大熊貓輪狀病毒CH-1株研究進(jìn)展

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輪狀病毒(Rotavirus,RV)是引起兒童發(fā)生嚴(yán)重腹瀉甚至死亡的重要病原[1]，它還能夠感染牛、豬、馬、羊、兔、禽、貓類(lèi)等動(dòng)物并引起病毒性腹瀉。在我國(guó)，王成東等于2009年首次從大熊貓腹瀉糞便中檢測(cè)出輪狀病毒，將其命名為大熊貓輪狀病毒(Giant Panda Rotavirus,GPRV)CH-1毒株。迄今為止，在人類(lèi)、哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)分離的RV根據(jù)病毒外殼特異性抗原可將RV分為A～I(xiàn) 9個(gè)不同的組，其中A、B、C和H組可感染人和動(dòng)物，而D、E、F、G和I組只感染動(dòng)物[2-4]。RV包括P和G兩種血清型，其中G1-G4、G9、P[8]和P[4]是最常見(jiàn)的流行優(yōu)勢(shì)株，在全球主要流行的RV基因型G1P[8]，G2P[4]，G3P[8]和G12P[8][5]。GPRV CH-1株的血清型為G1-P[7]-I5- R1-C1-M1-A1-N1-T1-E1-H1[6]。

GPRV CH-1株主要感染5-11月齡的斷奶大熊貓，感染后通常表現(xiàn)為體溫升高、嘔吐、水瀉、蛋花樣腹瀉，腹瀉物中含有血，白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞增多，淋巴細(xì)胞減少、腹水、頑固性胃腸脹氣、腹瀉遷延不愈甚至死亡等癥狀[7-8]，通過(guò)常規(guī)對(duì)癥治療能較大縮短該病的治療療程、治愈率達(dá)100 %，且很少出現(xiàn)并發(fā)癥[8]，但目前尚無(wú)有效疫苗和特效藥物對(duì)GPRV感染進(jìn)行防治，這對(duì)大熊貓的健康造成了嚴(yán)重威脅。

1 GPRV基因結(jié)構(gòu)及進(jìn)化特點(diǎn)

GPRV CH-1株屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬，病毒粒子呈球形似車(chē)輪狀，直徑70 nm[7]。GPRV CH-1株基因組為線狀雙股RNA，它包含11個(gè)基因片段(1-11)，這些基因分別編碼6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(VP1-VP4，VP6，VP7)和5個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1-NSP5)，長(zhǎng)度分別為3 287 bp，2 717 bp，2 591 bp，2 362 bp，1 356 bp，1 042 bp，1 532 bp，1 042 bp，1 017 bp，750 bp，663 bp。其中VP4、VP6、VP7是GPRV的主要抗原性基因[9-16]。每個(gè)基因片段分別包含一個(gè)開(kāi)放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)[6]，長(zhǎng)度分別為3 267 bp，2 673 bp，2 508 bp，2 362 bp，1 194 bp，981 bp，1 461 bp，954 bp，942 bp，528 bp和594 bp另外，GPRV CH-1株的VP1，VP3，VP4，VP6，VP7和NSP4基因主要與人或豬RV的基因的進(jìn)化距離最近，其同源性見(jiàn)表1[10-15]。

表1 GPRV CH-1株基因序列與人和豬RV的同源性Tab.1 Homologies for the rotavirus genes from giant panda,human and porcine

2 病毒蛋白

蛋白質(zhì)是病毒粒子的主要成分，具有重要的功能。GPRV CH-1株有11種蛋白成分，包括6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白與5個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。編碼結(jié)構(gòu)蛋白(VP1-VP4，VP6，VP7)的氨基酸長(zhǎng)度分別為1 088，890，835，776，397，326 aa以及編碼非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1-NSP5)的氨基酸長(zhǎng)度分別為486，317，313，175和197 aa[6]。對(duì)這些蛋白的信號(hào)肽、跨膜區(qū)、疏水性、抗原表位、N-糖基化作用位點(diǎn)、蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、酪蛋白激酶II磷酸化作用位點(diǎn)和N-豆蔻?；稽c(diǎn)等結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，其中N-糖基化作用位點(diǎn)、蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、酪蛋白激酶II磷酸化作用位點(diǎn)和N-豆蔻?；稽c(diǎn)分別與抗原性和免疫原性[17]，介導(dǎo)胞外分泌[18]，病毒凋亡和病毒周期的調(diào)節(jié)[19]和蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或線粒體外膜[20]這些生物學(xué)功能有關(guān)，但對(duì)VP2蛋白的生物信息學(xué)特點(diǎn)暫無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。表2是GPRV CH-1株(VP2除外)結(jié)構(gòu)蛋白的生物信息學(xué)特點(diǎn)。

