宮頸脫落細(xì)胞miR34a檢測在HR-HPV陽性患者分流中的作用分析

聶小鳳 翟慧慧 冷天艷 張琴 楊麗華

摘? ?要：目的? 探討宮頸脫落細(xì)胞miR34a檢測在HR-HPV陽性患者分流中的作用。方法? 采用第二代雜交捕獲技術(shù)（HC2）進(jìn)行宮頸癌初篩，HPV陽性者行TCT及miRNA檢查。TCT結(jié)果異常者（≥意義不明確的非典型鱗狀細(xì)胞）陰道鏡下活檢行病理學(xué)檢查。TCT陰性者行陰道鏡檢查，陰道鏡異常者陰道鏡下活檢取材，比較不同級(jí)別宮頸病變中miR34a水平，探討miR34a、Pap在宮頸病變中的診斷作用。結(jié)果? ①Pap對(duì)宮頸高度鱗狀上皮內(nèi)病變預(yù)測值的靈敏度為64.90%，特異度為80.70%，AUC為0.728（95%CI：0.657～0.779，P<0.001）。②miRNA34a對(duì)宮頸高度鱗狀上皮內(nèi)病變預(yù)測值的靈敏度為77.00%，特異度為62.30%，AUC為0.824（95%CI：0.756～0.892，P<0.001），cut off值為0.623。③miRNA34a對(duì)宮頸高度鱗狀上皮內(nèi)病變預(yù)測值的靈敏度高于Pap檢測，特異度低于Pap。④宮頸脫落細(xì)胞miRAN34a值隨著宮頸病變加重逐漸降低。結(jié)論? 檢測宮頸脫落細(xì)胞miR34a水平可有效分流HR-HPV陽性患者，敏感性高于Pap檢查。

關(guān)鍵詞：microRNA-34a;宮頸細(xì)胞學(xué)檢查;HPV;宮頸癌;篩查

中圖分類號(hào)：R737.33? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.16.012

文章編號(hào)：1006-1959（2018）16-0043-04

Analysis of the Role of MiR34a in Cervical Exfoliated Cells in Shunt of HR-HPV Positive Patients

NIE Xiao-feng，ZHAI Hui-hui，LENG Tian-yan，ZHANG Qin，YANG Li-hua

（Department of Gynecology，Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming，650101，Yunnan，China）

Abstract： Objective? To investigate the role of miR34a in cervical exfoliated cells in the shunt of HR-HPV positive patients. Methods? The second generation hybridization capture technique （HC2） was used for primary screening of cervical cancer. HPV positive patients underwent TCT and miRNA examination. Pathological examination of colposcopy biopsy was performed in patients with abnormal TCT results （≥ atypical squamous cells with unclear significance）. TCT-negative patients underwent colposcopy， colposcopy biopsy was performed， and miR34a levels were compared in different grades of cervical lesions. The diagnostic role of miR34a and Pap in cervical lesions was explored. Results? ① The sensitivity of 1Pap to the predictive value of high squamous intraepithelial lesion was 64.90%， the specificity was 80.70%， and the AUC was 0.728 （95% CI： 0.657～0.779， P<0.001）.② The sensitivity of miRNA34a for predicting cervical high-grade squamous intraepithelial lesion was 77.00%， specificity was 62.30%， AUC was 0.824 （95% CI： 0.756～0.892， P<0.001）， and cut off value was 0.623. ③The sensitivity of 3miRNA34a to the predictive value of high squamous intraepithelial lesion was higher than that of Pap， and its specificity was lower than Pap. ④ The value of miRAN34a in cervical exfoliated cells gradually decreased with the increase of cervical lesions. Conclusion? Detection of miR34a levels in cervical exfoliated cells can effectively divert HR-HPV-positive patients with higher sensitivity than Pap.

