白妍,李苑,,葛雨珺,,余海霞,楊水兵,陳士國,胡亞芹,*
(1.浙江大學食品與營養(yǎng)系,浙江省農產品加工技術研究重點實驗室,馥莉食品研究院,杭州 310058;2.浙江大學舟山海洋研究中心,浙江 舟山 316021)
小黃魚(Larimichthyspolyactis),是鱸形目、石首魚科、黃魚屬魚類[1],在中國渤海、黃海、東海等海域廣泛分布,為中國主要經濟魚類之一,含有豐富的蛋白質、維生素等營養(yǎng)成分,味道鮮美,深受廣大消費者喜愛。由于小黃魚在捕撈加工過程中易受污染,易腐敗變質,造成營養(yǎng)成分流失而嚴重影響其口感[2],因此在捕獲后需凍結保藏。因小黃魚個體較小,普通凍結易發(fā)生干耗、脂肪氧化、體表黃色蛻變等現象,解凍后口感和風味受到破壞,食用品質大大降低。已有研究表明,不同的凍結處理方式會影響魚類產品的品質。Cai等[3]對比了不同凍結方式對日本鱸品質的影響,結果表明,-55 ℃凍結(-18 ℃貯藏)更有利于維持日本鱸的品質;胡亞芹等[4]研究表明,與傳統(tǒng)凍結相比,液氮速凍可以更好地維持帶魚的凍藏品質;歐陽杰等[5]發(fā)現采用三元載冷劑浸漬凍結(ICF)的草魚塊品質優(yōu)于傳統(tǒng)鼓風凍結。因此,為了提高貯藏期間小黃魚的品質,研究不同凍結方式處理后小黃魚品質的變化規(guī)律具有重要的現實意義,而各種凍結方式對小黃魚長期凍藏品質影響的研究還未見報道。
液氮無色、無味,化學性質穩(wěn)定,常用作載冷劑。由于液氮速凍具有速度快、產量高、質量好、干耗小、抗氧化、雜菌少、設備占地面積小、操作方便、環(huán)境友好等優(yōu)點,已逐漸成為中國食品行業(yè)中環(huán)保冷凍技術研究的熱點[4]。本研究以舟山采集的新鮮小黃魚為研究對象,以3種不同的凍結方式進行處理:傳統(tǒng)凍結、平板凍結、液氮速凍,置于-18 ℃貯藏210 d,根據貯藏過程中的理化指標(pH、TVB-N含量、TBA含量、Ca2+-ATPase活性、鹽溶性蛋白含量、總巰基含量、失水率、電導率)、質構品質、感官品質和微觀結構等4個方面進行評價,研究不同凍結方式處理下小黃魚肌肉品質的變化規(guī)律,探究最適于保持小黃魚肌肉品質的凍結貯藏技術,為小黃魚的保鮮研究提供理論參考和技術支持。
新鮮鮮活小黃魚購于浙江省舟山市沈家門碼頭,挑選個體均一[(100~130)g]、肉質較硬、無異味的小黃魚,約180尾冰盒保存并于30 min內運至實驗室進行不同方式的凍結預處理。
主要包括DS-1高速組織搗碎機(上海標本模型廠);YD-A生物組織攤片機(浙江金華市益迪醫(yī)療設備有限公司);G2-38B漩渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);BS223 S電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);MODEL UB200i顯微鏡(重慶奧普光電技術有限公司);EF20K pH計(上海梅特勒托利多儀器有限公司);UV-2550紫外分光光度計(日本島津公司);DKS-12電熱恒溫水浴鍋(嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司);液氮深冷速凍機(浙江省興業(yè)集團有限公司);YD202A石蠟切片機(浙江金華市益迪醫(yī)療設備有限公司);YD-B生物組織烤片機(浙江金華市益迪醫(yī)療設備有限公司);平板單凍機(浙江省興業(yè)基團有限公司)。
1.3.1 小黃魚的預處理
將新鮮小黃魚暫時保存在冰盒內,并于30 min內運至實驗室,冰水洗凈。
1.3.2 凍結貯藏方式
傳統(tǒng)凍結貯藏(L組):將流水沖洗3 min后的小黃魚放入-80 ℃的冰箱中進行降溫,待中心溫度達到-18 ℃時,置于-18 ℃的條件下貯藏。
