小鼠泡型包蟲囊液對小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞表達(dá)IDO的影響

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泡型包蟲病(alveolar echinococcosis,AE)是由多房棘球絳蟲(Echinococcusmultilocularis,E.m)幼蟲所引起的一類嚴(yán)重人獸共患寄生蟲病[1]，我國是該病發(fā)病率最高的國家之一[2]，AE蚴囊呈多泡型出芽方式生長，類似惡性腫瘤被稱為“蟲癌”[3]。AE病原泡球蚴具有免疫耐受能力，可以在宿主體內(nèi)長期寄生不被殺滅[4]，但其具體作用機(jī)制尚不明確。樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)是機(jī)體功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cell,APC)，可以參與機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫耐受[5]，是研究慢性感染疾病調(diào)控宿主免疫應(yīng)答機(jī)制的重要靶點(diǎn)[6]。研究表明，一些寄生蟲抗原成分可以誘導(dǎo)宿主DCs 表面吲哚胺 2,3-雙加氧酶(indoleamin 2,3-dioxygenase,IDO)高表達(dá)，引起微環(huán)境中色氨酸耗竭進(jìn)而影響了宿主 DCs正常免疫功能，最終介導(dǎo)機(jī)體免疫耐受的形成，這一途徑被認(rèn)為是寄生蟲感染宿主發(fā)生免疫耐受的分子機(jī)制之一[7]。研究發(fā)現(xiàn)，囊性包蟲病(cystic echinococcosis,CE)感染宿主形成的免疫耐受與宿主DCs 表面IDO高表達(dá)有關(guān)[8]，目前關(guān)于AE感染過程中是否同樣具有上調(diào)宿主DCs表面IDO的能力，并參與到AE免疫耐受途徑中還不清楚。本研究以小鼠泡型包蟲囊液(multilocular cyst fluid,MCF)與小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞(bone marrow dendritic cells,BMDCs)共培養(yǎng)為模型，在不同時(shí)間點(diǎn)通過Real-time PCR、Western blotting和ELISA等方法動(dòng)態(tài)監(jiān)測MCF 對BMDCs表面IDO mRNA轉(zhuǎn)錄水平、蛋白水平以及BMDCs上清液中IDO濃度變化的影響，探討AE免疫耐受與MCF誘導(dǎo)宿主BMDCs表達(dá)IDO的關(guān)系，為進(jìn)一步揭示AE感染宿主的免疫耐受分子機(jī)制提供理論支持。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8 周齡SPF級(jí)健康C57BL/6小鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)過程中對動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證為SYXK(蘇)2012-0004。

1.2主要試劑及儀器 小鼠泡型包蟲囊液(multilocular cyst fluid,MCF)由新疆醫(yī)學(xué)動(dòng)物模型研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，小鼠重組粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rmGM-CSF)、小鼠重組II型γ干擾素(rmIFN-γ)購自美國R&D Systems公司，RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液購自美國 Hyclone公司，胎牛血清(FBS)購自美國ExCell Biology公司，Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，cDNA第一鏈合成試劑盒購自美國Thermo Fisher公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司，兔抗鼠IDO多克隆抗體、兔抗鼠GAPDH多克隆抗體和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠 IgG均購自英國Abcam公司，鼠IDO酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自美國BioSciences公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(DA7600)為中國中山達(dá)安公司產(chǎn)品，Western 電泳儀(164-5051)和凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc 2000)均為美國BIO-RAD公司產(chǎn)品，酶標(biāo)儀(ELx800)為美國 BioTek公司產(chǎn)品。

