匍枝根霉誘變株β-葡萄糖苷酶結(jié)構(gòu)功能研究及發(fā)酵優(yōu)化

鄭賢金，湯斌

(安徽工程大學 生物與化學工程學院，安徽 蕪湖，241000)

β-葡萄糖苷酶(β-glycosidase，BG)，又稱纖維二糖酶，在食物增香、減少大豆熟糖漿造成的苦味、糖尿病治療等方面具有重要作用[1-2]。尤為重要的是，在纖維素酶協(xié)同降解纖維素的過程中，BG可將纖維二糖分解成葡萄糖，因而可以有效解除降解過程中纖維二糖過度積累對外切酶和內(nèi)切酶的限制[3]，提高纖維素酶的利用效率。然而，除黑曲霉外，目前常用于生產(chǎn)的木霉、青霉等菌株中內(nèi)切酶和外切酶所占比例較高，而BG則相對不足[4]。蘇龍等[5]對羅爾夫青霉HXL發(fā)酵條件進行優(yōu)化，發(fā)酵7 d后BG酶活達到21.68 U/mL(等同于21.68 IU/mL)；陳娜等[4]通過對黑曲霉TJ02進行誘變選育及發(fā)酵條件優(yōu)化，BG酶活達到39 IU/mL。BG酶活的提高可有效促進纖維素向葡萄糖的轉(zhuǎn)化[6]，因此提高BG產(chǎn)量對纖維素的降解具有重要意義。

本文所使用出發(fā)菌株匍枝根霉TZ-03為本實驗室對原菌TP-02誘變選育所得，其BG酶活較原菌提高1.52倍。且匍枝根霉具有發(fā)酵時間短的優(yōu)勢，因此若能進一步提高BG產(chǎn)量則會有重要的工業(yè)應用價值。

本文初步分析了誘變后TZ-03菌株BG酶活提高的原因，并通過搖瓶優(yōu)化培養(yǎng)基組分及10 L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)TZ-03，顯著提高了BG酶活，為今后BG的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

匍枝根霉TZ-03，對本實驗室保藏菌株匍枝根霉TP-02進行紫外-甲基磺酸乙酯復合誘變所得。具體條件：濃度107～108個/mL的TP-02孢子懸浮液8 mL加入2 mL甲基磺酸乙酯，將其置于90 W紫外燈下照射5 min后用10% NaS2O3溶液終止反應。

匍枝根霉TP-02，E.coliJM109由安徽工程大學3R實驗室保藏；pUCM-T載體，上海生工生物有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒、T4DNA ligation、EcoR I、蛋白Marker等，寶生物(大連)有限公司。其他常用藥品購于國藥集團。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：100 g/L麩皮浸出汁(100 g新鮮麩皮加入1 000 mL蒸餾水，煮沸30 min，6層紗布過濾并最終定容至1 000 mL)，121 ℃滅菌20 min。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：稻草粉(80目) 20 g/L、豆粕粉10 g、50 g/L麩皮浸出汁、CaCl22 g/L、MgSO4·7H2O 3 g/L、KH2PO43 g/L、PEG-4000 0.25 g/L、Tween 80 200 μL/L、微量元素液1 mL/L，121 ℃滅菌20 min。

微量元素溶液(mg/L)：FeSO4·7H2O 5、MnSO4·H2O 1.6、ZnSO4·7H2O 1.4、CoCl2·2H2O 2。

LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基等參考文獻[7]。

1.3 儀器與設(shè)備

BIOTECH-10JSA-3000PLC自動發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備工程有限公司；TC312 PCR儀，美國TECH公司；Allg642高速冷凍離心機，美國貝克曼公司；TL988實時熒光定量PCR儀，西安天隆科技有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 誘變前后BG酶活及轉(zhuǎn)錄水平的比較