表2 GPRV CH-1株結(jié)構(gòu)蛋白的生物信息學(xué)特點(diǎn)Tab.2 Bioinformatics characteristics of structural proteins of GPRV strain CH-1

注：通過(guò)ProtScale分析的蛋白質(zhì)疏水性，為蛋白質(zhì)的最小疏水性與最大疏水性，正值表明疏水，負(fù)值表明親水。

3 實(shí)驗(yàn)室診斷

采取發(fā)病大熊貓的嘔吐物、腹瀉便、肛拭子、血液等樣本進(jìn)行抗原檢測(cè)，包括輪狀病毒糞便抗原ELISA診斷試劑盒和病毒分離鑒定等[7]。另外，通過(guò)提取樣本中的RNA，進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)，包括RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)擴(kuò)增[21]和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)[22]等方法。

3.1抗原檢測(cè) 王成東等[7]用蘭州生物制品研究所生產(chǎn)的RV糞便抗原ELISA診斷試劑盒檢測(cè)腹瀉物出現(xiàn)RV陽(yáng)性結(jié)果；同時(shí)將處理過(guò)的標(biāo)本接種于MA-104細(xì)胞進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)，出現(xiàn)病變以后，用檢測(cè)抗原或核酸方法鑒定病毒。通過(guò)電鏡形態(tài)觀察、理化特性、中和實(shí)驗(yàn)等方法，鑒定分離到的病毒顆粒為RV。

3.2分子診斷 GPRV CH-1株在大熊貓糞便中含量較高，可通過(guò)提取大熊貓糞便的總RNA進(jìn)行分子生物學(xué)診斷，即常規(guī)RT-PCR和qRT-PCR。根據(jù)GPRV CH-1株保守基因VP7序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)從大熊貓糞便中提取到的RNA和實(shí)驗(yàn)室保存病毒液的RNA同時(shí)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將得到的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，RT-PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并測(cè)序，最低可以檢測(cè)出大約1pg的病毒RNA，該診斷結(jié)果重復(fù)性較好，可用于GPRV CH-1株的臨床快速診斷[21]。此外，根據(jù)GPRV CH-1株VP4基因序列設(shè)計(jì)引物[22]，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，最低可檢測(cè)到的拷貝數(shù)為1.0×100拷貝/μL，與常規(guī)RT-PCR相比，其靈敏度至少高出100倍，兩種方法的特異性與重復(fù)性均較好[21-22]。

通過(guò)上述兩種方法[23]對(duì)2011至2015年(除2014年)大熊貓基地A和B共227份大熊貓糞便中的GPRV CH-1株進(jìn)行檢測(cè)，利用qRT-PCR方法檢測(cè)出25份陽(yáng)性糞便樣品，陽(yáng)性率為11%(25/227)，而利用常規(guī)RT-PCR只檢出15份陽(yáng)性糞便樣品，陽(yáng)性率為6.6%(15/227)，表明qRT-PCR更適用于GPRV CH-1株的診斷檢測(cè)。因此，一旦發(fā)現(xiàn)有腹瀉等癥狀，應(yīng)及時(shí)采取qRT-PCR方法對(duì)大熊貓的糞便進(jìn)行快速且精確的檢測(cè)，以預(yù)防更嚴(yán)重的傳染。目前對(duì)于RNA病毒的檢測(cè)，RT-LAMP(loop-mediated isothermal amplification)是快速且靈敏的方法，該方法簡(jiǎn)便易操作不需要高端儀器，直接通過(guò)肉眼觀察結(jié)果，可快速檢測(cè)病原[24-26]，但目前仍然沒(méi)有用于檢測(cè)GPRV CH-1株。

