魟腸炎致病菌的分離鑒定及藥敏實(shí)驗(yàn)分析

劉方，羅霞，鞏華，常彥紅，宋晶，時(shí)彥民*

(1.濟(jì)寧市漁業(yè)監(jiān)測站，山東 濟(jì)寧272000； 2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，廣州510000；3.濟(jì)寧學(xué)院生命科學(xué)與工程系，山東 濟(jì)寧 272000；4.濟(jì)寧市任城區(qū)水產(chǎn)局，山東 濟(jì)寧272000)

魟(Potamotrygonleopoldi)是中生代的侏羅紀(jì)(約1.8億年～1.4億年前)出現(xiàn)的鯊的同類，黑白魟學(xué)名為豹江魟(PotamotrygonLeopoldi)，為燕魟目，魟科，豹江魟屬一種淡水魚類。黑白魟分布于南美洲巴西申古河流域，外形奇特，色彩美麗，軟骨無鱗，胸鰭發(fā)達(dá)，如蝶展翅，尾呈鞭狀，有毒刺。黑白魟的特征為黑色的盤，體上點(diǎn)綴著白色圓點(diǎn)(通常成3、2、1排列)，該品種主要分布在巴西申古河流域，是觀賞魚中國進(jìn)口的主要品種之一，因品種不同價(jià)格在1 000～20 000元/尾不等。其外形美觀、獨(dú)特，具有較高的觀賞價(jià)值，在中國觀賞魚養(yǎng)殖中很受歡迎。魟適合在淡水中養(yǎng)殖，適宜水溫為26～32 ℃；養(yǎng)殖水體pH為6.0～7.5，硝酸鹽含量為100～300 mg/L；養(yǎng)殖水體要求透明，且氧含量高(充氣量40 L/min，充氣泵24 h開通)。其餌料主要為貝類、甲殼類、小魚等。目前關(guān)于魟的研究主要側(cè)重于魟的軟骨多糖的生物活性研究[1-3]，而關(guān)于魟病害診斷和防治的研究罕見報(bào)道。

腸炎是魚類養(yǎng)殖過程中的常見病害，如草魚[4]、青魚[5]等，誘發(fā)魚類腸炎主要包括寄生蟲、細(xì)菌、病毒等生物因素，其中以細(xì)菌性病因居多。細(xì)菌性腸炎基本以嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)為主要誘因，有時(shí)單獨(dú)或混合感染豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)及溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)。另有霍亂弧菌(Vibriocholerae)誘發(fā)南美白對蝦(Penaeusvannamei)腸炎[6]以及惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)致使黑鯛(Sparusmacrocephlus)發(fā)生腸炎癥狀[7]的報(bào)道，可見水產(chǎn)動(dòng)物誘發(fā)腸炎的致病細(xì)菌具有多樣性。魟腸炎是養(yǎng)殖過程中易出現(xiàn)的主要病害之一，嚴(yán)重時(shí)可引起全缸魟發(fā)病甚至死亡，應(yīng)引起足夠重視。但該病具體是由何種病因引起以及致病機(jī)理研究較少，需進(jìn)一步探究。

2016年7月，山東省濟(jì)寧市某觀賞魚養(yǎng)殖場魟爆發(fā)大面積腸炎病，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。為明確該病致病原因并提出對應(yīng)的治療方案，本實(shí)驗(yàn)室針對魟腸炎致病菌進(jìn)行了分離鑒定及藥敏實(shí)驗(yàn)，以期為魟養(yǎng)殖過程中有效防治腸炎疾病提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

顯微鏡及顯微成像系統(tǒng)(Cx31)購于奧林帕斯株式會社；恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9082)購于上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；高壓滅菌鍋(YXQ-LS-50SII)購于上海博訊實(shí)業(yè)有限公司。

PCA培養(yǎng)基購于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基購于青島海博生物科技有限公司，MHB液體培養(yǎng)基購于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，革蘭氏染色試劑盒購于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，API 20NE試劑條購于法國生物梅里埃股份有限公司。0.65%無菌生理鹽水、哥倫比亞血平板與氧化酶試劑均購于青島海博生物科技有限公司，DNA提取試劑盒購于康寧生命科學(xué)有限公司，Plasmid Mini Kit試劑盒購于天根生化科技有限公司，EcoRⅠ和Hind Ⅲ及PCR反應(yīng)試劑購于大連寶生物工程有限公司，藥敏試紙購于杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 致病菌的分離和鑒定