將匍枝根霉TZ-03斜面接種至種子培養(yǎng)基中，200 r/min，30 ℃條件下培養(yǎng)24 h后按10%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)5 d，每12 h測定1次BG酶活；對培養(yǎng)24 h后的種子液進行預處理，利用Trizol法提取總RNA，試劑盒法去除基因組DNA并通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用RT-PCR檢測bgl4的轉(zhuǎn)錄水平[8-9]。

1.4.2誘變株BG編碼基因bgl4的獲取

采用CTAB法提取基因組[8]。根據(jù)GenBank上已公布的相關(guān)BG基因序列的保守序列比對分析設(shè)計引物1-F和1-R(表1)，以基因組為模板擴增目的條帶，PCR產(chǎn)物切膠回收，連接pUCM-T載體，轉(zhuǎn)化E.coliJM109，挑選陽性轉(zhuǎn)化子[9]，送上海生工測序，其中PCR程序為95 ℃ 2 min，94 ℃ 50 s，45 ℃ 50 s，72 ℃ 90 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計引物，利用熱不對稱PCR補全上下游片段，其中上游片段設(shè)計引物SP1、SP2、SP3；下游設(shè)計的引物SP4、SP5、SP6。再根據(jù)補全的完整基因序列設(shè)計引物2-F和2-R，以基因組為模板，擴增目的基因，測序進行驗證，PCR程序為95 ℃ 2 min，94 ℃ 50 s，53 ℃ 50 s，72 ℃ 90 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.4.3 BGL IV生物信息學分析

利用DNAMAN軟件將匍枝根霉TZ-03的BG基因bgl4和TP-02的BG基因bgl序列翻譯成對應的氨基酸序列，并將氨基酸上傳至Swiss model數(shù)據(jù)庫(https://www.swissmodel.expasy.org/i)，通過選取自由能最低的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型為模板進行同源建模。并利用Discovery Studio 3.0軟件，以纖維二糖為配體進行分子對接，進行結(jié)構(gòu)功能分析。

1.4.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

分別以質(zhì)量分數(shù)為2%的玉米淀粉、蔗糖、葡萄糖、糊精、木糖、纖維二糖、乳糖、麩皮粉、微晶纖維素、CMC、可溶性淀粉、殼聚糖為碳源進行碳源優(yōu)化，對照組為稻草粉，培養(yǎng)條件為250 mL錐形瓶裝液80 mL，30 ℃，200 r/min，接種量10%，以BG酶活為指標，確定最佳碳源；在上述優(yōu)化基礎(chǔ)上，調(diào)整氮源種類為質(zhì)量分數(shù)1%的硫酸銨、胰蛋白胨、氯化銨、大豆蛋白胨、魚粉蛋白胨、乳清粉、豆渣粉、酵母粉、玉米漿、黃豆粉和質(zhì)量分數(shù)0.5%的尿素，以BG酶活為指標，確定最佳氮源；上述碳氮源優(yōu)化的基礎(chǔ)上，向培養(yǎng)基中添加已過濾除菌的各種氨基酸，使其終濃度為0.1%，以不加氨基酸為對照組，確定最佳氨基酸添加種類。

1.4.5 10 L發(fā)酵罐放大實驗

培養(yǎng)基為搖瓶優(yōu)化最優(yōu)培養(yǎng)基，10 L發(fā)酵罐裝液量5 L，初始pH值4.8，溫度為30 ℃，接種量為10%，初始轉(zhuǎn)速300 r/min，初始罐壓0.06 MPa。在發(fā)酵過程中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、通氣量和罐壓維持溶氧在30%左右；調(diào)節(jié)磷酸和氨水控制pH值維持在4.8左右；發(fā)酵24 h后控制補料量(20%淀粉水解液)，使發(fā)酵液中還原糖的含量在1.2 mg/mL左右。

