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    山西豬偽狂犬病免疫與野毒感染情況調(diào)研

    2018-12-13 06:13:16樊振華薛翼鵬米瑞娟王娟萍姚敬明閆益波
    養(yǎng)豬 2018年6期
    關(guān)鍵詞:野毒狂犬病豬場

    杜 彬,孟 帆,樊振華,吳 忻,趙 岳,薛翼鵬,米瑞娟,王娟萍,姚敬明,閆益波

    (山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,山西 太原 030032)

    豬偽狂犬病(PR)是由豬偽狂犬病病毒(PRV)引起的一種高度接觸性、急性傳染病,豬是本病的天然宿主、貯存者和傳播者[1-3]。該病毒破壞豬的神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等,可引起豬群持續(xù)感染,終身帶毒,現(xiàn)在已成為對全球養(yǎng)豬業(yè)危害最大的傳染病之一。中國自1947年首次報道該病以來,隨著養(yǎng)豬業(yè)集約化規(guī)?;陌l(fā)展,許多種豬場呈暴發(fā)流行趨勢。自20世紀80年代以gE基因為代表的基因缺失疫苗研制成功以后,許多國家應(yīng)用gE基因缺失的偽狂犬病病毒弱毒疫苗,配合gE單抗ELISA鑒別診斷方法成功地撲滅了偽狂犬病。在我國gE基因缺失疫苗的廣泛使用也使該病得到有效控制。但是2012年以來,許多使用gE基因缺失活疫苗免疫的豬場出現(xiàn)了疑似偽狂犬病的臨床癥狀[4-8],而且這種狀況在近兩三年內(nèi)已蔓延到全國二十多個省市的豬場。山西2013年以來也有母豬發(fā)生流產(chǎn)、仔豬疑似偽狂犬病死亡的類似情況,2016年、2017年、2018年項目組深入到山西不同地市,對11個規(guī)模型種豬場進行了豬偽狂犬病免疫防控和發(fā)病情況調(diào)研,同時采集血樣和病料進行了野毒感染抗體(gE)和豬偽狂犬病病毒檢測,現(xiàn)總結(jié)如下。

    1 試驗材料與方法

    1.1 調(diào)研豬場與方法

    在山西不同地市選擇有代表性的11個規(guī)模型種豬場,調(diào)查了解免疫情況、母豬產(chǎn)仔情況、仔豬生長發(fā)育和病死情況,同時采集母豬和仔豬血樣及時分離血清,-80℃冷凍保存?zhèn)溆?;采集有神?jīng)癥狀病死豬的延腦、淋巴、脾等組織,放液氮中冷凍并研磨,-80℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 檢測試劑盒

    豬偽狂犬病病毒gE蛋白ELISA抗體檢測試劑盒(阻斷法)由武漢科前動物生物股份有限公司生產(chǎn);豬偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒2型PCR檢測試劑盒由北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

    1.3 檢測方法與判定標準

    1.3.1 豬偽狂犬病病毒gE蛋白ELISA抗體檢測方法(抗體檢測按照ELISA檢測試劑盒操作步驟進行) 試劑盒使用前各試劑應(yīng)先平衡至室溫;首先將20倍濃縮洗滌液稀釋成1倍洗滌液備用;將待測血清(凍存標本應(yīng)平衡至室溫并充分混勻)及陽性對照和陰性對照用標本稀釋液按1∶1稀釋。以上工作準備好,取出PRV包被板,記錄陽性對照(2孔)、陰性對照(2孔)及待檢標本,分別加入100 μL PRV陽性對照血清、PRV陰性對照血清及已稀釋待檢標本于相應(yīng)孔中;接著用封板膜蓋好反應(yīng)板,置37℃溫育30 min(gE蛋白45 min)后小心去掉封板膜,甩盡板孔中液體,向每孔中加200 μL 1倍洗滌液,靜置3 min倒掉,重復(fù)5次,最后1次在吸水紙上拍干;然后向每孔加PRV酶標記物100 μL,用封板膜蓋好反應(yīng)板,置37℃溫育30 min(gE蛋白20 min)后重復(fù)上面的洗板操作步驟,再分別向每孔中加底物液A、底物液B各1滴(50 μL),混勻,室溫避光顯色10 min;最后分別向每孔中加終止液 1滴(50 μL)終止反應(yīng),10 min內(nèi)于630 nm波長酶標儀讀板。