1.2.1 樣品采集

濟(jì)寧市某觀賞魚養(yǎng)殖戶養(yǎng)殖的魟發(fā)病，其規(guī)格橫徑(15.0 ± 1.0)cm,體重(130.0 ± 10.0)g，表現(xiàn)為體色發(fā)黑，甩頭，打噴嚏，部分魟?dòng)型媳悻F(xiàn)象，糞便為淡黃色，腹部腫脹。3尾表現(xiàn)為發(fā)病癥狀并死亡，迅速冷藏并帶回實(shí)驗(yàn)室解剖觀察。

1.2.2 細(xì)菌的分離純化

體表消毒用75%酒精棉擦拭，無菌操作剪開其腹部，用接種環(huán)蘸取肝臟組織液，于PCA培養(yǎng)基劃線接種，28 ℃溫度下培養(yǎng)24～48 h，挑取形態(tài)特征一致的菌落再純化，獲得純化的菌株JY-04，保存于4 ℃冰箱備用。

1.2.3 人工回歸感染實(shí)驗(yàn)

挑取培養(yǎng)24～36 h的JY-04接種于MHB液體培養(yǎng)基，28 ℃擴(kuò)增培養(yǎng)24～36 h。發(fā)酵液5 000 r/min離心30 min去上清，然后用0.65%無菌生理鹽水稀釋沉淀，10倍梯度稀釋法制成不同濃度菌懸液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，選取約1×108CFU/mL的菌懸液進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)。

以草魚作為替代品種進(jìn)行人工回歸感染實(shí)驗(yàn)。健康的草魚(體長10～15 cm)在水族箱暫養(yǎng)10 d，實(shí)驗(yàn)水族箱規(guī)格為85 cm×62 cm×72 cm，水族箱盛水90 L左右，調(diào)試水溫(28 ± 2) ℃，暫養(yǎng)1周，暫養(yǎng)期間每天或每2天投喂1次，實(shí)驗(yàn)開始前，停食24～48 h。共80尾實(shí)驗(yàn)魚，分4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組20尾。1號水族箱作為陰性對照，注射等量的無菌生理鹽水；2號、3號、4號水族箱進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)，用連續(xù)注射器腹腔注射1×108CFU/mL的菌懸液，感染劑量0.2 mL/尾。觀察發(fā)病魚體癥狀3～5 d，對發(fā)病的實(shí)驗(yàn)魚進(jìn)行病原菌的分離及鑒定。

1.2.4 鏡檢觀察及溶血實(shí)驗(yàn)

將分離純化的菌株JY-04革蘭氏染色，油鏡下顯微鏡觀察細(xì)菌形態(tài)[8-10]。因有報(bào)道溶血價(jià)顯著受培養(yǎng)溫度的影響[11]，純化的細(xì)菌劃線血平板，分別在不同溫度下進(jìn)行培養(yǎng)。綜合考慮魟適宜的溫度范圍，選擇28 ℃和33 ℃下分別培養(yǎng)48～72 h，觀察是否出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。

1.2.5 生理生化鑒定

氧化酶試劑按說明書要求配置并進(jìn)行操作，無菌吸管吸取1滴氧化酶試劑滴于吸水濾紙上，用玻璃棒蘸取純化的菌落，點(diǎn)在吸水濾紙的氧化酶試劑上，7 s內(nèi)觀察是否有顯紫色，如果有顯紫色則判定為陽性，則選擇API 20E試劑條進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。挑取3～4個(gè)JY-04菌落放入5 mL生理鹽水中，制成0.5麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙?約1×107CFU/mL)，接種于API 20E試劑條中，在28 ℃下培養(yǎng)24～48 h，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果并通過APIWEBTM軟件(法國生物梅里埃股份有限公司)進(jìn)行分析。

1.2.6 分子鑒定

菌株JY-04經(jīng)營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)24 h后，在轉(zhuǎn)速5 000 r/min下離心20 min后收集菌體，按細(xì)菌DNA提取試劑盒說明及步驟提取菌株JY-04基因組DNA。