Key words：MicroRNA-34a;Cervical cytology;HPV;Cervical cancer;Screening

宮頸癌（cervical cancer）是發(fā)展中國家女性常見的惡性腫瘤，發(fā)病率逐年上升[1]。高危型人類乳頭狀瘤病毒（highrisk human papillomavirus，HR-HPV）持續(xù)感染是宮頸癌的病因，因此，HR-HPV DNA檢測成為宮頸癌篩查的方法主要之一[2]。宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）為宮頸癌癌前病變。通過篩查發(fā)現(xiàn)CIN，及時(shí)治療，是預(yù)防宮頸癌的有效措施。大量證據(jù)表明，HR-HPV測定較細(xì)胞學(xué)檢測在識(shí)別高級(jí)別CIN 具有更高的敏感性，但是特異性低[3-5]。2015年1月美國陰道鏡及宮頸病理學(xué)會(huì)（American society for colposcopy and cervical pathology，ASCCP）和婦科腫瘤協(xié)會(huì)（society of gynecologic oncology，SGO）更新了宮頸癌篩查指南，推薦HPV初篩可用于現(xiàn)代宮頸癌篩查的替代方案[6]。HPV感染是頻發(fā)事件，大多數(shù)HPV感染是一過性的，90%的HPV感染在2年內(nèi)可自然消除[7，8]。因此，對(duì)HPV陽性的女性必須進(jìn)行相關(guān)檢測以識(shí)別CIN，稱之為分流。細(xì)胞學(xué)檢查是首選的分流方法，但細(xì)胞學(xué)結(jié)果敏感性低，準(zhǔn)確性依賴于讀片人員，因此尋找細(xì)胞學(xué)以外的分流方法是當(dāng)前研究重點(diǎn)。MicroRNAs（miRNAs）是重要的基因調(diào)節(jié)因子，在多種腫瘤中異常表達(dá)。近年來有研究報(bào)道，miRNA可作為腫瘤診斷的生物標(biāo)記物[9]。在宮頸癌發(fā)生中，miR-34a因?yàn)榕cE6蛋白作用的靶基因P53密切相關(guān)而受到關(guān)注。miR-34a是P53下游靶基因，HPV-E6蛋白靶向P53基因，P53失活導(dǎo)致miR-34a數(shù)量降低，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、G1期阻滯、DNA修復(fù)和凋亡的蛋白失活，因此，細(xì)胞增殖促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[10]。miR-34a水平的降低可代表HPV病毒與宿主細(xì)胞的整合，是宮頸發(fā)生病變的標(biāo)識(shí)，miR-34a水平的檢測可能可作為宮頸癌篩查中HPV陽性的婦女的有效分流方法， 因此，本課題擬通過檢測HPV感染陽性患者宮頸脫落細(xì)胞miR-34a水平，與液基細(xì)胞學(xué)結(jié)果相比，比較miR-34a測定在HPV陽性患者分流中的作用，為宮頸癌篩查中HPV陽性的患者提供更敏感、客觀的分流指標(biāo)提供依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料? 收集2015年10月～2017年4月昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科進(jìn)行宮頸癌篩查的患者30000例，年齡25～70歲，平均年齡（37.33±5.28）歲，均有性生活史，均經(jīng)知情同意，進(jìn)行HPV DNA檢測，HPV陽性者行TCT及miRNA檢查。TCT 結(jié)果≥意義不明確的非典型鱗狀細(xì)胞（ASCUS）者為TCT陽性，TCT陽性者直接陰道鏡下活檢行病理學(xué)檢查;TCT陰性者行陰道鏡檢查，陰道鏡異常者陰道鏡下活檢取材。

1.2 HPV檢測? 由經(jīng)過培訓(xùn)的婦科醫(yī)生取樣，用HPV采樣器于宮頸管內(nèi)，同一方向旋轉(zhuǎn)3圈，置于樣品保存液中，4 ℃保存待檢測。采用HPV-DNA雜交捕獲Ⅱ代試驗(yàn)，利用免疫學(xué)技術(shù)并通過化學(xué)發(fā)光使基因信號(hào)放大的微孔板對(duì)標(biāo)本中的病毒進(jìn)行微量檢測。檢測14種高危型HPV，包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68。其結(jié)果以標(biāo)本的相對(duì)熒光光度值（RLU）與陽性定標(biāo)的域值（CO）的比值表示，RLU/CO≥1.0為陽性，相當(dāng)于標(biāo)本中檢出DNA負(fù)荷量≥1.0 pg/ml，反之RLU/CO<1.0 pg/ml為陰性。

1.3 TCT、miR-34a檢測? 由經(jīng)過培訓(xùn)的婦科醫(yī)生取樣，應(yīng)用液基細(xì)胞學(xué)取樣器，于宮頸管內(nèi)旋轉(zhuǎn)3～5圈，每個(gè)患者取樣2個(gè)，1個(gè)置于液基細(xì)胞的保存液中，送病理科檢查。宮頸細(xì)胞學(xué)檢測按照TBS分級(jí)系統(tǒng)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)分類：①正常范圍（WNL）;②不典型鱗狀細(xì)胞（ASCUS）;③不能排除高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變不典型鱗狀上皮細(xì)胞（ASC-H）;④低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL）;⑤高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL）;⑥鱗狀細(xì)胞癌（SCC）。1個(gè)應(yīng)用RT-PCR檢測宮頸脫落細(xì)胞miR-34a表達(dá)水平，收集在Trizol商品化試劑盒，Trizol法提取細(xì)胞中總RNA，按照miR檢測試劑盒說明，應(yīng)用RT-PCR法測量miR-34a表達(dá)。