    豬偽狂犬病病毒gE蛋白ELISA抗體檢測:在酶標儀上測各孔OD630nm值。試驗成立的條件是陰性對照孔平均OD630nm值與陽性對照孔平均OD630nm值之差≥0.3。S=樣品孔OD630nm值,N=陰性對照孔平均OD630nm值,若S/N值≤0.35,樣品判斷為陽性,S/N>0.4,樣品判斷為陰性,0.35<S/N≤0.4,樣品判斷為可疑,必須重測,如結(jié)果相同,則判為抗體陽性。

    1.3.2 豬偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒2型PCR檢測方法(病毒檢測按照PCR檢測試劑盒操作步驟進行) 取-70℃保存的血清或組織混懸液上清液和陽性、陰性對照100 μL至1.5 mL滅菌離心管中,8 000 r/min 離心 2 min,加入 200 μL 消化液和 20 μL蛋白酶K振蕩混勻后,置56℃水浴中消化1 h;取出降至室溫后,加入300 μL DNA結(jié)合液,顛倒混勻后移入吸附柱中,室溫靜置3 min,10 000 r/min離心30 s后棄去收集管液體,然后加入500 μL DNA洗滌液,10 000 r/min離心30 s,棄去收集管液體,重復(fù)加入500 μL DNA洗滌液洗滌后10 000 r/min離心1 min,將吸附柱放入新的1.5 mL滅菌離心管中,加入DNA洗脫液50 μL,室溫放置2 min,10 000 r/min離心30 s,獲取模板DNA。取2 μL模板DNA做PCR反應(yīng),取單管單份PRV PCR反應(yīng)管,加入模板DNA、PRV陽性對照和陰性對照各2 μL,10 000 r/min順時針離心30 s。將反應(yīng)管放入PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi),按下列反應(yīng)循環(huán)條件進行擴增:94℃→3 min,后94℃ 30 s→65℃ 30 s→72℃ 30 s,共35個循環(huán),再72℃延伸7 min。

    最后取豬偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒2型PCR產(chǎn)物10 μL與2 μL上樣緩沖液混合,加樣于凝膠孔內(nèi),在陽性對照成立的條件下,1.5%瓊脂糖凝膠確定在217 bp處有清晰目的條帶(圖1),判為豬偽狂犬病毒株和豬圓環(huán)病毒2型陽性(圖2)。

    圖1 豬偽狂犬病病毒PCR反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果

    圖2 豬圓環(huán)病毒2型PCR反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果

    2 結(jié)果

    2.1 免疫與生產(chǎn)情況調(diào)查

    被調(diào)研的11個種豬場主要使用上海海利生物技術(shù)股份有限公司、洛陽普萊柯生物工程有限公司、中牧實業(yè)股份有限公司、美國輝瑞生產(chǎn)的豬偽狂犬病gE基因缺失疫苗,有8個豬場母豬采取普免(1年每季度免疫1次),仔豬1日齡滴鼻,35日齡、65日齡注射3次免疫;3個豬場母豬產(chǎn)前25~28 d跟胎免疫,仔豬 6~8周、10~12周 2次免疫。仔豬病死率為17.14%,有神經(jīng)癥狀(疑似偽狂犬病)仔豬死亡率(占仔豬死亡數(shù))為1.41%,具體見表1。