菌株JY-04的16S rRNA基因選擇的通用引物為：F1：5′-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACG-CT-3′，R1：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCA-CCCC-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。按照以下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增：先在94 ℃預(yù)變性3 min；隨后94 ℃ 變性30 s，50 ℃維持30 s，72 ℃維持90 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，在4 ℃保存。反應(yīng)體系見表1。

表1 PCR反應(yīng)體系Tab.1 The system of PCR reaction

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖膠回收純化，與 T4 載體連接, 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌 DH5α，轉(zhuǎn)化子用試劑盒 Plasmid Mini Kit T4 提取質(zhì)粒，EcoRⅠ和HindⅢ酶切鑒定插入片段大小, 挑取陽性轉(zhuǎn)化子送生物測序公司完成序列測定。將所測序列與GenBank中序列BLAST相似性比較。根據(jù)比對結(jié)果檢索出同源性較高的序列，采用 ClustalX和Mega 5.0生物軟件分析其同源性，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.7 致病菌藥敏實(shí)驗(yàn)

挑取菌株JY-04單菌落于1 mL 0.65%的生理鹽水中，振蕩器混勻，制成菌懸液(約1.0×107CFU/mL)，無菌槍頭定量吸取0.2 mL菌懸液于一次性培養(yǎng)皿，倒入PCA培養(yǎng)基(溫度約48 ℃)，平板冷卻凝固后加入藥敏試紙片，恒溫28 ℃培養(yǎng) 24 h 后測量抑菌圈直徑 (mm)。每個(gè)培養(yǎng)皿可以放2～4片不同抗生素種類藥敏試紙，根據(jù)抑菌圈的大小來評估其對該抗生素的敏感程度，抑菌圈直徑Φ> 20.0 mm判為高度敏感；10.0 mm <Φ≤ 20.0 mm為中度敏感；0 mm <Φ≤ 10.0 mm判為低度敏感；Φ=0 mm判為不敏感[12]。

本次實(shí)驗(yàn)共針對青霉素、氨芐西林、紅霉素、頭孢曲松、頭孢噻肟、氨曲南、頭孢他啶、頭孢唑林、頭孢呋辛、慶大霉素、復(fù)方新諾明、四環(huán)素、恩諾沙星、氟苯尼考、強(qiáng)力霉素、左氧氟沙星、磺胺甲基噁唑等抗生素開展了研究，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)合水產(chǎn)用藥名錄綜合篩選敏感抗生素。

2 結(jié)果與分析

2.1 病魚外觀特征

發(fā)病的魟皮膚發(fā)暗，黑色體表與白色點(diǎn)對比不明顯，病魚眼瞼凹陷，眼球外凸(圖1A a)；腹部顏色變暗，腹部腫大，腸腔高度擴(kuò)張，其內(nèi)充滿透明積液(圖1B e)，腸道色澤光亮，未見糜爛現(xiàn)象，肛門處伴有拖便現(xiàn)象(圖1B c)、解剖后肝臟顏色呈黃色(圖1B d)，易碎呈糜樣，其他未見異常。

圖1 發(fā)病魟魚的觀察與解剖a：眼瞼凹陷；b：黑色體表與白色點(diǎn)對比不明顯；c：肛門拖便；d：肝臟呈黃色；e：腸腔擴(kuò)張并充滿積液。Fig.1The observation and anatomy of stingray enteritisa: The eyelid sag; b: The black surface and the white dot are not obvious; c: Anal defecation; d: The liver is yellow；e: The intestine dilates and is filled with fluid.

2.2 致病菌分離純化

從發(fā)病的魟肝組織中分離得到形態(tài)一致的菌株(命名為JY-04)，28 ℃培養(yǎng)24 h后觀察PCA培養(yǎng)基菌落形態(tài)：該菌落呈現(xiàn)濕潤、光滑、圓形、較隆起、直徑約1 mm，半透明灰白色的小菌落(圖2)，挑取單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，并保存菌株。

2.3 人工回歸感染實(shí)驗(yàn)

在回染攻毒實(shí)驗(yàn)中，因魟價(jià)格昂貴，本實(shí)驗(yàn)選擇替代品種進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。目前國內(nèi)已有草魚感染霍亂弧菌的相關(guān)研究報(bào)道[13]，且草魚作為替代品種具有自身優(yōu)勢：其苗種市場化程度較高，不同規(guī)格草魚苗種及配套養(yǎng)殖飼料均可以快速購置，有利于快速開展感染實(shí)驗(yàn)研究，因此本研究選擇草魚進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)。