平板凍結貯藏(D組):將流水沖洗3 min后的小黃魚放入平板速凍裝置(-30 ℃,恒溫)進行處理,待中心溫度達到-20 ℃時,置于-18 ℃的條件下貯藏。
液氮凍結貯藏(Y組):將流水沖洗3 min后的小黃魚放入液氮設備中進行處理,待中心溫度達到-60 ℃時,置于-18 ℃的條件下貯藏。
1.3.3 小黃魚解凍工藝
參考歐陽杰等[5]的研究方法,進行流水解凍:將包裝袋中的冷凍小黃魚置于流動自來水下,溫度控制在(15.0±0.5)℃,流速約為10 L/min,解凍至中心溫度達到5 ℃時,視為完全解凍,然后取出進行各指標測定。
1.3.4 理化指標
1)pH的測定
小黃魚pH的測定參考Chang等[6]的研究方法。
2)揮發(fā)性鹽基氮含量的測定
揮發(fā)性鹽基氮(total volatile basic-nitrogen,TVB-N)含量的測定采用GB/T5009.44—2003半微量定氮法[7]。
3)肌原纖維的提取
肌原纖維的提取參考萬建榮等[8]、李學鵬等[9]以及董開成等[10]的研究方法,略有改動:稱取預處理后的小黃魚肉2 g,加入預冷的高離子鹽溶液(0.1 mol/L KCl-0.01 mol/L Na2CO3-0.04 mol/L NaHCO3)20 mL,振蕩混合均勻,加入冰水20 mL進行稀釋并搖勻,離心(4 000 r/min,10 min),棄上清液并取沉淀物,以上步驟重復3次,得到肌原纖維沉淀物,并定容至100 mL以獲得肌原纖維懸濁液,用于測定Ca2+-ATPase活性、總巰基以及鹽溶性蛋白質含量。
4)肌肉Ca2+-ATPase活性的測定
Ca2+-ATPase的測定參考萬建榮等[8]與趙亞等[11]以及Yuan等[12]的研究方法。
5)硫代巴比妥酸值(TBA)的測定方法
硫代巴比妥酸值(TBA)的測定參照田光娟等[13]的方法。
6)總巰基含量的測定方法
總巰基含量的測定參考馮靜等[14]的方法。
7)鹽溶性蛋白含量的測定方法
采用高鹽溶液與低鹽溶液中的蛋白質含量之差測定鹽溶性蛋白含量。稱取兩份1.3.3中處理的小黃魚肉(每份2 g),分別加入20 mL高離子磷酸緩沖液(0.03 mol/L Na2HPO4-0.5 mol/L KCl-0.01 mol/L NaH2PO4)和20 mL低離子磷酸緩沖液(0.025 mol/L NaH2PO4-0.025 mol/L Na2HPO4),攪拌均勻,前者靜置3 h,后者靜置1 h,離心(4 000 r/min,10 min),在上清液中加入15 %的三氯乙酸10 mL,靜置后加入1 mol/L NaOH溶液20 mL,再分別以高鹽磷酸緩沖液和低鹽磷酸緩沖液定容至50 mL,用雙縮脲法測定蛋白質的含量[15-16]。
8)失水率的測定
失水率的測定參考郭學騫等[17]的方法。
9)電導率的測定
電導率的測定參考張麗娜等[18]的方法。
1.3.5 質構品質評定
小黃魚質構特性測定參考王漢玲等[19]與任范偉等[20]的方法,略有改動:取預處理后的小黃魚塊,采用Brookfield公司的CT V1.6進行測定,測定的速度為1 mm/s,返回的速度為1 mm/s,循環(huán)次數為2。
1.3.6 感官品質評定
感官評定的方法參考董開成等[21]和藍蔚青等[22]的評定方法:挑選10位經過培訓的人員(男女比例為1∶1)進行感官描述檢驗,按照表1中的標準,從色澤、氣味及滋味、組織形態(tài)、組織彈性等4個方面對預處理后的小黃魚進行打分。最終感官評分結果為去掉1個最高分和1個最低分后的平均值。
表1 小黃魚評分表Tab.1 Sensory assessment of Larimichthys polyactis
1.3.7 微觀結構評價
小黃魚的顯微鏡處理主要參考董開成等[21]、楊宏旭[23]、劉大松[24]以及闕婷婷[25]的方法,將處理后的樣品用顯微鏡進行觀察,拍攝顯微鏡圖像。
