舟山海島地區(qū)新重組GII.P16-GII.2型諾如病毒基因特征分析

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諾如病毒是引起人類非細(xì)菌急性胃腸炎的首要病原體[1]。全世界范圍內(nèi)約1/5的腹瀉病例與諾如病毒感染相關(guān)，每年約導(dǎo)致20萬(wàn)人死亡[2]。諾如病毒進(jìn)化變異速度快，每隔2～3年會(huì)出現(xiàn)新的流行株引發(fā)大流行，其機(jī)制[3]主要是：①諾如病毒衣殼蛋白區(qū)氨基酸發(fā)生突變，其中P區(qū)處于高度變異，被認(rèn)為是免疫識(shí)別和與人體組織血型抗原(HBGA)結(jié)合的關(guān)鍵部位[4]；②基因重組。在過(guò)去二十年間諾如病毒GII.4型一直為優(yōu)勢(shì)流行株[5]，直至2014-2015冬季在多個(gè)亞洲地區(qū)國(guó)家新型GII.P17-GII.17型基因型取代GII.4_Sydney_2012型成為優(yōu)勢(shì)流行株[6]；但中國(guó)CDC報(bào)道自2016下半年以來(lái)新重組基因型GII.P16-GII.2在諾如病毒暴發(fā)病例中檢出率超過(guò)GII.P17-GII.17及GII.4型，成為我國(guó)引起急性胃腸炎暴發(fā)的優(yōu)勢(shì)基因型[7]。本文收集舟山海島地區(qū)2017年5-11月4起學(xué)校發(fā)生的急性胃腸炎暴發(fā)疫情病例樣本，通過(guò)擴(kuò)增其聚合酶-衣殼區(qū)(B-C區(qū))，近乎完整的聚合酶區(qū)(RdRp)及衣殼蛋白區(qū)(VP1)基因序列，鑒定引起本輪諾如病毒暴發(fā)疫情的基因型別及分子特征，為諾如病毒的防控提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1樣本來(lái)源及處理 2017年5-11月，舟山市定海區(qū)兩所幼兒園、一所小學(xué)及普陀區(qū)一所小學(xué)共發(fā)生4起急性胃腸炎暴發(fā)事件，疫情所在的縣區(qū)疾控共送檢40例樣本，其中肛拭子21份、嘔吐物13份、糞便6份；對(duì)固體樣本取豌豆大小 (液體取100 μL) 加到1.5 mL EP管中，加入900 μL的pH 7.2的PBS (10 mmol/L) 緩沖液，振蕩1 min。然后靜置5 min，再以10 000 r / min離心3 min，然后吸取200 μL上清液，使用QIAGEN Reansy Mini Kit試劑盒按照說(shuō)明書提取病毒核酸。

1.2諾如病毒篩查 使用TAKARA公司One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit試劑盒用于GI型和GII型諾如病毒篩查。其中GI型反應(yīng)體系25 μL，包括20 μmol/L的JJV1F/JJV1R/JJV1P各0.5 μL，2×RT-PCR buffer 12.5 μL，5 U/μL EX Taq HS 0.5 μL，RT Ezyme Mix II 0.5 μL，雙蒸餾水5 μL，RNA 5 μL；GII型反應(yīng)體系25 μL，包括20 μmol/L的JJV2F/JJV2R/JJV2P各0.5 μL，2×RT-PCR buffer 12.5 μL，5 U/μL EX Taq HS 0.5 μL，RT Ezyme Mix II 0.5 μL，雙蒸餾水5 μL，RNA 5 μL，引物探針序列見(jiàn)表1。反應(yīng)在ABI公司ViiA-7上進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置如下：42 ℃ 10 min反轉(zhuǎn)錄，95 ℃ 15 min預(yù)變性，45個(gè)循環(huán)95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，Ct值≤40判定為陽(yáng)性。