1.3小鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 將C57BL/6小鼠頸椎脫位法處死，無菌狀態(tài)下分離股骨和脛骨髓細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)將細(xì)胞懸浮，分至6孔培養(yǎng)板中加入rmGM-CSF(終濃度10 ng/mL)和IL-4(終濃度1 ng/mL)，將細(xì)胞培養(yǎng)板置5%、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，隔天半量換液并補(bǔ)足rmGM-CSF，培養(yǎng)至第7 d，用吸管輕輕吹打后收集所有懸浮細(xì)胞，即為富集的小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞(bone marrow dendritic cells,BMDCs)。將誘導(dǎo)培養(yǎng)分離到的BMDCs用 RPMI-1640 培養(yǎng)基重懸調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106cells/mL，分別用MCF(終濃度為5 mg/mL)和rmIFN-γ(終濃度為1 000 U/mL,作為陽性對照組)進(jìn)行體外培養(yǎng)，同時(shí)加入相同體積 RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)作為陰性對照組，分別在6 h、18 h、24 h、48 h和60 h收集各組細(xì)胞和上清液。

1.4BMDCs表面IDO mRNA相對表達(dá)量的檢測根據(jù)GenBank中小鼠IDO(登錄號(hào)：NM_008324.2)和 GAPDH(登錄號(hào)：NM_008084.3)序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，引物由江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司合成，IDO(F：5′-AGCAATCCCCACTGTATCCA-3′；R：5′-GGTCCACAAAGTCACGCATC-3′)， GAPDH(F：5′-AAGGTCGGTGTGAACGGATT-3′，R：5′-TGAGTGGAGTCATACTGGAACAT-3′)。采用Trizol法提取各組BMDCs總RNA，將提取的RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈按試劑盒操作說明書進(jìn)行。使用SYBR Premix ExTaqTMII 熒光定量試劑盒在熒光定量PCR儀上進(jìn)行IDO基因相對定量分析。反應(yīng)體系為20 μL：SYBR Premix ExTaqTMII (2×) 10 μL，cDNA模板1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。以GAPDH為內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，對每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)重復(fù)測定，所得數(shù)據(jù)采用相對比較Ct法(Qr=2-△△Ct)分析，以確定IDO mRNA相對表達(dá)量。

1.5BMDCs表面IDO蛋白相對表達(dá)水平的檢測收集各組不同時(shí)間點(diǎn)BMDCs，用胰酶消化后分別加入細(xì)胞裂解液充分裂解，4 ℃ 13 000×g 離心 10 min，收集上清即為細(xì)胞總蛋白。BCA法檢測各組蛋白濃度后，經(jīng) 12% SDS-PAGE電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)染至PVDF 膜上經(jīng)封閉和漂洗后，分別加入兔抗鼠IDO抗體(稀釋比例1∶50)和兔抗鼠GAPDH(稀釋比例1∶25 000)4 ℃孵育過夜，洗膜后加入羊抗鼠 IgG-HRP二抗(稀釋比例1∶10 000)室溫孵育2 h，洗膜3次后用ECL試劑盒顯色，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并分析，以IDO蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶灰度值之比表示目的IDO蛋白的相對表達(dá)水平。

1.6BMDCs上清液中IDO濃度的檢測 收集各組不同時(shí)間點(diǎn)BMDCs上清液，按照小鼠IDO ELISA試劑盒操作說明書檢測BMDCs上清液中IDO的濃度，每個(gè)檢測樣品設(shè)立兩個(gè)復(fù)孔，吸收波長為450 nm。

2 結(jié) 果

2.1BMDCs表面IDO mRNA相對表達(dá)量動(dòng)態(tài)檢測 采用Real-time PCR方法對陰性對照組、陽性對照組和MCF組5個(gè)時(shí)間點(diǎn)BMDCs表面IDO mRNA相對表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示(圖1)，從6 h開始MCF處理組的BMDCs表面IDO mRNA表達(dá)量逐漸增高，24 h達(dá)到最高值(34.383±1.803)，與陰性對照組(13.289±1.072) 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=303.305，P<0.01)，與陽性對照組(46.884±4.962)差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=16.816，P<0.05)見表1，MCF刺激24 h之后BMDCs表面IDO mRNA相對表達(dá)量逐漸下降。

