平。它們或者代謝產生、增強一些有益的風味化合物如苯乙醇、乙酸苯乙酯等,或者降解某些異味物質如乙酸、乙醛等,或者促進酵母的代謝性能,從而最終改變發(fā)酵產物的風味特征[23]。所以將酵母和其他菌株共同作為發(fā)酵起始菌種,為豐富發(fā)酵產物的風味復雜性和增強風格的獨特性提供了一條有效的途徑[23]。

組合1：選擇SaccharomycescerevisiaeC-1、IssatchenkiaorientalisHH-2、AspergillusoryzaeP6A-3為一組。C1雖然糖化力沒有其他酵母優(yōu)良但其為釀酒酵母，具有良好的發(fā)酵能力，同時在培養(yǎng)過程中顯示了良好的生存能力。HH-2為東方伊薩酵母，感官評定為水果味，能夠產生令人愉悅的風味物質。曲霉的選擇為米曲霉P6A-3。由數(shù)據(jù)分析可知，3株紅曲霉：中紅10號，紫紅紅曲 5024，紫紅紅曲XJ16糖化力和蛋白水解力都顯示出更高的水平，但是紅曲霉在培養(yǎng)過程中可能產生有毒物質，對于食品安全有威脅[24]，因此本研究選擇了更為安全的P6A-3作為培養(yǎng)菌株且其單菌培養(yǎng)過程中易于培養(yǎng)，綜合糖化力和蛋白水解力也較優(yōu)。

組合2：選擇SaccharomycescerevisiaeC-3、PichiaanomalaY-6、BacilluslicheniformisHX-50為一組。C-3為釀酒酵母，也用于產酒精。Y-6為異常畢赤酵母，感官評定時為焦糖味。HX-50為地衣芽胞桿菌，細菌蛋白水解力較強。目前白酒釀造研究的熱點之一就是釀酒酵母與非釀酒酵母組合發(fā)酵中酵母之間的相互影響和代謝產物的差異分析[23]。選取釀酒酵母C-3、產酯酵母Y-6和蛋白水解力較強的芽孢桿菌為組合發(fā)酵實驗提供實驗新路線。

組合3：選擇SchizosaccharomycespombeC-11、PichiaanomalaHX-2、Bacillussubtilis80為一組。C-11為粟酒裂殖酵母，其具有一定的糖化力，且可用于產酒精。HX-2為異常畢赤酵母，感官評定風味為果醋味，并且在酵母中具有較高的糖化力。80為枯草芽孢桿菌，細菌糖化力較為突出。

組合4：選擇SaccharomycescerevisiaeK-7、IssatchenkiaorientalisQC-1、BacillusamyloliquefaciensHX-45為一組。K-7為釀酒酵母，在高粱汁發(fā)酵中產醇能力較好，并且感官評定為蜂蜜味。QC-1為東方伊薩酵母，感官評定為水果味。HX-45為解淀粉芽孢桿菌，糖化力和蛋白水解力都名列前茅。

2.3.2 四種組合方案主要風味物質解析

圖3為4種組合方案中主要風味物質解析圖，結果分析可得組合1含量較高的物質半定量峰面積為：乙酸異戊酯21454，乙酸乙酯13263，丙酸乙酯760，丙酸異戊酯199，2-甲基丁酸乙酯135。組合2含量較高的物質半定量峰面積為：己酸乙酯1126，丁酸丁酯299，丙酸丁酯89，戊酸乙酯44，乙酸異戊酯20。組合3含量較高的物質半定量峰面積為：甲酸異戊酯11，乙酸乙酯6.36，乙酸異戊酯5.20，庚酸2.38，正己酸乙酯1.76。組合4含量較高的物質半定量峰面積為：3-辛醇3.95，丁酸1.77，1-辛烯-3-醇1.32，1-辛醇0.82，己酸0.81。相較于其他組合，組合1產酯能力較強，且發(fā)酵后蒸餾的白酒風味更宜人。

圖3 四種組合方案主要風味物質GC-MS半定量峰面積對比圖Fig.3 Comparison of GC-MS semi-quantitative peak areas of major flavor compounds in four combinations

圖4比較了4個組合主要風味物質的含量，包括三大醇(乙醇、異戊醇、異丁醇)、兩大酯(己酸乙酯、乙酸乙酯)以及丁酸。醇類對形成酒的風味和促使酒體豐滿、濃厚起著重要的作用；也是酯類的前驅物質。酯類是具有芳香的化合物，在各種香型白酒中起著重要作用，是形成酒體香氣濃郁的主要因素。酸類影響白酒的口感和后味，酸不足是造成后味寡淡的主要原因。