1.4組織學(xué)診斷? TCT檢查異常者90例，TCT正常，陰道鏡檢查異常者202例，共292例患者在陰道鏡下進(jìn)行活檢。根據(jù)2014年第四版WHO女性生殖器官腫瘤分類將疾病分為兩個(gè)級(jí)別：低度鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL）和高度鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL）[11]。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理? 采用SPSS22.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。ROC曲線用于分析Pap、miR-34a檢測在高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤變?cè)\斷中的價(jià)值，根據(jù)最大約登指數(shù)確定Pap、miR-34a的cut off值，比較TCT、miR-34a診斷HSIL的敏感性、特異性，評(píng)價(jià)宮頸脫落細(xì)胞miR-34a檢測在HR-HPV陽性患者的分流作用。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.001表示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義極顯著。

2結(jié)果

2.1研究對(duì)象基本信息? 30000例女性參加HPV檢測的初篩，其中1140例HPV陽性。450例女性因不愿繼續(xù)檢測，690例繼續(xù)篩查，行Pap、miRNA檢測，95例女性因?yàn)槿〕鰳?biāo)本細(xì)胞過少無法行miRNA檢測，僅行Pap檢測，595例女性完成了Pap檢測和miRNA檢測。其中90例女性Pap結(jié)果異常，直接陰道鏡下活檢。505例Pap結(jié)果未見異常行陰道鏡檢查，陰道鏡檢查結(jié)果正常303例，陰道鏡結(jié)果異常202例，陰道鏡異常者行宮頸活檢，共292例行陰道鏡下活檢。292例宮頸活檢組織學(xué)結(jié)果：正常189例，LSIL 29例，HSIL 71例，CC 3例。

2.2不同級(jí)別宮頸病變宮頸脫落細(xì)胞miRNA34a水平? RT-PCR檢測宮頸脫落細(xì)胞miR-34a表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)隨著宮頸病變程度的增加，miRNA34a的表達(dá)水平逐漸下降，miR-34a表達(dá)值在正常組、LSIL組、HSIL組及CC組分別為（0.74±0.07）×10-3、（0.61±0.06）×10-3、（0.52±0.08）×10-3、（0.35±0.09）×10-3，且與正常組及LSIL組相比，HSIL組及CC組均較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 Pap結(jié)果與宮頸病變的關(guān)系? 292例（Pap陰性202例，Pap陽性90例）進(jìn)行宮頸活檢，組織學(xué)結(jié)果顯示：正常組189例，其中Pap陰性161例，Pap陽性28例;LSIL組29例，其中Pap陰性15例，Pap陽性14例;HSIL組71例，其中Pap陰性26例，Pap陽性45例;CC組3例，其中Pap陰性0例，Pap陽性3例。

2.4 Pap對(duì)HSIL的預(yù)測作用? Pap對(duì)診斷HSIL的預(yù)測值的靈敏度為64.90%，特異度為80.70%，AUC為0.728（95%CI：0.657～0.779，P<0.001），見圖1。

圖1? ?Pap診斷HSIL的ROC曲線

2.5 miRNA34a對(duì)HSIL的預(yù)測作用? miRNA34a對(duì)診斷HSIL的預(yù)測的靈敏度為77.00%，特異度為62.30%，AUC為0.824（95%CI：0.756～0.892，P<0.001），cut off值為0.623，見圖2。

圖2? ?miRNA34a診斷HSIL的ROC曲線

3討論

2015年1月美國陰道鏡及宮頸病理學(xué)會(huì)（ASCCP）和婦科腫瘤協(xié)會(huì)（SGO）更新了宮頸癌篩查指南，推薦HPV初篩可用于現(xiàn)代宮頸癌篩查的替代方案，HPV檢測敏感性高，能夠最大限度地篩查出疾病。但是HPV感染率較高，絕大多數(shù)感染是一過性的，90%的感染在2年內(nèi)清除，也就是說大多數(shù)婦女感染HPV后可以自行清除病毒，僅有部分患者持續(xù)感染，持續(xù)感染的婦女中也僅有部分患者發(fā)生CIN或?qū)m頸癌[7，8]。因此，HR-HPV初篩陽性婦女必須分流，HPV檢測的目的不是明確是否有HR-HPV感染，而是預(yù)測是否存在高級(jí)別CIN，避免處理一過性HPV感染及其相關(guān)的良性病變。目前，細(xì)胞學(xué)檢查是首選的分流方法[12]，細(xì)胞學(xué)篩查的特異性較高，可達(dá)到90%以上，但其敏感性只有42%～73%[13，14]。我國宮頸癌的篩查起步較歐美等西方發(fā)達(dá)國家晚，由于經(jīng)濟(jì)發(fā)展和技術(shù)力量的不均衡，很難有一個(gè)全國統(tǒng)一的篩查策略，國內(nèi)的醫(yī)生大多數(shù)采用或借鑒國外的篩查經(jīng)驗(yàn)。現(xiàn)階段國內(nèi)尚缺乏針對(duì)宮頸癌篩查策略的大樣本多中心的隨機(jī)研究，對(duì)于HPV感染的型別分布各個(gè)研究中心也不統(tǒng)一。另外，我國缺乏經(jīng)歷正規(guī)培訓(xùn)的有經(jīng)驗(yàn)的細(xì)胞學(xué)病理專家，細(xì)胞學(xué)分流的作用受到更大的挑戰(zhàn)。加上我國目前特殊的醫(yī)療環(huán)境、敏感的醫(yī)患關(guān)系，為避免HPV陽性的婦女漏診可能存在的CIN，臨床醫(yī)生可能會(huì)更多的推薦陰道鏡檢查甚至是宮頸活檢以明確診斷。對(duì)HPV陽性的婦女采用抗病毒、免疫治療等“更積極”“更迎合”患者恐癌、懼癌，要求治療的心態(tài)，以避免因?yàn)槟壳胺至鞔胧┎煌晟瓶赡軐?dǎo)致的漏診。因此，我們更需要探討簡便、敏感性強(qiáng)、特異性高的HPV陽性患者的分流方法。