圖2 致病菌分離純化Fig.2The isolation and purification of pathogenic bacteria

人工注射感染1 d后，2號、3號、4號水族箱的草魚，活動(dòng)遲緩，腹部腫脹，肛門紅腫，實(shí)驗(yàn)魚陸續(xù)死亡；而1號水族箱內(nèi)的草魚沒有出現(xiàn)異常癥狀，吃食量正常。解剖2號、3號、4號水族箱的發(fā)病草魚，發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)有腹水，肝臟顏色發(fā)白，從其肝胰臟重新分離到該菌。如表2所示，該致病菌注射感染3 d，實(shí)驗(yàn)魚發(fā)病率高達(dá)100%，旁證JY-04菌株具有較強(qiáng)的致病性；且由于感染致病菌菌懸液濃度相同(約1×108CFU/mL)，3個(gè)水族箱的實(shí)驗(yàn)魚的發(fā)病率和死亡率均接近。本次感染實(shí)驗(yàn)選擇替代品種進(jìn)行，推測JY-04為魟魚腸炎的致病菌，但后續(xù)工作在條件充足時(shí)仍有必要進(jìn)行。

2.4 細(xì)菌的顯微觀察及溶血實(shí)驗(yàn)

革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)表明，JY-04為革蘭氏陰性菌，在油鏡下觀察其形態(tài)為彎曲呈弧形桿菌，兩端鈍圓(圖3A)。將純化的菌落接種于血瓊脂平板，放置在33和28 ℃下分別培養(yǎng)。33 ℃培養(yǎng)48～72 h后，血平板出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，在血平板上生長的菌落周圍出現(xiàn)明顯的透明溶血帶(圖3B)，這說明JY-04能夠釋放溶血素，降解血細(xì)胞，使血平板溶血呈現(xiàn)透明，也從側(cè)面表明其對魚體的致病性；在28 ℃培養(yǎng)72 h未見溶血現(xiàn)象。溶血現(xiàn)象的發(fā)生與培養(yǎng)溫度可能存在一定關(guān)系。蒙愛云等[11]研究了14株無乳鏈球菌的溶血價(jià)，發(fā)現(xiàn)溶血價(jià)顯著受培養(yǎng)溫度的影響。11株無乳鏈球菌的溶血價(jià)在37 ℃時(shí)最高，2株在25 ℃時(shí)最高、1株在30 ℃時(shí)最高。董新波等[14]通過研究發(fā)現(xiàn)溫度能夠調(diào)節(jié)副溶血弧菌的運(yùn)動(dòng)能力。本實(shí)驗(yàn)中在33 ℃出現(xiàn)溶血，說明JY-04在較高溫度下分泌溶血素，此外，本研究結(jié)果也進(jìn)一步印證了溶血現(xiàn)象受溫度的影響明顯。

表2 人工感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 The results of artificial infection

圖3 菌株JY-04革蘭氏染色顯微觀察及血平板溶血實(shí)驗(yàn)A: 革蘭染色后顯微鏡下菌體; B: 血平板溶血實(shí)驗(yàn)(33 ℃培養(yǎng)72 h)。Fig.3Microscopic observation under gramstaining and blood plate hemolysis test for strain JY-04A: The gram-staining bacteria in microscope;B: The blood plate hemolysis test.

2.5 生理生化鑒定

JY-04菌株氧化酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性(圖4)。經(jīng)API 20NE細(xì)菌分析鑒定試劑條鑒定(表3)，菌株JY-04為霍亂弧菌或者嗜水氣單胞菌/豚鼠氣單胞菌，鑒定準(zhǔn)確率(ID)分別為46.3%和46.8%。因鑒定ID偏低，無法確定種類，需進(jìn)一步通過分子鑒定實(shí)驗(yàn)確定。

圖4 氧化酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果A、B：同一菌株的兩次重復(fù)試驗(yàn)。Fig.4Experimental results of oxidaseA, B： Two repeated tests of the same strain.