實驗指標均平行測定3次,實驗數據采用Excel和SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件進行分析,采用Duncan法進行不同處理間的多重比較,圖中同一貯藏時間內不同字母表示差異顯著(P<0.05)。
2.1.1 不同凍結方式對小黃魚pH的影響
水產品pH會隨其新鮮度的變化而變化。由圖1可知,不同實驗組小黃魚的pH呈現先下降后上升的趨勢,因為當小黃魚一旦離開水介質停止呼吸,體內的糖原會被相關酶分解,不斷積累的乳酸使肌肉pH不斷降低;隨后肌肉中的蛋白質分解,同時微生物的作用使堿性物質不斷積累,使小黃魚pH升高[4]。L組與D組45 d時pH開始上升,而Y組pH在75 d左右開始上升,表明液氮凍結可以延緩微生物繁殖以及堿性物質的產生。
圖1 不同凍結方式對小黃魚pH的影響同一貯藏時間內不同字母表示差異顯著(P<0.05)。Fig.1The effects of different freezing methodson pH value in Larimichthys polyactisDifferent letters above the bars indicate sinficant differencesamong the same storage time(P<0.05).
2.1.2 不同凍結方式對小黃魚揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)含量的影響
TVB-N含量是評價水產品是否腐敗變質的重要指標之一,TVB-N含量越低,水產品的新鮮度越高。TVB-N含量反映了在內源性水解酶和微生物的作用下,水產品中蛋白質和其他物質分解產生的具有揮發(fā)性的氨、二甲胺、三甲胺的情況[26]。根據中國新鮮、冷凍小黃魚行業(yè)標準(SC/T 3101—2010《鮮大黃魚、凍大黃魚、鮮小黃魚、凍小黃魚》)[27]中的規(guī)定:一級品小黃魚TVB-N含量不大于13×10-2mg/g,合格品小黃魚不大于30×10-2mg/g。
由圖2可知,小黃魚TVB-N含量隨時間的延長不斷升高,表明其鮮度逐漸下降。三組中,L組小黃魚在貯藏過程中鮮度降低最快,貯藏至45 d時,TVB-N含量顯著高于其他兩組(P<0.05),接近一等品臨界值13×10-2mg/g;Y組的小黃魚TVB-N含量在貯藏前180天均小于13×10-2mg/g,屬于一級品;D組TVB-N含量居中??梢姡c其他兩種凍結方式相比,液氮凍結方式可能通過降低冰晶對蛋白質的機械損傷,從而防止肌球蛋白重鏈發(fā)生變性[28],保持小黃魚的鮮度。
圖2 不同凍結方式對小黃魚TVB-N含量的影響Fig.2The effects of different freezing methodson TVB-N content in Larimichthys polyactis
2.1.3 不同凍結方式對小黃魚Ca2+-ATPase活性的影響
Ca2+-ATPase活性是用于評價小黃魚在貯藏過程中蛋白質性質的重要指標,可以反映肌球蛋白的完整程度。Ca2+-ATPase活性越高,說明肌球蛋白越完整[12],小黃魚的品質越高。
由圖3可知,小黃魚Ca2+-ATPase活性隨著時間的延長不斷下降,這可能與肌球蛋白的球狀頭部構型的改變以及蛋白質的凝聚有關,總巰基的氧化使得二硫鍵發(fā)生交聯,導致Ca2+-ATPase活性迅速下降[4]。貯藏至第90天時,L組、D組、Y組小黃魚的Ca2+-ATPase活性較初始值分別下降了80.92%、61.85%、40.92%,Y組Ca2+-ATPase值降低程度顯著低于其他兩組(P<0.05),說明液氮凍結可以較好地減緩小黃魚Ca2+-ATPase活性的降低,減少二硫鍵發(fā)生交聯,保持了小黃魚蛋白質的性質。