圖1 不同處理組BMDCs的IDO mRNA相對表達(dá)量動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of relative expression of IDO mRNA by different treated BMDCs

表1 3組不同時(shí)間 BMDCs表面IDO mRNA相對表達(dá)量比較Tab.1 Relative expression of IDO mRNA in three groups of BMDCs at different time

注：同一時(shí)間點(diǎn)，與陰性對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與陽性對照組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

圖2 不同處理組BMDCs中IDO蛋白表達(dá)Western boltting動(dòng)態(tài)檢測Fig.2 Western boltting detection of IDO expression by different treated BMDCs

2.2BMDCs表面IDO蛋白相對表達(dá)水平動(dòng)態(tài)檢測 采用 Western blotting方法檢測陰性對照組、陽性對照組和MCF組不同時(shí)間點(diǎn)BMDCs表面IDO蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果見圖2。MCF處理組從6 h開始BMDCs表達(dá)IDO逐漸增加，48 h達(dá)高峰之后逐漸減弱(圖3)，MCF處理組IDO蛋白的表達(dá)在48 h達(dá)高峰延遲于IDO mRNA的表達(dá)。48 h時(shí)BMDCs表面IDO蛋白及相應(yīng) GAPDH 蛋白的灰度值之比MCF組(0.758±0.047)高于陰性對照組(0.503±0.024) (F=70.971，P<0.01)，而MCF組與陽性對照組(0.847±0.067)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.648，P>0.05)，見表2。

圖3 不同處理組BMDCs中IDO蛋白相對表達(dá)水平動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Dynamic changes of relative expression of IDO protein by different treated BMDCs

表2 3組不同時(shí)間BMDCs表面IDO蛋白相對表達(dá)水平比較Tab.2 Relative expression of IDO protein in three groups of BMDCs at different time

注：同一時(shí)間點(diǎn)，與陰性對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與陽性對照組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

2.3BMDCs上清液中IDO濃度動(dòng)態(tài)檢測 采用 ELISA方法檢測陰性對照組、陽性對照組和MCF組不同時(shí)間點(diǎn)BMDCs上清液中IDO濃度動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果顯示(圖4)，從6 h開始MCF組BMDCs上清液中IDO濃度逐漸增高，24 h達(dá)到最高值(33.801±0.448 ng/mL)，與陰性對照組(13.811±0.086 ng/mL)和陽性對照組(45.523±0.493 ng/mL)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5752.473、927.464，P<0.01)，見表3。MCF刺激24 h之后BMDCs上清液中IDO濃度逐漸下降，5個(gè)時(shí)間點(diǎn)BMDCs上清液中所檢測的IDO濃度變化趨勢與IDO mRNA表達(dá)變化趨勢相一致。