2.6 分子鑒定實(shí)驗(yàn)

以細(xì)菌通用引物F1、R1為引物和提取的DNA為模板， PCR擴(kuò)增得到約1 500 bp的條帶，膠回收并測序后獲得1 037 bp的序列(圖5)。通過與GenBank中序列進(jìn)行BLAST分析比對，菌株JY-04與霍亂弧菌霍亂生物型(Vibriocholeraebiotypecholerae)及霍亂弧菌易北河生物型(Vibriocholeraebiotypealbensis)的同源性均達(dá)99%。利用ClustalX和Mega 5.0生物軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖6)，結(jié)果顯示菌株JY-04與霍亂弧菌易北河生物型(Vibriocholeraebiotypealbensis)聚為一支。

表3 菌株JY-04生理生化鑒定結(jié)果Tab.3 The physiological and biochemical identification results of strain JY-04

注：+表示陽性，-表示陰性。

圖5 JY-04 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M：分子量2000 marker；1，2，3：菌株JY-04的16S rRNA擴(kuò)增產(chǎn)物。Fig.5 The PCR amplification product of 16S rRNA geneM: DL2000 marker; 1, 2, 3: 16S rRNA gene amplification product of strain JY-04.

2.7 藥敏實(shí)驗(yàn)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示，菌株JY-04對復(fù)方新諾明、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、左氧氟沙星、磺胺甲基噁唑等5種抗生素中度敏感；對青霉素、氨芐西林、紅霉素、頭孢曲松、頭孢噻肟、氨曲南、頭孢他啶、頭孢唑林、頭孢呋辛、慶大霉素、恩諾沙星、氟苯尼考等12種抗生素為高度敏感。在農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)用藥名錄內(nèi)篩選，其中氟苯尼考的抑菌效果最好，建議養(yǎng)殖戶以每千克魚體重添加10 mg 氟苯尼考的劑量，拌餌投喂治療3～5 d，養(yǎng)殖戶按照建議施用5 d后，魟腸炎得到有效控制，未再現(xiàn)發(fā)病及死亡現(xiàn)象。

3 討論

3.1 發(fā)病原因分析

發(fā)病魟的養(yǎng)殖場調(diào)研發(fā)現(xiàn)，其養(yǎng)殖方式為魚缸養(yǎng)殖，循環(huán)水反復(fù)過濾，水體為地下水，經(jīng)過簡單晾曬，而未進(jìn)行陽光暴曬或消毒，留下細(xì)菌增殖的隱患；且養(yǎng)殖戶為室內(nèi)養(yǎng)殖，養(yǎng)殖環(huán)境陰暗潮濕，相對濕度大于70%，進(jìn)入后能聞到較濃的的霉味，霉菌易滋生，養(yǎng)殖空氣環(huán)境不良，易給水體質(zhì)量造成不良影響。

圖6 基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 The phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence of the strain JY-04

序號NO.抗菌藥物Antibiotics含藥量/(μg·patch-1)Contents抑菌圈直徑1/mmDiameter of inhibitory zone 1抑菌圈直徑2/mmDiameter of inhibitory zone 2抑菌圈直徑3/mmDiameter of inhibitory zone 3平均抑菌圈直徑/mmMean diameter of inhibitory zone1青霉素1040363838.0 2氨芐西林1042444844.73紅霉素1532383234.04頭孢曲松3056586058.05頭孢噻肟3058565255.36氨曲南3052565454.07頭孢他啶3046445046.78頭孢唑林3040444442.79頭孢呋辛3050465249.310慶大霉素1024292626.311復(fù)方新諾明3012131212.312四環(huán)素3013261618.313恩諾沙星526262826.714氟苯尼考3051515853.315強(qiáng)力霉素3020192019.716左氧氟沙星519202019.717磺胺甲基噁唑30018181818.0

魟的親魚生殖方式為卵胎生，在該養(yǎng)殖場中，生產(chǎn)的幼苗(橫徑8～10 cm)每8尾放置于1個(gè)處于暗環(huán)境的魚缸(約100 cm×40 cm×30 cm)內(nèi)，外加黑布，防止小魟魚苗受刺激而發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)。魚缸較小，水體無循環(huán)有增氧設(shè)備，但是缸體水位較淺，充氧設(shè)備通入的氣體未充分與水體接觸便出水體，實(shí)際有效溶氧較低，是否能同時(shí)滿足8尾魟的溶氧需求有待進(jìn)行下一步研究。水體為地下水無消毒，也未添加任何藥物，水溫加熱到30～32 ℃后加入魚缸內(nèi)，小魚缸內(nèi)養(yǎng)殖8尾魟，單位個(gè)體所占有的水體空間相對較小，魟的幼體相互碰撞易誘發(fā)應(yīng)激反應(yīng)，另外本實(shí)驗(yàn)中使用到的發(fā)病魚為剛生產(chǎn)14 d的魟?dòng)左w，其免疫力相對較低，易受到致病菌的侵染。