    2.2 豬偽狂犬病野毒感染gE抗體檢測結(jié)果

    用豬偽狂犬病gE抗體檢測試劑盒共檢測母豬血樣388頭份,野毒感染陽性率為57.94%,仔豬血樣727頭份,陽性率為34.66%,11個場母豬野毒感染最高陽性率為83.33%、仔豬為70.00%,只有一個豬場仔豬沒有檢出野毒感染,詳見表2。

    表1 免疫與生產(chǎn)情況匯總

    表2 豬偽狂犬病gE抗體檢測結(jié)果

    2.3 豬偽狂犬病PCR病原和豬圓環(huán)病毒2型檢測結(jié)果

    用豬偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒2型PCR檢測試劑盒共檢測病料125份,其中豬偽狂犬病病毒陽性19份,豬圓環(huán)病毒2型陽性43份,兩種病混合感染陽性7份,詳見表3。

    表3 豬偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒2型PCR檢測結(jié)果

    3 小結(jié)與分析

    (1)通過對11個種豬場調(diào)查證實大部分豬場母豬采取普免,仔豬采取3次免疫,仔豬實行1日齡滴鼻免疫后有效控制了初生仔豬口吐白沫、有神經(jīng)癥狀及死亡,但2016年以來豬場母豬流產(chǎn)、仔豬疑似偽狂犬病死亡時有發(fā)生,可能與豬偽狂犬病病毒發(fā)生變異或毒力增強有關(guān)。

    (2)豬偽狂犬病gE抗體檢測證實豬群野毒感染率母豬為57.94%、最高感染率為83.33%;仔豬為34.66%、最高為70.00%,只有一個豬場仔豬沒有檢出野毒感染抗體。與雷宇平等報道2015年山西母豬群野毒感染率達49.06%,處于相對較高水平一致[9]。近幾年大部分豬場都實行3次免疫,臨床癥狀得到有效控制,但野毒感染率還較高,可能與環(huán)境控制、生物安全、頻繁引種、頻繁更換疫苗、病毒遺傳變異、毒力增強等有關(guān),需要進一步開展研究。11個豬場中只有一個豬場仔豬沒有檢出野毒感染抗體,該場實行自繁自養(yǎng),連續(xù)3年全部用上海海利疫苗免疫,沒有引進公豬,后備母豬從本場選留,環(huán)境控制較好,值得借鑒。

    (3)對疑似偽狂犬病病死豬125份病料進行豬偽狂犬病PCR病毒檢測出19份陽性,項目組對陽性病料進一步做了病毒分離鑒定和遺傳變異分析,材料正在整理中。在病毒檢測中發(fā)現(xiàn),在臨床癥狀上疑似豬偽狂犬病,但PCR病毒檢出率較低,這可能與采樣時間、部位、方法,以及采樣后在-80℃冷凍時間較長等有關(guān)。要進一步查找有關(guān)資料,請教專家,盡快解決這一難題。

    (4)按照國家《動物疫病防控中長期規(guī)劃(2012—2020年)》要求,2020年我國種豬場達到PRV凈化標準。血清學(xué)調(diào)查是制訂凈化策略的基礎(chǔ),本次檢測發(fā)現(xiàn)母豬gE抗體陽性率高達57.94%,如果采取“淘汰清群”的凈化方案,代價太大,且難以推廣落實。目前國內(nèi)的養(yǎng)殖模式,后備種豬一般都是從肥育階段選留的。在PRV野毒陽性發(fā)病的豬場,肥育豬感染帶毒率非常高,這增大了挑選出健康合格后備種豬的難度,不利于凈化工作開展。在一些陽性穩(wěn)定豬場,通過強化免疫、加強飼養(yǎng)管理和生物安全等綜合防控措施,完全可以擴繁出陰性的肥育豬。因此,對于目前大多數(shù)陽性豬場,可以通過強化免疫,先穩(wěn)定生產(chǎn);堅持補充陰性后備種豬(自留或外購),自然淘汰陽性種豬,逐步完成凈化。如果條件允許,可以實施“檢測—淘汰”方案,以便加快凈化進度。

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