圖3 不同凍結方式對小黃魚Ca2+-ATPase活性的影響Fig.3The effects of different freezing methodson Ca2+-ATPase activity in Larimichthys polyactis
2.1.4 不同凍結方式對小黃魚硫代巴比妥酸(TBA)值的影響
TBA值反映小黃魚脂肪氧化腐敗程度,是評價水產品中脂肪氧化的重要指標。TBA值越高,脂肪氧化程度越大,小黃魚品質越低。由圖4可知,小黃魚TBA值隨著時間的延長不斷上升,前30天增長迅速,后期增長減慢,可能是因為在凍結的不同時期,小黃魚自由水含量的變化導致組織液濃度的變化,從而導致脂肪氧化速度的不同[29]。L組小黃魚TBA值上升速率最快,Y組凍結最慢,可能是由于傳統(tǒng)凍結速率較慢,凍結過程中形成的冰晶體較大,對魚肉細胞的機械造成較大損傷,暴露在空氣中的損傷面積較大,導致脂肪氧化程度較高[30];而液氮凍結速度快,形成的冰晶小,液氮凍結處理的小黃魚脂肪氧化緩慢。
圖4 不同凍結方式對小黃魚TBA值的影響Fig.4The effects of different freezing methodson TBA value in Larimichthys polyactis
2.1.5 不同凍結方式對小黃魚總巰基含量的影響
由于蛋白質中的自由巰基(-SH)可發(fā)生氧化反應形成二硫鍵(-S-S-),且在劇烈的氧化條件下還可以生成亞砜等氧化產物[31],因此總巰基含量是蛋白氧化程度的重要指標。總巰基含量越低,蛋白質氧化程度越高,小黃魚品質越低。
由圖5可知,隨著時間的延長,總巰基含量呈現不斷下降的趨勢,可能是由于冷凍過程使得肌原纖維蛋白空間結構發(fā)生改變,分子內部的巰基暴露出來被氧化成二硫鍵[4]。至210 d時,L組、D組、Y組小黃魚總巰基含量分別下降了77.05%、66.67%、46.45%,Y組小黃魚總巰基含量顯著高于其他兩組(P<0.05),表明液氮凍結可以有效減少小黃魚肉中肌肉纖維蛋白的變性程度。
圖5 不同凍結方式對小黃魚總巰基含量的影響Fig.5The effects of different freezingmethods on total sulfydryl in Larimichthys polyactis
2.1.6 不同凍結方式對小黃魚鹽溶性蛋白含量的影響
肌動球蛋白是肌原纖維蛋白的主要成分,而鹽溶性蛋白的含量可反映肌動球蛋白的性質,因此,鹽溶性蛋白的含量可以反映肌原纖維蛋白的變性程度[32]。鹽溶性蛋白含量越低,肌原纖維蛋白變性程度越大,小黃魚品質越低。
由圖6可知,小黃魚鹽溶性蛋白含量隨時間不斷下降。在第210天時,L組、D組、Y組小黃魚鹽溶性蛋白含量由初始值的44.05 mg/g分別下降至2.58、5.26和13.58 mg/g,即液氮凍結處理的小黃魚鹽溶性蛋白含量下降幅度最小,表明液氮凍結可以減少小黃魚蛋白質的變性程度。值得注意的是第210天時,傳統(tǒng)凍結組小黃魚的鹽溶性蛋白含量接近于零,蛋白質變性程度最大,可能是由于二硫鍵的形成導致肌動球蛋白重鏈聚合[33-34],也可能是由于部分結合水形成冰晶析出,蛋白質分子間形成非共價鍵進而形成不溶性凝集的超大分子[35]。
圖6 不同凍結方式對小黃魚鹽溶性蛋白含量的影響Fig.6 The effects of different freezing methods onsalt solubility protein in Larimichthys polyactis
2.1.7 不同凍結方式對小黃魚失水率的影響
由于凍結過程中形成冰晶具有膨脹作用,使肌肉組織結構遭到破壞,導致蛋白質變性。肌肉失水率越高,組織結構破壞越嚴重,肌肉蛋白質變性也越嚴重,致使小黃魚品質越低。