3 討 論

包蟲病是由棘球?qū)俚募蚪{蟲寄生于人和動(dòng)物體內(nèi)所引起的一種人獸共患慢性蠕蟲性疾病，該病天然免疫細(xì)胞DCs在免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]，是連接固有免疫與獲得性免疫的橋梁，其活化狀態(tài)決定了Th1型細(xì)胞和Th2型細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)的方向，當(dāng)Th1型細(xì)胞向Th2 型細(xì)胞發(fā)生極化漂移時(shí)可以介導(dǎo)機(jī)體發(fā)生免疫耐受[12]。IDO是肝外唯一催化色氨酸沿犬尿氨酸途徑分解代謝的限速酶，是調(diào)節(jié)宿主 DCs 發(fā)生免疫耐受的一個(gè)重要分子開關(guān)[13]，已有研究表明，囊型包蟲病感染過程中宿主DCs表面IDO高表達(dá)可以抑制Th1型細(xì)胞正常免疫功能，促使機(jī)體產(chǎn)生Th2型反應(yīng)[14]，并證實(shí)Th1/Th2型細(xì)胞失衡與囊型包蟲病免疫耐受形成有關(guān)聯(lián)[15]。本研究以BMDCs與MCF共培養(yǎng)為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，在不同時(shí)間點(diǎn)動(dòng)態(tài)監(jiān)測BMDCs表達(dá) IDO情況，結(jié)果顯示MCF處理組的BMDCs表面IDO mRNA相對表達(dá)量和BMDCs上清液中IDO濃度24 h均達(dá)到最高值，與陰性對照組差異極顯著(F=303.305、5752.473，P<0.01)，而MCF處理組BMDCs表面IDO蛋白表達(dá)水平在48 h達(dá)到峰值滯后IDO mRNA轉(zhuǎn)錄水平，主要原因可能是由泡型包蟲囊液抗原成分復(fù)雜造成，不同時(shí)間點(diǎn)泡型包蟲囊液誘導(dǎo)BMDCs表達(dá) IDO變化趨勢，與單驕宇用小鼠囊型包蟲囊液誘導(dǎo)BMDCs表達(dá) IDO動(dòng)態(tài)檢測所分析的變化趨勢相一致[8,14]，說明泡型包蟲病和囊型包蟲病感染致宿主樹突狀細(xì)胞高表達(dá)IDO具有相似性，為進(jìn)一步研究泡型包蟲病感染過程中宿主DCs表面IDO對Th1/Th2型細(xì)胞的影響，以及探討泡型包蟲病免疫耐受的相關(guān)分子機(jī)制奠定了一定實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。

圖4 不同處理組BMDCs上清液中IDO濃度動(dòng)態(tài)變化Fig.4 Dynamic changes of IDO concentrations in supernatants by different treated BMDCs

表3 三組不同時(shí)間 BMDCs上清液中IDO濃度檢測比較Tab.3 Detection of IDO concentrations in three groups of BMDCs supernatants

注：同一時(shí)間點(diǎn)，與陰性對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與陽性對照組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

在世界范圍內(nèi)廣泛流行，現(xiàn)已報(bào)道的能夠引起人感染棘球絳蟲病原有細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococusgranulosus,Eg)、多房棘球絳蟲(Echinococusmultilocularis,Em)、少節(jié)棘球絳蟲(Echinococusoligathrus,Eo)和伏氏棘球絳蟲(Echinococusvogeli,Ev) 4 種，我國流行區(qū)域感染人的棘球絳蟲主要為Eg和Em[9]。AE是由Em引起，主要侵害人或動(dòng)物的肝臟，呈浸潤方式生長，通過浸潤還可以轉(zhuǎn)移至肺臟、腦部等其他組織器官而形成轉(zhuǎn)移病灶。據(jù)統(tǒng)計(jì)，未經(jīng)治療的 AE患者 10 年病死率高達(dá) 94%，已成為危害人類健康的世界性公共衛(wèi)生問題之一[10]。目前，AE免疫耐受機(jī)制還不清楚，對其進(jìn)行研究探討有助于尋找新的免疫治療方法以及在探索更為有效的防治思路等方面具有重要的意義。

綜上所述，本研究通過體外實(shí)驗(yàn)證明了AE感染過程中調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答的主要抗原成分MCF可以誘導(dǎo)BMDCs表面IDO高表達(dá)，這一現(xiàn)象提示樹突狀細(xì)胞表面IDO高表達(dá)可能與泡型包蟲病免疫耐受分子機(jī)制的形成有關(guān)。然而有關(guān)IDO分子調(diào)控機(jī)制具體所發(fā)揮的作用還需通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步加以驗(yàn)證，如建立AE感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，通過收集AE感染不同時(shí)期的DCs檢測IDO表達(dá)情況和Th1/Th2細(xì)胞因子分泌情況，并探討IDO表達(dá)對DCs分泌Th1/Th2細(xì)胞因子的影響，以確認(rèn)IDO是否參與AE慢性感染致宿主的免疫耐受過程。