1.3聚合酶區(qū)-衣殼區(qū)擴(kuò)增及測(cè)序 將諾如病毒陽(yáng)性的樣本，使用QIAGEN OneStep RT-PCR Kit試劑盒擴(kuò)增GII型聚合酶區(qū)-衣殼區(qū)(557 bp)進(jìn)行分型，反應(yīng)體系25 μL,包括5xRT-PCR Buffer 5 μL，10 μmol/L dNTP mix 1 μL，RT-PCR Enzyme mix 1 μL，20 U/μL Rnase Inhibitor 1 μL，50 μmol/L MON431/G2SKR各0.5 μL，雙蒸餾水11 μL，RNA 5 μL；實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置如下：42 ℃ 30 min反轉(zhuǎn)錄；95 ℃ 15 min預(yù)變性；40個(gè)循環(huán)95 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min；72 ℃ 10 min延伸。取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5 %瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.4聚合酶區(qū)和衣殼蛋白區(qū)擴(kuò)增及測(cè)序 經(jīng)分型后證實(shí)本輪暴發(fā)疫情均由諾如病毒GII.P16-GII.2所引起，隨機(jī)選擇其中1份陽(yáng)性樣本使用QIAGEN OneStep RT-PCR Kit 試劑盒擴(kuò)增近乎完整的RdRp區(qū)(1 153 bp)及VP1(1 580 bp)，其中擴(kuò)增RdRp區(qū)反應(yīng)體系25 μL，包括5xRT-PCR Buffer 5 μL，10 μmol/L dNTP mix 1 μL，RT-PCR Enzyme mix 1 μL，20 U/μL Rnase Inhibitor 1 μL，50 μmol/L RdRp-3875F/RdRp-5259R各0.5 μL，雙蒸餾水11 μL，RNA 5 μL；擴(kuò)增VP1區(qū)反應(yīng)體系25 μL，包括5xRT-PCR Buffer 5 μL，10 μmol/L dNTP mix 1 μL，RT-PCR Enzyme mix 1μL，20 U/μL Rnase Inhibitor 1 μL，50 μmol/L VP1-5025F/VP1-6731R各0.5 μL，雙蒸餾水11 μL，RNA 5 μL。實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置如下：42 ℃ 30 min反轉(zhuǎn)錄；95 ℃ 15 min預(yù)變性；35個(gè)循環(huán)95 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min；72 ℃ 7 min延伸。取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2 %瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.5基因型別鑒定及序列分析 使用MEGA 6.06 Clustal W將擴(kuò)增的序列進(jìn)行比對(duì)，并采用Neighbor Joining構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。使用Simplot軟件分析毒株的重組位點(diǎn)，采用200 bp的滑動(dòng)窗口，20 bp的滑動(dòng)步伐。使用BioEdit v.7.0.1軟件對(duì)序列編輯，同源性分析，并將RdRp區(qū)及VP1堿基序列翻譯氨基酸序列與代表株進(jìn)行序列比對(duì)；同時(shí)通過(guò)諾如病毒在線分型工具(http://www.rivm.nl/mpf/norovirus/typingtool)鑒定其型別，并與由系進(jìn)化分析判定的型別進(jìn)行比較，本文使用的參考序列均來(lái)源于NCBI。

表1 諾如病毒分子檢測(cè)所用引物與探針序列Tab.1 Primer and probe sequence used in molecular detection for norovirus

注：*1-6引物/探針用于 real-time PCR，7-12用于常規(guī)RT-PCR

2 結(jié) 果

2.1流行概況 2017年5-11月舟山市海島地區(qū)定海區(qū)兩所幼兒園與一所小學(xué)、普陀區(qū)一所小學(xué)分別發(fā)生急性胃腸炎暴發(fā)疫情，總病例數(shù)69例，暴發(fā)流行時(shí)間最短4 d，最長(zhǎng)10 d；疫情呈明顯聚集性多發(fā)生于同一宿舍、班級(jí)及相鄰班級(jí)。病例年齡組在3～10歲，臨床表現(xiàn)以惡心、嘔吐為主伴隨不同程度發(fā)熱、腹瀉、腹痛，無(wú)重癥病例及死亡病例。結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果判定該起疫情排除水源性和食源性傳播的可能性，認(rèn)為是由諾如病毒感染引起的人傳人暴發(fā)事件。

2.2諾如病毒篩查結(jié)果 對(duì)送檢的40份樣本進(jìn)行諾如病毒GI型和GII型熒光定量檢測(cè)，其中陽(yáng)性樣本27例，均為諾如病毒GII型，陽(yáng)性檢出率67.50%，見(jiàn)表2。

2.3聚合酶區(qū)-衣殼區(qū)擴(kuò)增結(jié)果及序列分析 聚合酶區(qū)-衣殼區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，27份樣本均在557 bp出現(xiàn)特異性條帶。送至上海生工生物工程公司進(jìn)行序列測(cè)定，均測(cè)序成功，經(jīng)諾如病毒在線分型工具判定均為GII.P16-GII.2型，見(jiàn)表2。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示GII.P16-GII.2型27份，與在線分型工具所得結(jié)果一致，各個(gè)毒株間序列高度同源，相似性為98.8%～100%，見(jiàn)圖1。

表2 4起暴發(fā)疫情諾如病毒分子檢測(cè)結(jié)果Tab.2 The molecular detection results of norovirus in four acute gastroenteritis outbreaks