由圖7可知,三組小黃魚肌肉的失水率隨時間變化不斷升高,且小黃魚肌肉中的水分主要是在前15天發(fā)生流失(0天為新鮮樣,失水率從貯藏第15天開始測定)。Y組小黃魚的失水率始終顯著低于其他處理組(P<0.05),可能是由于液氮凍結速度較快,形成的冰晶較小,因此對組織結構的影響較小。此外,魚肉脂肪氧化程度也會影響肌肉的持水性[36],如上所述,本研究中L組小黃魚的TBA含量最高,總巰基含量最低,說明L組小黃魚脂肪氧化程度大,其肌肉持水性低。
圖7 不同凍結方式對小黃魚失水率的影響Fig.7The effects of different freezing methodson water-loss rate of Larimichthys polyactis
2.1.8 不同凍結方式對小黃魚電導率的影響
在貯藏過程中,魚肉蛋白質和脂肪等會被微生物分解成大量小分子物質,產生大量離子,使得魚肉浸出液導電能力增強,因此電導率可以反映魚肉被分解的程度,可以作為評價魚肉新鮮度的指標之一。電導率越高,分解產物越多,魚肉的新鮮度越差[37]。
由圖8可以看出,不同凍結方式處理的小黃魚電導率隨時間不斷升高。在第90天時 ,L組、D組、Y組的小黃魚的電導率由初始值1 215 μs/cm分別增加到1 967、1 799 和1 596 μs/cm,液氮凍結處理的小黃魚電導率顯著低于其他兩組(P<0.05),表明液氮凍結可以有效減緩小黃魚內蛋白質的分解,這與不同凍結方式處理的小黃魚的TVB-N含量、Ca2+-ATPase活性、TBA指標的結果一致。
圖8 不同凍結方式對小黃魚電導率的影響Fig.8The effects of different freezing methodson electrical conductivity of Larimichthys polyactis
硬度(hardness)反映食品達到一定變形所需要的力,是評價肉質的重要指標,凍藏期間硬度的降低主要是由于肌肉纖維的變形和與蛋白質的凝聚促使肌肉蛋白絲從Z線與M線上脫離[38]。由圖9可以看出,210 d貯藏期內不同凍結方式處理的小黃魚的硬度呈現不斷下降的趨勢。液氮凍結處理小黃魚的硬度變化相對緩慢,其硬度始終高于其他處理組,這表明液氮凍結可以較好地保持小黃魚的鮮度,保護小黃魚的蛋白質,這與TVB-N含量、總巰基含量、鹽溶性蛋白含量指標的評價結果一致。
圖9 不同凍結方式對小黃魚硬度的影響Fig.9The effects of different freezing methodson hardness of Larimichthys polyactis
圖10 不同凍結方式小黃魚彈性的變化Fig.10The effects of different freezing methodson elasticity of Larimichthys polyactis
彈性(elasticity)是指樣品變形前高度與除去壓力之后恢復的高度之比,水產品彈性的降低表明蛋白質發(fā)生變性、肌肉持水性降低[29]。由圖10可看出,隨著時間的延長,不同凍結方式處理的小黃魚的彈性不斷下降,說明貯藏過程中小黃魚肌肉蛋白質不斷劣化。在210天時,Y組、D組、L組小黃魚的彈性由初始值1.71分別下降到1.15、1.02、0.95,表明液氮凍結可以較好地保持小黃魚肌肉的彈性,從而維持小黃魚的完整性。
回復性(recoverability)是指樣品在第一次壓縮過程中回彈的能力,是評價水產品質構的重要指標[39]。由圖11可以看出,隨著時間的延長,不同凍結方式處理的小黃魚的回復性呈現不斷下降的趨勢。貯藏前30天,三組小黃魚樣品回復性急劇下降且各組相差不大,至210 d時,Y組、D組、L組小黃魚的回復性從初始值0.93分別降低至0.33、0.18、0.16,液氮凍結組回復性始終顯著高于其他處理組(P<0.05),說明液氮凍結可以有效地保持小黃魚肌肉的回復性,對小黃魚肌肉的損傷較小。