1.4.6 BG酶活測定

取發(fā)酵液1.2 mL于1.5 mL離心管中，3 500 r/min離心10 s后，將上清液用0.05 mol/L pH值4.8檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液稀釋適當倍數(shù)用于酶活測定。以質(zhì)量分數(shù)為1%水楊苷溶液1 mL為底物，按文獻的方法測定β-葡萄糖苷酶酶活[10]。

酶活定義：適當反應條件下，每分鐘水解底物生成1 μmol還原糖所需的酶量即為1個酶活單位，表示為IU/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘變前后BG及轉(zhuǎn)錄水平的比較

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，原始菌株TP-02和突變株TZ-03的BG酶活如圖1-a所示，TP-02的BG酶活在84 h達到4.12 IU/mL，誘變后TZ-03則在108 h達到BG酶活峰值10.53 IU/mL，酶活提高了1.52倍。TP-02的BG基因bgl和TZ-03的BG基因bgl4的轉(zhuǎn)錄水平如圖1-b所示，2個基因拷貝數(shù)分別為3.18×107和3.12×106，誘變后轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)90.19%。轉(zhuǎn)錄水平的提高可導致蛋白表達量的提高，故而很可能引起B(yǎng)G酶活提高。

圖1 BG酶活(a)及轉(zhuǎn)錄水平比較(b)Fig.1 The comparison of β-glycosidase activity(a) and transcriptional level(b)

2.2 誘變株BG編碼基因bgl4的克隆

以基因組為模板，克隆得到的1條1 500 bp左右的條帶(圖2)，經(jīng)測序，結(jié)果顯示該目的基因全長為1 479 bp，共編碼492個氨基酸。

M-Marker；1,2-目的條帶圖2 bgl4基因的克隆Fig.2 Cloning of bgl4 gene

2.3 BGL IV生物信息學分析

利用CLUSTALW在線工具對BGL和BGL IV的氨基酸序列進行比對。結(jié)果如圖3所示，與BGL氨基酸序列相比，BGL IV頭尾的部分氨基酸發(fā)生了替換和缺失，此外在242～272位之間多了一段氨基酸序列。紫外誘變易引起堿基轉(zhuǎn)換、顛換、移碼突變或缺失，從而可能造成其編碼氨基酸的小范圍改變[11]；而化學誘變劑則可能會與核苷結(jié)構(gòu)的磷酸反應，形成酯類而將核苷酸從磷酸與糖分子之間切斷，造成染色體數(shù)量變化[12]。因此誘變后氨基酸序列的改變可能是紫外和甲基磺酸乙酯2種誘變方式共同作用的結(jié)果。

圖3 BGL氨基酸序列與BGL IV氨基酸序列的差異Fig.3 The difference of amino acid sequence between BGL IV and BGL

利用Swiss model對BGL和BGL IV進行同源建模，并以纖維二糖為底物，利用Discovery Studio 3.0軟件進行分子對接，從而對誘變前后結(jié)構(gòu)功能的變化進行分析，其結(jié)果如圖4所示。圖4-a為突變前BGL的分子表面，可以看出酶分子內(nèi)部形成了一個口袋，與底物相互作用，纖維二糖結(jié)合到口袋深處；圖4-b表示參與纖維二糖配體形成氫鍵的氨基酸殘基，突變之前，共有ASN242、TYR315、Glu384、Glu173和Trp442等5個氨基酸可以與纖維二糖，結(jié)合，形成6個氫鍵這些氨基酸是關(guān)鍵的氨基酸，在酶的催化過程中有著不可替代的作用。