本研究從發(fā)病的魟中分離出的致病菌，均為單一相似的菌落形態(tài)，結(jié)合使用顯微觀察、API細(xì)菌鑒定、16S rRNA鑒定結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，可以確認(rèn)本次魟腸炎致病菌JY-04為霍亂弧菌?；魜y弧菌在自然水域、水產(chǎn)動(dòng)物體表及體內(nèi)廣泛存在，由于該菌為條件致病菌，是否產(chǎn)生霍亂腸毒素是決定其毒力的主要因素[15]，大多數(shù)霍亂弧菌環(huán)境菌株不產(chǎn)生霍亂毒素[16-17]，在類似養(yǎng)殖環(huán)境的條件下可以獲得霍亂毒素基因[18-19]，從而使非致病性霍亂弧菌菌株轉(zhuǎn)變成致病性流行菌株[20]。徐懷恕等[21]和許兵等[22]證實(shí)了霍亂弧菌活的不可培養(yǎng)狀態(tài)的存在，處于活的不可培養(yǎng)狀態(tài)的霍亂弧菌,細(xì)胞縮小呈球形,添加一定化學(xué)物質(zhì)刺激菌體可長大(即活的)，但在常規(guī)培養(yǎng)基上不能繁殖,故無法用常規(guī)法檢測。養(yǎng)殖環(huán)境中的存在某些物理、化學(xué)、生物因子，可以使致病菌從活的不可培養(yǎng)狀態(tài)向活的可培養(yǎng)狀態(tài)轉(zhuǎn)化[18]。適宜的環(huán)境中致病菌大量繁殖，增加了養(yǎng)殖環(huán)境中的菌體數(shù)量，間接提高了染病機(jī)率。本研究中養(yǎng)殖環(huán)境或魟體內(nèi)存在的致病菌株可能受外界某種因素刺激使其產(chǎn)生了致病性，具體何種因素有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

3.2 霍亂弧菌對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的危害及耐藥性分析

霍亂弧菌是水體微生物區(qū)系的成員，在河水、湖水、河口水以及沿岸海水中廣泛存在[23-24]，有研究證實(shí)該菌也存在于牡蝸、藍(lán)蟹等水產(chǎn)動(dòng)物的體表及體內(nèi)[22]，霍亂弧菌對水產(chǎn)動(dòng)物具有一定的致病性，能引起蝦[25]、魚[26]、貝類[27]及其他水生動(dòng)物[26]發(fā)病死亡，造成嚴(yán)重的養(yǎng)殖損害?；魜y弧菌共4個(gè)生物型[27]：霍亂弧菌霍亂生物型(Vibriocholeraebiotypecholerae)、霍亂弧菌埃托爾生物型(Vibriocholeraebiotypeeltor)、霍亂弧菌變形生物型(Vibriocholeraebiotypeproteus)、霍亂弧菌易北河生物型(Vibriocholeraebiotypealbensis)。聚類分析結(jié)果顯示JY-04菌株與霍亂弧菌易北河生物型親緣關(guān)系最近，但聚類分析結(jié)果也可能是由于分子水平檢測的少量基因誤差造成的，因此無法根據(jù)此結(jié)果斷定其為霍亂弧菌易北河生物型。生理生化實(shí)驗(yàn)證實(shí)JY-04能夠發(fā)酵甘露糖，與伯杰細(xì)菌鑒定手冊表述霍亂弧菌易北河生物型不發(fā)酵甘露糖相抵觸，分析認(rèn)為個(gè)別糖發(fā)酵的不同可能是由菌株變異所致，因此不能排除霍亂弧菌易北河生物型的可能性。綜合細(xì)菌形態(tài)觀察、API生化鑒定及分子實(shí)驗(yàn)只能確定JY-04為霍亂弧菌，具體為何種生物型仍需進(jìn)一步研究。