2.4聚合酶及衣殼蛋白區(qū)擴(kuò)增結(jié)果及序列分析 聚合酶區(qū)和衣殼蛋白區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，均出現(xiàn)特異性條帶。送至上海生工生物工程公司進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序成功后經(jīng)諾如病毒在線分型工具判定為GII.P16與GII.2型。將所得序列提交至NCBI，獲得序列號(hào)：MH057762。Simplot軟件重組分析顯示，重組位點(diǎn)位于ORF1-ORF2連接區(qū)處1 120-1 122 bp(AY134748,5 052-5 053 bp)，見(jiàn)圖2。 經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)果可見(jiàn)，2016-2017年新重組型GII.P16型及GII.2型均來(lái)源于2010-2012年日本的GII.P16-GII.2毒株，本次舟山海島地區(qū)幼兒園中流行暴發(fā)的GII.P16型隸屬于GII.P16c簇與2016江蘇的毒株同源性最高，為99.7%，GII.2型隸屬于GII.2c簇與2016年北京的毒株同源性最高，為99.9%，見(jiàn)圖3,4。將本次分離出來(lái)的新重組毒株GIIP.16-GII.2與代表株進(jìn)行RdRp區(qū)及VP1區(qū)氨基酸序列比對(duì)，均發(fā)現(xiàn)多個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變，在RdRp區(qū)D173E、S293T、V332I、K357Q及T360A位點(diǎn)的突變僅發(fā)生在2016-2017年重組株的GII.P16c簇中；與GII.2代表株VP1區(qū)氨基酸序列相比，GII.2 a,b,c 三簇在P區(qū)均有多個(gè)位點(diǎn)突變，在潛在抗原表位及與人體HBGA結(jié)合的位點(diǎn)周圍共12個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生突變，2016-2017年的GII.2c簇中并不存在特異性突變。見(jiàn)表3，4。

注:諾如病毒命名規(guī)則按諾如病毒/基因型/宿主/國(guó)家/年份/基因亞型/分離地點(diǎn)/序號(hào)[8]圖1 27株諾如病毒聚合酶區(qū)-衣殼區(qū)序列系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果Fig.1 Phylogenetic analysis on partial RdRp and capsid protein sequences of 27 norovirus strains in Zhoushan Islands,2017

圖2 Simplot分析2017年舟山海島GII.P16-GII.2重組位點(diǎn)結(jié)果Fig.2 The recombination breakpoint result of GII.P16-GII.2,Zhoushan Islands,2017

圖3 GII.P16型RNA聚合酶區(qū)序列系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果Fig.3 Phylogenetic analysis results of GII.P16 RdRp sequences

圖4 GII.2型VP1區(qū)序列系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果Fig.4 Phylogenetic analysis results of GII.2 VP1 sequence

表3 舟山市海島地區(qū)GII.P16型諾如病毒RdRp區(qū)氨基酸序列變異結(jié)果Tab.3 The amino acid sequence mutation of GII.P16 RdRp region in Zhoushan Islands

表4 舟山市海島地區(qū)GII.2型諾如病毒衣殼蛋白區(qū)氨基酸序列變異結(jié)果Tab.4 The amino acid sequence mutation of GII.2 VP1 region in Zhoushan Islands

注：(1)由GII.4型提示可能潛在的諾如病毒A抗原表位位點(diǎn)(294,296-298,368,372)[9]
(2)GII.2與人體HBGA受體結(jié)合的3個(gè)位點(diǎn)[10]

3 討 論

諾如病毒為杯狀病毒科諾如病毒屬，為單鏈正股RNA病毒，全長(zhǎng)約7.5-7.7 kb，整個(gè)基因組可分為ORF1、ORF2、ORF3三個(gè)開放讀碼框(ORFs),分別編碼包含RNA聚合酶(RdRp)的非結(jié)構(gòu)蛋白，主要衣殼蛋白(VP1)及次要衣殼蛋白(VP2)[11]?；赗dRp區(qū)和VP1基因序列的差異可將諾如病毒分為GI-GVII 7個(gè)基因群，GI，GII，GIV可感染人類[12]。2017年5-11月舟山市海島地區(qū)發(fā)生4起由諾如病毒GII.P16-GII.2型引起的急性胃腸炎暴發(fā)疫情，且都發(fā)生在低年齡人群學(xué)校場(chǎng)所。中國(guó)CDC一篇文獻(xiàn)報(bào)道，2016年我國(guó)大陸由諾如病毒引起的急性胃腸炎暴發(fā)中新重組的GII.P16-GII.2型檢出率為79%[7]；同期我國(guó)香港及臺(tái)灣、德國(guó)、日本、法國(guó)等報(bào)道自2016年以來(lái)GII.P16-GII.2型諾如病毒引起的暴發(fā)疫情顯著增加，且與本區(qū)域類似，大多數(shù)暴發(fā)疫情是發(fā)生在幼托，幼兒園，小學(xué)等場(chǎng)所[13-17]；吳冰珊等認(rèn)為GII.P16-GII.2型類似于GII.4型，具有在局部人群的傳播能力[18]；但GII.4型多暴發(fā)于養(yǎng)老院等長(zhǎng)期的健康護(hù)理機(jī)構(gòu)[19]；傳播方式傾向于人與人接觸傳播[20]，GII.P16-GII.2傳播模式是否類似于GII.4型還需進(jìn)一步驗(yàn)證；本次舟山海島地區(qū)分離出來(lái)的毒株GII.P16，GII.2分別與同處沿海地區(qū)江蘇省，北京市2016年報(bào)道的GII.P16及GII.2型毒株同源性最高，此前有文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)1999-2011年我國(guó)的諾如病毒重組株分析，多數(shù)型別均分布在沿海地區(qū)，且推斷受諾如病毒污染海產(chǎn)品的廣泛銷售有助于諾如病毒基因型的傳播與分布[21]。