誘變之后的分子表面圖4-c顯示，誘變后活性中心遷移，結(jié)合區(qū)域由口袋深處變淺，這種結(jié)構(gòu)可能使得活性中心更大，一定程度上解決了原中心存在的受力不均、底物堆積等問題，可能使酶分子更快速高效地與底物發(fā)生相互作用。同時誘變之后，結(jié)合區(qū)域的關(guān)鍵氨基酸發(fā)生顯著變化。與纖維二糖形成氫鍵的氨基酸有Ala11，Gln70，Ala456，Tyr454，Ala71，Cys67，共形成9個氫鍵，氫鍵數(shù)量增加[13-14]。誘變后結(jié)構(gòu)的改變可能更有利于酶與底物的結(jié)合，對酶活的提高也有一定的促進作用。

a-TP-02分子表面的結(jié)構(gòu);b-TP-02參與形成氫鍵的關(guān)鍵氨基酸；(c)-TZ-03分子表面的結(jié)構(gòu)；d-TZ-03參與形成氫鍵的關(guān)鍵氨基酸。虛線表示氫鍵圖4 BGL和BGL IV與底物結(jié)合的結(jié)構(gòu)Fig.4 Structure of BGL-cellobiose complex and BGL IV-cellobiose complex

2.4 培養(yǎng)基優(yōu)化

2.4.1 碳氮源對BG酶活的影響

碳氮源在微生物的生長過程中具有重要作用，除提供基本營養(yǎng)物質(zhì)以外，碳源還可提供細胞及產(chǎn)物合成的碳架，氮源則可提供微生物生長所需核苷酸、維生素和礦物質(zhì)元素等物質(zhì)合成的原料[15-16]。碳源對BG酶活的影響如圖5-a所示，對照組(稻草粉)酶活達到10.53 IU/mL，與其相比，葡萄糖、纖維二糖等糖類碳源的BG酶活普遍較低，而纖維素類碳源BG酶活較高，以麩皮粉為碳源的酶活達到11.47 IU/mL。當以2%微晶纖維素為碳源時，BG酶活在108 h達到峰值14.41 IU/mL，與對照組相比提高了36.8%。

確定碳源為微晶纖維素的基礎(chǔ)上，選取不同氮源進行發(fā)酵，結(jié)果如圖5-b所示。總體而言，與有機氮源相比，無機氮源發(fā)酵的整體效果較差，其中無機氮源中氯化銨最高酶活只有6.43 IU/mL，而有機氮源成分較為復雜，其中含有的維生素、微量元素、生長因子等可能會促進微生物繁殖和產(chǎn)酶，因此BG酶活普遍較高。當魚粉蛋白胨作為氮源時，其最高BG酶活可在108 h達到18.30 IU/mL，與氮源優(yōu)化前相比，提高30.5%。

a-碳源優(yōu)化；b-氮源優(yōu)化圖5 碳氮源優(yōu)化對BG酶活影響Fig.5 Effect of carbon sources and nitrogen sources on β-glycosidase activity

2.4.2 氨基酸添加對BG酶活的影響

通過往培養(yǎng)基中添加不同種類的氨基酸，研究氨基酸對BG酶活的影響，結(jié)果如圖6所示。半胱氨酸、谷氨酸、組氨酸的添加對BG酶活影響較大，其中以谷氨酸的提高為最，其BG酶活在108 h可達22.15 IU/mL。氨基酸的添加可能會影響金屬離子與相關(guān)蛋白質(zhì)的結(jié)合[17]，從而對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)起穩(wěn)定作用，且氨基酸的加入可能會影響纖維素酶吸附結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)，提高表面有效酶的濃度[18]。