圖4 重要風味物質含量對比Fig.4 Comparison of the content of important flavor substances

結合感官評定，得到4個組合中風味最好的是組合1，它的醇和酯的總含量最高，主要體現(xiàn)水果味。近年來，白酒質量與安全已經成為消費者關注的重點。目前消費者關注的酒類中高級醇含量較高而由此帶來的健康問題值得注意。雖然高級醇的微弱毒性不足以為其做限量標準，但在越來越注重健康的今天，白酒的適口性及飲用后的體驗也更多地被關注[25]。為了進一步分析組合1的發(fā)酵產物是否具有食品安全可靠性，本文對比相關數(shù)據(jù)得出如下結論：組合1醇類物質含量較高，其總醇含量為74.24 mg/L。通過相關儀器測定組合1蒸餾的高粱酒中異丁醇的含量為0.28 mg/L，異戊醇的含量為3.85 mg/L。純凈的雜醇油具有刺鼻的氣味和辛辣味，含量如果超過100 mg/L時，飲用后易“上頭”，對人體有較大的傷害，且以異丁醇和異戊醇的毒性為主。以上對比分析組合1中高級醇的含量低于相關衛(wèi)生指標。且白酒中都含有一定量的高級醇類，高級醇類是白酒中重要的風味物質，適量的高級醇類能賦予白酒濃郁、芬芳、醇甜等特殊感官特征。所以作為飲料酒，在蒸餾時因釀酒師掌握溫度的技藝不同，會使酒中雜醇油的含量不同。高質量的白酒，雜醇油含量一般可控制在50 mg/L左右，既保證了酒的風格，適量飲用后又不會對人體產生有害作用[26]。

3 結論與討論

為了驗證微生物發(fā)酵高粱可以產生果酒的香氣，將組合1與實驗室已有的桑葚酒和橘子酒風味物質進行對比。組合1經發(fā)酵蒸餾后的高粱酒中含量較高的幾種物質分別是乙酸異戊酯，乙酸乙酯，2-甲基丁酸乙酯，乙醇，異戊醇。高粱酒與桑椹酒、橘子酒2個果酒中含量較高的醇、酸、酯類物質的濃度對數(shù)的對比發(fā)現(xiàn)，水果酒中的重要風味物質，在高粱酒中也有體現(xiàn)。

同時查閱相關文獻對比了該組合發(fā)酵所得白酒與自然混菌發(fā)酵白酒的風味差別[27]。其中組合1中乙酸乙酯濃度為3 099.78 mg/L，辛酸乙酯為5.17 mg/L。自然混菌發(fā)酵白酒乙酸乙酯約為950.01 mg/L，辛酸乙酯為2.72 mg/L。研究表明當白酒中乙酸乙酯濃時呈蘋果香、香蕉香,稀薄時呈梨香。組合1中乙酸乙酯濃度較高，也含有少量辛酸乙酯，十六酸乙酯等。其量雖少但閾值低，對口感影響較大。除含有酯類等香味物質外，組合1中還含有酸類物質如乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸、異戊酸，己酸等。存在一定的酸類物質，可使得酒體飽滿，易于老熟，經過一定時間的儲存可有陳香味。組合1蒸餾所得白酒雖然與其他自然混菌發(fā)酵白酒相比還存在一定差距，但在中國白酒品類日新月異的發(fā)展中，可以為釀造優(yōu)質多元化白酒提供組合微生物的新思路。

目前組合發(fā)酵釀造白酒已有許多成功案例[28-31]。有針對性地培養(yǎng)篩選優(yōu)良的功能微生物，分析各功能菌株及其代謝產物的生態(tài)關系和作用機理，使混菌發(fā)酵以最高效穩(wěn)定的方式釀造白酒，將有效解決傳統(tǒng)經驗式操作，減少釀造微觀環(huán)境的不確定因素引起微生態(tài)的改變對白酒釀造的不良影響，對白酒的風味控制和產量有著非常重要的意義。但是對于白酒發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌株互作及其應用還需進一步完善：

(1)白酒的生產過程具有粗放性，它是一個多菌多酶混合發(fā)酵的過程。目前本研究僅選擇組合了4種微生物，而其他種類繁多的微生物也參與了白酒發(fā)酵過程中代謝調控，其中包括可分離培養(yǎng)的及眾多的暫未能夠分離出來的菌種，而揭開白酒釀造神秘的面紗離不開對環(huán)境中所有微生物的認識，離不開對所有微生物間相互作用的研究。

(2)同時本次研究并未深入研究釀造菌株之間的相互作用，對是否只是單純的菌株強強加和效果，還是存在菌株互配、競爭抑制及更深層次的原因還有待研究。

(3)后續(xù)的研究重點可以放在組合功能微生物之間互作代謝研究及發(fā)酵工藝條件，從而在釀造過程中產生具有特殊風味及香型的白酒，以提高白酒的口感與品質。