咀嚼性(chewiness)與硬度和彈性相關,主要受魚肉中膠原蛋白含量的影響,膠原蛋白的彈性越強樣品的咀嚼性越好,抗變形力越大,咀嚼性越好[40]。由圖12可以看出,隨著時間的延長,不同凍結方式處理的小黃魚的咀嚼性呈現不斷下降的趨勢,210 d時,L組、D組、Y組小黃魚的咀嚼性分別下降83.39%、78.71%、67.58%,即液氮凍結可有效減緩小黃魚咀嚼性的降低、保持小黃魚的口感,這與小黃魚硬度、彈性以及回復性的研究結果一致。
圖11 不同凍結方式對小黃魚回復性的影響Fig.11The effects of freezing methods onrecoverability of Larimichthys polyactis
圖12 不同凍結方式對小黃魚咀嚼性的影響Fig.12The effects of freezing methods onchewiness of Larimichthys polyactis
感官評分反映感官品質的綜合變化,利用嗅覺、味覺、視覺、觸覺等來對小黃魚的香氣、色澤以及風味等性質進行打分,并對打分結果進行統(tǒng)計分析得出結論[41]。感官評價是反映食品質量的重要手段之一。
隨著時間的延長,小黃魚感官綜合評分不斷下降。由圖13可知,Y組、D組、L組的小黃魚綜合評分,從初始值9.46分別下降到第210天 的7.15、4.12、3.21,液氮凍結處理小黃魚的感官品質變化緩慢且下降最少,表明液氮凍結可以有效減緩小黃魚感官品質的下降,這與理化指標以及質構品質的測定結果一致。
圖13 不同凍結方式對小黃魚感官品質的影響Fig.13The effects of freezing methods onsensory assessment of Larimichthys polyactis
凍結貯藏過程中,肌原纖維之間的縫隙明顯增大,這是因為肌原纖維和內部結締組織降解,從而導致肌原纖維和肌節(jié)分離[42]。如圖14所示,新鮮小黃魚細胞完整且無明顯冰晶破壞痕跡,細胞間無明顯縫隙,肌纖維排列致密整齊。從各組小黃魚微觀組織結構圖中可以看出,不同貯藏時間的小黃魚存在不同程度的細胞破碎變形、細胞間隙增大的現象。
貯藏時間為60 d時,各組樣品的細胞間隙開始變大,與其他處理組相比,Y組間隙較小,細胞結構相對完整;第150天時,L組、D組樣品的細胞間隙越來越大,出現片狀縫隙,表明肌原纖維和內部結締組織開始降解,而Y組樣品細胞較完整,只有少量的細胞邊緣冰晶痕跡和稍增的細胞間隙;第210天時,L組、D組樣品細胞間隙很大且表現出明顯的冰晶破壞痕跡,Z線崩潰,纖維結構散亂,Y組樣品開始出現片狀縫隙,細胞結構遭到一定破壞。由此可見,液氮速凍可以減緩小黃魚微觀組織結構的劣變,可能是因為液氮速凍生成的細小冰晶和部分玻璃化的狀態(tài)在一定程度上可以保護細胞結構[26],減緩蛋白質的降解變性。
本研究通過測定210 d內3種不同的凍藏方式(傳統(tǒng)凍結、平板凍結、液氮速凍,均于-18 °C條件下貯藏)下小黃魚的理化指標、質構品質、感官評分以及微觀結構,發(fā)現液氮凍結可以更好地保持小黃魚的品質以及肌肉的結構。與傳統(tǒng)凍結貯藏和平板凍結貯藏的小黃魚相比,經過液氮處理的小黃魚蛋白變性與脂肪氧化速度更慢;質構品質以及微觀結構劣變速率小于其他兩種處理的小黃魚,表明液氮凍結對小黃魚蛋白質冷凍變性的損傷最小,更有利于小黃魚品質的保持,這些結果與感官評價的結果相一致。綜合本研究結果與小黃魚的貨架期考慮,認為液氮凍結是一種具有廣闊前景的水產品凍結方式,若加強液氮速凍設備的研發(fā)制造,降低其在水產保鮮應用中的成本,可顯著提高小黃魚在貯藏期間的理化品質、質構品質、感官品質以及微觀結構。
圖14 不同凍結方式對小黃魚肌肉纖維微觀結構的影響 (10×10)Fig.14The effects of different freezing methods on muscle structure of Larimichthys polyactis