舟山海島地區(qū)分離出來(lái)的GII.P16-GII.2型毒株，擴(kuò)增近乎完整的RdRp區(qū)及VP1區(qū)，通過(guò)與代表株序列比對(duì)，在RdRp區(qū)D173E、S293T、V332I、K357Q及T360A位點(diǎn)的突變僅發(fā)生在2016-2017年重組株GII.P16c簇中；與GII.2代表株VP1區(qū)氨基酸序列相比，GII.2 a,b,c 三簇在P區(qū)均有多個(gè)位點(diǎn)突變，但在2016-2017年的GII.2c簇中并不存在特異性位點(diǎn)突變。在GII.4型及GII.P17型的進(jìn)化過(guò)程中，P區(qū)氨基酸的變異往往對(duì)新流行株的出現(xiàn)，及其抗原性的轉(zhuǎn)變與易感人群范圍的擴(kuò)大有關(guān)鍵性的作用，使得新流行株能夠逃避人群免疫力而引起廣泛的流行[22-23]，而本次新重組GII.P16-GII.2型VP1區(qū)序列分析結(jié)果提示P區(qū)位點(diǎn)的變異并不是促使本輪新重組株GII.P16-GII.2暴發(fā)流行的關(guān)鍵因素；采用Simplot軟件對(duì)本次分離的毒株的重組位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示重組位點(diǎn)位于ORF1/ORF2連接處1 120-1 122 bp(AY134748,5 052-5 053 bp)，該區(qū)域?yàn)橹Z如病毒發(fā)生基因重組的主要區(qū)域[24]，基因重組是諾如病毒的進(jìn)化重要機(jī)制之一，往往發(fā)生于不同亞型的混合感染病例中，衣殼蛋白區(qū)結(jié)合不同的聚合酶區(qū)，能夠改變病毒的復(fù)制與傳播能力，或者產(chǎn)生新的諾如病毒亞型，造成抗原性漂變，從而能夠逃避人群免疫力，引發(fā)大范圍的暴發(fā)流行[25]。值得注意的是近年GII.P16的重組株不斷被發(fā)現(xiàn)，表明GII.P16型RdRp區(qū)已進(jìn)化具備結(jié)合多種型別衣殼蛋白區(qū)的能力，對(duì)最近出現(xiàn)的重組株GII.P16-GII.2及GII.P16-GII.4_Sydney2012型RdRp區(qū)分析發(fā)現(xiàn)有5個(gè)氨基酸位點(diǎn)特異性突變，并且此5個(gè)位點(diǎn)靠近RdRp功能區(qū)[26]，有學(xué)者推測(cè)GII.P16型RdRp區(qū)這些位點(diǎn)的突變改變了新重組型病毒的傳播能力，從而使其能夠廣泛的流行[27]；由于目前對(duì)于GII.P16-GII.2認(rèn)識(shí)尚還不全面，這些氨基酸位點(diǎn)突變對(duì)于GII.P16-GII.2型的流行的貢獻(xiàn)還待進(jìn)一步確認(rèn)。

舟山市海島地區(qū)在本輪暴發(fā)疫情中首次檢測(cè)到了諾如病毒新重組型GII.P16-GII.2，提示在今后的監(jiān)測(cè)工作中開展諾如病毒的RdRp及VP1區(qū)序列檢測(cè)、監(jiān)控本區(qū)域內(nèi)諾如病毒重組情況及特殊氨基酸位點(diǎn)的改變，以期及時(shí)識(shí)別新出現(xiàn)的變異株，同時(shí)加強(qiáng)監(jiān)測(cè)力度，明確該重組型別流行特征、趨勢(shì)及是否存在特異性臨床特征及易感人群的改變，為本區(qū)域諾如病毒的防控提供科學(xué)的依據(jù)。