評(píng)估3種不同毒株的豬偽狂犬病活疫苗的免疫效果

林文耀，宋慶慶，劉玉梅，劉國(guó)民，黃 超

（金宇保靈生物藥品有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030）

豬偽狂犬病（Pseudorabies,PR）是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的以繁殖障礙、神經(jīng)癥狀、呼吸道等為主要臨床癥狀的一種重要傳染病，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展，早期由于疫苗的成功應(yīng)用使得該病得到較好的防控。但自2011年以來豬偽狂犬病變異毒株的出現(xiàn)，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。主要表現(xiàn)為豬群gE抗體陽性率顯著升高，發(fā)病妊娠母豬流產(chǎn)，產(chǎn)弱仔、死胎；新生仔豬死亡率高，同時(shí)出現(xiàn)角弓反張等神經(jīng)癥狀，病死率在10%～50%。病毒的分離鑒定表明疫病由變異PRV毒株引起，并且新流行毒株處于獨(dú)立的進(jìn)化分支，這對(duì)PR的防控提出了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[1-3]。目前，疫苗仍然是防控豬偽狂犬病的主要手段。但是由于保護(hù)性抗原的變異導(dǎo)致傳統(tǒng)的疫苗對(duì)新流行的毒株不能提供完全的保護(hù)[4-5]，而且中國(guó)獸藥信息網(wǎng)的獸藥基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫顯示不同生產(chǎn)廠家的豬偽狂犬病疫苗批簽發(fā)多達(dá)30多個(gè)，如何評(píng)估各個(gè)廠家不同毒株疫苗的免疫效果是養(yǎng)殖業(yè)迫切關(guān)心的問題。為了給豬場(chǎng)如何選擇高效的疫苗提供參考數(shù)據(jù)，本文選擇了市場(chǎng)占有率較高的3種不同毒株的豬偽狂犬病活疫苗，檢測(cè)豬偽狂犬病gE、gB、中和抗體效價(jià)，評(píng)估不同毒株疫苗的免疫效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)疫苗

選取3種不同毒株的活疫苗，分別為A疫苗（國(guó)內(nèi)最新分離株C株，江蘇某公司生產(chǎn)，批號(hào)18251002），B 疫苗（HB2000株，湖北某公司生產(chǎn)，批號(hào) 171224），C 疫苗（Bartha-K61株，某進(jìn)口產(chǎn)品，批號(hào) L447795）。

1.2 試驗(yàn)豬場(chǎng)

某豬偽狂犬病gE抗體陰性的一點(diǎn)式生產(chǎn)的豬場(chǎng)，豬偽狂犬病疫苗的免疫程序：出生滴鼻1頭份，70日齡肌注1頭份，100日齡加強(qiáng)免疫1頭份。試驗(yàn)期為2018年2月8日至6月18日。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取3棟產(chǎn)房依次編號(hào)為A、B、C。A產(chǎn)房的新生小豬滴鼻免疫A疫苗，做好耳號(hào)標(biāo)記，如此類推。隨機(jī)挑選分別滴鼻免疫了A、B、C疫苗的70日齡健康仔豬各30頭（分別命名為A組、B組、C組），分別肌注A、B、C疫苗各1頭份，100日齡加強(qiáng)免疫1頭份。首次免疫前、二免前、二免后30d全組采血，分離血清，-20℃冷凍保存?zhèn)溆?，分別進(jìn)行豬偽狂犬病gE、gB、中和抗體檢測(cè)。

1.4 方法

1.4.1 gE、gB抗體檢測(cè) 采用海博萊公司生產(chǎn)的豬偽狂犬病病毒PRV-gE、PRV-gB抗體ELISA診斷試劑盒，檢測(cè)按照試劑盒說明書的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行。

1.4.2 中和抗體檢測(cè) 采集的試驗(yàn)豬只血清分別使用經(jīng)典的HB-J毒株和分離到的變異毒株CW毒株進(jìn)行細(xì)胞中和試驗(yàn)，檢測(cè)血清中和抗體滴度，評(píng)判免疫效果。具體操作方法按文獻(xiàn)進(jìn)行[6]。使用GraphPadPrism6軟件對(duì)每組的平均中和抗體效價(jià)分析顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 3種不同毒株豬偽狂犬病活疫苗免疫后gE抗體檢測(cè)結(jié)果

A組、B組、C組的豬偽狂犬病病毒gE抗體陽性率均為0，說明試驗(yàn)期間豬場(chǎng)沒有受到豬偽狂犬病野毒感染。

2.2 3種不同毒株豬偽狂犬病活疫苗免疫后gB抗體檢測(cè)結(jié)果

如表1所示，首免前A、B、C這3組gB抗體陽性率分別為66.67%、60.00%、60.00%，二免前、二免后30 d 3組的gB抗體陽性率均為100%，沒有顯著差異。