微RNA（microR-NA，miRNA）是一類內(nèi)源性的非編碼單鏈小分子RNA，長度約為18～25個(gè)核苷酸，可與靶信使RNA（mRNA）3'端非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，進(jìn)而引起靶mRNA降解或翻譯抑制，調(diào)控基因表達(dá)。根據(jù)生物信息學(xué)推測，大約30%以上的人類基因受到miRNA的調(diào)控[15]。現(xiàn)有研究表明，HPV表達(dá)的致癌蛋白E6、E7和E5直接或間接導(dǎo)致了多種mi-RNAs，如miR-34a、miR-218、miR-29a及miR-146a 等表達(dá)改變，進(jìn)而導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，而少數(shù)mi-RNAs如miR-203及miR-125b等還參與了HPV病毒DNA的復(fù)制[16，17]。

miR-34a家族因?yàn)槠渑cHPV蛋白之間可能的反應(yīng)，在HPV感染、宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用被研究。miR-34家族包括3種同源基因，分別是miRNA-34a、miRNA-34b、miRNA-3c。其中miRNA-34a位于1p36.23，含有兩個(gè)外顯子，兩個(gè)外顯子之間間隔約30kb的內(nèi)含子，編碼成熟miRNA-34a的序列位于第二外顯子。miRNA-34a可通過靶定多種周期及凋亡相關(guān)蛋白（如CyclinE2、CDK4、C-myc和Bcl-2等）mRNA的3′UTR區(qū)而在轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控，使這些蛋白的mRNA降解，使細(xì)胞周期不向S期轉(zhuǎn)換，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤的發(fā)生[18]。反之，如果miR-34a表達(dá)降低，將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，凋亡抑制，最終形成腫瘤。近來有研究發(fā)現(xiàn)P53直接轉(zhuǎn)錄miR-34家族的表達(dá)，是P53腫瘤抑制蛋白的直接靶標(biāo)，在宮頸癌發(fā)生中，HPV感染宮頸細(xì)胞中，HPV對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生免疫攻擊，這種免疫攻擊主要是通過HPV基因組整合到宿主細(xì)胞，基因組整合后HPV-E6蛋白表達(dá)，HPV-E6蛋白靶向P53基因，通過泛素蛋白酶途徑降解P53，導(dǎo)致P53有效性降低，P53失活導(dǎo)致可與miR-34結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)區(qū)域的蛋白數(shù)量的減少，從而下調(diào)大多數(shù)被HPV感染的組織中miR-34的表達(dá)，導(dǎo)致miR-34a數(shù)量降低，因此導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、G1期阻滯、DNA修復(fù)和凋亡的蛋白失活，因此細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。有研究報(bào)道，miR-34a表達(dá)從宮頸上皮內(nèi)瘤變到宮頸癌逐漸下調(diào)，低的miR-34a水平可能與病毒的整合、E6蛋白的表達(dá)及P53缺失有關(guān)[19]。

本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸脫落細(xì)胞中，miRNA34a在宮頸癌和高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)病變中的表達(dá)水平顯著低于它們?cè)谡m頸及低級(jí)別宮頸上皮內(nèi)病變中的表達(dá)，且miRAN34a值隨著宮頸病變加重逐漸降低，同時(shí)在HSIL預(yù)測中也能發(fā)揮一定的作用。在對(duì)HSIL預(yù)測中，miRAN34a與Pap相比較，miRAN34a診斷宮頸病變的敏感性，AUC顯著高于Pap。提示miRAN34a檢測作為生物標(biāo)記物用于宮頸癌篩查中HPV陽性的婦女的有效分流的潛在臨床價(jià)值，值得進(jìn)一步研究。

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收稿日期：2018-6-1;修回日期：2018-6-10

編輯/楊倩