4 防治措施

RV主要是通過(guò)水源傳播或呼吸道傳播，因此，預(yù)防RV感染的主要措施是關(guān)注大熊貓的飲食方面的健康。同時(shí)，RV是人獸共患病毒，保證大熊貓與其接觸人員的安全距離也極其重要。另外，飼養(yǎng)員應(yīng)定期收集大熊貓糞便，定期檢測(cè)GPRV CH-1株感染情況。一旦診斷發(fā)現(xiàn)為GPRV CH-1株感染，及時(shí)采取隔離辦法并治療感染大熊貓。對(duì)于GPRV CH-1株感染主要可通過(guò)對(duì)癥治療和常規(guī)抗感染治療，這能縮短該病的治療療程且治愈率高達(dá)100%，主要包括：抗生素治療；及時(shí)糾正水、電介質(zhì)和酸堿平衡紊亂；及時(shí)調(diào)整人工配乳的濃度和飼喂量；使用消化酶、腸黏膜保護(hù)劑以及使用微生態(tài)制劑進(jìn)行腸道菌群調(diào)整，而且被治愈的大熊貓很少出現(xiàn)并發(fā)癥[8]。

目前尚無(wú)有效疫苗預(yù)防GPRV CH-1株感染和特異性治療藥物，但馬磊將GPRV CH-1株的VP4和VP7基因與真核表達(dá)載體pVAX1進(jìn)行定向連接，構(gòu)建出真核表達(dá)質(zhì)粒，再將其轉(zhuǎn)化入減毒鼠傷寒沙口氏菌，這為研究以減毒沙門(mén)氏菌為載體的GPRV CH-1株疫苗的生物學(xué)性質(zhì)奠定了基礎(chǔ)[27]，同時(shí)為預(yù)防大熊貓感染GPRV起著重要作用。

5 展 望

大熊貓是我國(guó)珍稀動(dòng)物，其繁殖率與生存率也較低，而 GPRV CH-1株主要感染幼齡大熊貓，引起大熊貓腹瀉甚至死亡，在2000-2003年，成都大熊貓繁育研究基地的RV發(fā)病率為 64.7%。由于成年動(dòng)物感染輪狀病毒多為隱性經(jīng)過(guò)，并持久地向外界排毒，加之輪狀病毒對(duì)環(huán)境因子和許多常見(jiàn)消毒劑有較強(qiáng)抵抗力，導(dǎo)致某一地方發(fā)病，隨后的每年會(huì)連續(xù)發(fā)生[8]。但是通過(guò)常規(guī)對(duì)癥治療后治愈率達(dá)100%，現(xiàn)目前對(duì) GPRV CH-1株的相關(guān)研究主要在于其感染來(lái)源、診斷方法、防治措施和GPRV CH-1株的分子特點(diǎn)，病毒感染發(fā)病機(jī)制及機(jī)體免疫應(yīng)答機(jī)制的相關(guān)研究缺乏，造成了對(duì) GPRV CH-1株認(rèn)識(shí)的不足。另外，由于病毒的侵入會(huì)引起宿主細(xì)胞的蛋白表達(dá)模式改變，將影響宿主細(xì)胞的正常生理功能并決定病毒的致病進(jìn)程和結(jié)果[28-30]，因此通過(guò)研究病毒感染宿主細(xì)胞后引起的細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)水平的變化，將有利于揭示病毒與宿主或宿主細(xì)胞的相互作用機(jī)制和病毒分子致病機(jī)制。

根據(jù)中國(guó)GPRV的研究現(xiàn)狀，應(yīng)加強(qiáng)以下幾方面的研究：加強(qiáng)GPRV流行病學(xué)調(diào)查，分離新毒株并進(jìn)行基因組學(xué)與蛋白組學(xué)研究，了解GPRV不同分離株基因型分布情況；進(jìn)行GPRV感染其宿主細(xì)胞后的轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)組水平分析GPRV感染復(fù)制機(jī)制、致病機(jī)制及機(jī)體免疫應(yīng)答機(jī)制的相關(guān)研究；加強(qiáng)病原診斷與疫苗以及抗病毒藥物的研發(fā)等。