表1 3種不同毒株豬偽狂犬病活疫苗免疫后gB抗體檢測(cè)結(jié)果

2.3 3種不同毒株豬偽狂犬病活疫苗免疫后中和抗體的檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 對(duì)比3種不同毒株豬偽狂犬病活疫苗免疫1次的平均中和抗體 如表2所示，A組疫苗在1次免疫30 d后對(duì)經(jīng)典毒株HB-J和變異毒株CW都產(chǎn)生較高的中和抗體，高于B組、C組，差異顯著。

表2 3種不同毒株豬偽狂犬病活疫苗免疫1次的平均中和抗體

2.3.2 對(duì)比3種不同毒株豬偽狂犬病活疫苗免疫2次的平均中和抗體 如表3所示，與1次免疫比較，A組疫苗在2次免疫30 d后對(duì)經(jīng)典毒株HB-J和變異毒株CW都產(chǎn)生較高的中和抗體，高于1次免疫后的滴度，差異顯著。B組、C組在2次免疫后中和抗體提升不明顯。

表3 3種不同毒株豬偽狂犬病活疫苗免疫2次的平均中和抗體

3 分析與討論

2011年以來，由于豬偽狂犬病病毒變異株的出現(xiàn)，我國(guó)多數(shù)地區(qū)相繼暴發(fā)PR疫情，PRV陰性的免疫豬群發(fā)病的案例時(shí)有發(fā)生，說明傳統(tǒng)的疫苗對(duì)新流行的變異毒株不能提供完全的保護(hù)。如何選擇高效的疫苗預(yù)防PR疫情的發(fā)生，是整個(gè)養(yǎng)豬業(yè)迫切關(guān)心的問題。

本研究通過對(duì)比3種不同毒株活疫苗的免疫效果，發(fā)現(xiàn)首次免疫和2次免疫后，雖然3種疫苗gB抗體陽性率都達(dá)到100%，但是中和抗體的水平差異顯著。總體而言，2次免疫后A疫苗對(duì)經(jīng)典株和變異株都產(chǎn)生較高的中和抗體水平。B組、C組第2次加強(qiáng)免疫后產(chǎn)生的中和抗體水平與1次免疫差異不大，與我們實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果相符：傳統(tǒng)疫苗免疫多次后中和抗體效價(jià)依然偏低（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。值得注意的是A疫苗對(duì)變異株的中和能力高于經(jīng)典株，與B疫苗和C疫苗結(jié)果相反，可能與A疫苗為最新分離毒株，和新流行毒株抗原位點(diǎn)更匹配有關(guān)。

中和抗體是B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一種可溶性蛋白，能夠與病原微生物表面的抗原結(jié)合，使其失去感染力的抗體。偽狂犬病病毒的中和抗體有多種，包括gB抗體、gC抗體和gD抗體等。由于gB-ELISA試劑盒的方便使用，養(yǎng)豬業(yè)評(píng)估疫苗免疫效果往往只關(guān)注gB抗體的檢測(cè)。但gB抗體只是中和抗體的一部分。gC和gD抗體同時(shí)也發(fā)揮著重要的作用。gC抗體可以抑制病毒在靶細(xì)胞上的黏附作用，gD抗體具有抑制病毒穿入的作用，可以有效阻斷病毒的侵入[7-8]。而且gB抗體的檢測(cè)采用的是競(jìng)爭(zhēng)ELISA的方法，只能定性，不能定量，無法明確知道抗體的滴度。如本研究結(jié)果，gB抗體陽性率都達(dá)到100%，這單一結(jié)果無法有效評(píng)估疫苗的優(yōu)良。因此，建議養(yǎng)豬業(yè)在評(píng)估豬偽狂犬病疫苗免疫效果檢測(cè)gB抗體的同時(shí)，進(jìn)行中和抗體的評(píng)估?？梢酝ㄟ^中和試驗(yàn)評(píng)估中和抗體效價(jià)，檢測(cè)血清的抗體中和病毒的中和效價(jià)，效價(jià)越高說明中和病毒的能力越強(qiáng)，可以有效提高感染的閾值，減少感染后的臨床癥狀以及損失，縮短排毒時(shí)間和減少排毒量。后續(xù)，我們會(huì)進(jìn)行A疫苗對(duì)經(jīng)典株和變異株的保護(hù)效力試驗(yàn)，評(píng)估A疫苗與臨床攻毒保護(hù)的直接關(guān)系。本研究A疫苗2次免疫后產(chǎn)生的中和效價(jià)高于活疫苗+滅活疫苗+滅活疫苗的免疫組合方案產(chǎn)生的中和抗體，可能與疫苗毒株的免疫原性，疫苗的生產(chǎn)工藝和抗原含量，佐劑等有關(guān)系，提示A疫苗可以作為防控豬偽狂犬病的高效疫苗[9]，有效簡(jiǎn)化現(xiàn)有“活+死”免疫組合方案，簡(jiǎn)化豬場(chǎng)免疫程序，降低疫苗成本。