圖6 氨基酸添加對BG酶活影響Fig.6 Effect of amino acid addition on β-glycosidase activity

2.5 10 L發(fā)酵罐放大實驗

根據(jù)搖瓶優(yōu)化，確定最優(yōu)培養(yǎng)基為：微晶纖維素20 g/L、魚粉蛋白胨10 g/L、麩皮浸出汁50 g/L、CaCl22 g/L、KH2PO43 g/L、MgSO4·7H2O 3 g/L、谷氨酸1 g/L、PEG-4000 0.2 g/L、Tween 80 200 μL/L、微量元素液1 mL/L，以上培養(yǎng)基進行10 L發(fā)酵罐直接放大實驗。同等條件下?lián)u瓶發(fā)酵作為對照，比較發(fā)酵過程中BG酶活和殘?zhí)堑淖兓?。如圖7(b)所示，0～3.5 h溶氧基本維持在95%左右，pH在4.3附近，這段時間菌體生長較為緩慢；4 h后溶氧和pH均快速下降，8.5 h溶氧下降到20.8%，9.5 h下降到9.85%，pH值下降到3.6，且還原糖快速下降，說明菌體在這段時間消耗糖類物質(zhì)大量生長繁殖，其中產(chǎn)生的酸性物質(zhì)使pH值下降；之后溶氧開始逐漸上升，13.5 h上升到18.72%，20.5 h溶氧為31%，期間pH值也略微上升，可能是產(chǎn)生的某些酸性物質(zhì)被菌體生長所利用，40 h后pH值基本維持在4.2左右。直接進行放大實驗，BG酶活在72 h達到峰值27.15 IU/mL，同批次搖瓶發(fā)酵BG酶活在108 h達到峰值22.86 IU/mL。與搖瓶發(fā)酵相比，上罐發(fā)酵的酶活提高并不顯著，可能是因為發(fā)酵過程中的溶氧和pH值不合適所致[19]。不控制溶氧情況下中間有接近4 h溶氧低于10%，溶氧過低可能會產(chǎn)生對酶活造成嚴重影響的代謝物質(zhì)，同時在過低的pH值條件下，BG酶活較不穩(wěn)定，這些因素可能導致BG酶活偏低。

a-殘?zhí)呛虰G酶活曲線;b-上罐過程中溶氧和pH值變化曲線圖7 搖瓶發(fā)酵與上罐發(fā)酵比較Fig.7 Comparison of fermentation process in shake flask and 10 L tank

在此基礎(chǔ)上，發(fā)酵過程中控制溶氧在30%左右，pH值控制在4.8左右，同時考慮到發(fā)酵后期發(fā)酵液中還原糖含量僅有0.5 mg/mL，因此在發(fā)酵24 h后通過往發(fā)酵液中補充質(zhì)量分數(shù)為20%的淀粉水解液并控制其補料速率，使殘?zhí)呛烤S持在1.2 mg/mL左右。其結(jié)果如圖8所示，BG酶活在84 h達到峰值41.62 IU/mL，與未調(diào)控的實驗組相比酶活提高了53.3%。

a-殘?zhí)呛虰G酶活曲線；b-上罐過程中溶氧和pH值變化曲線圖8 最優(yōu)條件下10L發(fā)酵罐放大實驗Fig.8 Fermentation tank amplification culture under optimum conditions

3 討論

本論文所使用出發(fā)菌株匍枝根霉誘變株TZ-03的BG酶活較原菌提高了1.52倍。誘變后bgl4基因的轉(zhuǎn)錄水平較初始提高90.19%，轉(zhuǎn)錄水平的提高可導致蛋白表達量的提高，很可能引起B(yǎng)G酶活的提高。對BGL和BGL IV的結(jié)構(gòu)功能研究時發(fā)現(xiàn)，誘變后活性中心發(fā)生構(gòu)象變化，一定程度上解決了原中心存在的受力不均、底物堆積等問題，可能對酶活的提高也有一定的促進作用。這些發(fā)現(xiàn)可為后續(xù)對BG結(jié)構(gòu)功能改造及纖維素酶系組成優(yōu)化提供一定的思路。為進一步提高BG酶活，對搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基組分、10 L發(fā)酵罐發(fā)酵參數(shù)進行優(yōu)化，最終使BG酶活在84 h可達峰值41.62 IU/mL，為BG的工業(yè)化應用奠定了一定的基礎(chǔ)。本文對誘變后BG酶活差異內(nèi)因進行初步分析并通過發(fā)酵優(yōu)化提高了BG酶活，為后續(xù)對BG的研究提供一定的方向。