目前國內(nèi)文獻(xiàn)關(guān)于霍亂弧菌易北河生物型的研究報(bào)道較少。僅見1985年陳掌綸等[28]報(bào)道了從發(fā)光豬尸分離鑒定了一株易北河弧菌，并利用小白鼠進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，證實(shí)6.3×107CFU/mL肉湯菌懸液腹腔注射0.1 mL就可以使小白鼠其在48 h內(nèi)死亡，并再次分離到該菌株，證實(shí)易北河弧菌具有一定致病性，但霍亂弧菌易北河生物型是否對水產(chǎn)動(dòng)物具有致病性尚未見報(bào)道。

國內(nèi)學(xué)者相繼報(bào)道了暗紋東方鲀(Takifuguobscurus)[29]、草魚[13]、鱷(Crocodilus)[30]、異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)[31]等感染霍亂弧菌而發(fā)病的研究成果，可見霍亂弧菌能夠?qū)Χ喾N水產(chǎn)動(dòng)物產(chǎn)生危害，而魟感染霍亂弧菌發(fā)生腸炎尚未見報(bào)道。2009年邴旭文等[32]報(bào)道了從江蘇連云港某養(yǎng)殖場養(yǎng)殖死亡的泥鰍的肝臟、血液及腹水中分離出大量優(yōu)勢生長的細(xì)菌，鑒定其與霍亂弧菌具有較高的相似性，49種抗菌藥物的耐藥實(shí)驗(yàn)證實(shí)該菌株對氨芐西林、四環(huán)素等6種抗生素不敏感，而本研究證實(shí)JY-04對氨芐西林、四環(huán)素抗生素均高度敏感；2016年曹海鵬等[6]報(bào)道了南美白對蝦白斑綜合征的致病菌經(jīng)分離鑒定為霍亂弧菌，藥敏實(shí)驗(yàn)證實(shí)分離的菌株對氨芐西林、磺胺甲氧嘧啶、頭孢他啶、頭孢呋新、頭孢噻肟、呋喃唑酮、復(fù)方新諾明等8種抗生素產(chǎn)生耐藥性，而本次藥敏實(shí)驗(yàn)證實(shí)JY-04對氨芐西林、磺胺甲氧嘧啶、頭孢他啶、復(fù)方新諾明等抗生素均呈現(xiàn)敏感性。

有研究認(rèn)為泥鰍[32]、南美白對蝦[6]源霍亂弧菌耐藥性的產(chǎn)生原因可能與菌株的生存環(huán)境、藥物使用頻次、基因變異和自然選擇有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中魟源霍亂弧菌JY-04未呈現(xiàn)抗生素的耐藥性，這可能與養(yǎng)殖戶從未使用抗生素進(jìn)行預(yù)防和治療有關(guān)，說明在水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖過程中有效減少抗生素的使用及科學(xué)用藥是降低霍亂弧菌耐藥性的有效手段。雖未見魟中霍亂弧菌JY-04產(chǎn)生耐藥性，但是在其他水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物[23,26,28]中呈現(xiàn)的耐藥性應(yīng)該引起足夠重視并加強(qiáng)監(jiān)控和防范?；魜y弧菌為人、魚共患致病菌，實(shí)驗(yàn)及養(yǎng)殖過程應(yīng)加強(qiáng)預(yù)防措施，防止人體感染，加強(qiáng)養(yǎng)殖環(huán)境室內(nèi)通風(fēng)，增加除濕設(shè)備，定期清理魚缸并滅菌，避免大規(guī)模疫病的流行及暴發(fā)。

4 結(jié)論

本研究對山東省濟(jì)寧市某觀賞魚養(yǎng)殖場患腸炎的魟進(jìn)行取樣調(diào)查，經(jīng)菌株分離純化、回歸感染、顯微觀察、溶血試驗(yàn)、生理生化及分子鑒定及藥敏試驗(yàn)確定，魟腸炎的致病菌為霍亂弧菌。根據(jù)本次藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果并結(jié)合農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥名錄，可以選擇氟苯尼考等敏感抗生素對魟進(jìn)行積極治療，按照10 mg/kg劑量每24 h拌餌一次，治療3～5 d。該研究將為魟腸炎的病原菌分析及科學(xué)治療提供參考依據(jù)。