Bcl2蛋白介導(dǎo)Caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)對(duì)牛肉嫩化的作用機(jī)制

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(海南大學(xué)食品學(xué)院,海南海口 570100)

牛肉的宰后嫩化受到許多復(fù)雜機(jī)制和因素的影響,近年來,越來越多的研究集中在細(xì)胞凋亡對(duì)肉嫩度的影響上[1],特別是內(nèi)源性蛋白水解酶(如鈣蛋白酶,組織蛋白酶和半胱天冬酶等)對(duì)肌纖維蛋白的水解作用[2]。Sentandreu等[3]首先提出了,凋亡酶系(Caspase家族酶)在宰后成熟過程中參與蛋白水解和肉的嫩化。隨著肉類科學(xué)的發(fā)展,許多證據(jù)表明,在肌肉嫩化過程中,凋亡對(duì)關(guān)鍵肌原纖維蛋白的水解發(fā)揮著重要作用[4-6]。

Bcl-2蛋白質(zhì)家族是細(xì)胞凋亡過程中一類重要的調(diào)節(jié)因子,主要通過家族成員間相互作用引發(fā)線粒體外膜通透(mitochondrial outer membrane permeabilization,MOMP),促使細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡(Apoptosis)主要通過兩種途徑發(fā)生,死亡受體途徑和線粒體途徑[7]。Bax與Bcl-2在線粒體膜上形成異源二聚體,改變線粒體膜通透性[8],促凋亡蛋白細(xì)胞色素-C(Cyt-C)被釋放至細(xì)胞質(zhì)后,引發(fā)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng),促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Cyt-C一旦釋放到細(xì)胞質(zhì)中,將與凋亡蛋白酶活化因子-1(Apaf-1)的dATP介導(dǎo)的寡聚化結(jié)合,以激活前Caspase-9,并激活Caspase-3,其最終激活凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng),這是線粒體途徑。死亡受體途徑是指Caspase-8在線粒體膜上與死亡結(jié)構(gòu)域DED結(jié)合形成復(fù)合物,Caspase-8酶原片段發(fā)生自我剪切,激活Caspase-3,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[9]。

牛肉的嫩度是評(píng)價(jià)其品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo),影響消費(fèi)者的購買決定。研究表明,細(xì)胞凋亡對(duì)肉的嫰化起主要作用,但凋亡過程如何被激活卻鮮有報(bào)道。本研究測(cè)定了牛肉宰后成熟過程中抗凋亡蛋白(Bcl-2)、促凋亡蛋白(Bax)和細(xì)胞凋亡酶Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9等表達(dá)量以及不同部位牛肉剪切力值,旨在探究Bcl-2蛋白介導(dǎo)Caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)對(duì)牛肉凋亡的調(diào)控機(jī)制,以豐富牛肉宰后嫰化理論和指導(dǎo)企業(yè)對(duì)牛肉的生產(chǎn)加工。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛肉樣品 選擇10頭12～18月齡的海南省五指山小黃牛,取其前軀肱三頭肌(TB)、中軀背最長肌(ML)、后軀半膜肌(SM)作為實(shí)驗(yàn)樣品;Bicinchoninic Acid Protein試劑盒和DBA試劑盒 海南怡創(chuàng)科技有限公司;緩沖液A、HEPES和蛋白酶測(cè)定緩沖液 上海默悉生物科技有限公司;羊抗兔免疫球蛋白(Goat Anti-Rabbit IgG)、Bcl-2抗體、Bax抗體、Anti-Cytochrome C(抗細(xì)胞色素C)、Anti-Caspase-3(抗caspase-3)、Anti-Caspase-8(抗caspase-8)、Anti-Caspase-9(抗caspase-9)和Rabbit anti GAPDH(兔抗GAPDH) 上海浩洋生物科技有限公司;TBST(洗滌緩沖液)、CHAPS(3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸鈉鹽) 北京索萊寶科技有限公司。

LM4型嫩度儀 北京天翔飛域儀器設(shè)備有限公司;WFH-101B凝膠成像分析系統(tǒng) 上海精科實(shí)業(yè)有限公司;DNM-9606酶標(biāo)分析儀 北京普朗新技術(shù)有限公司;RDY-600A電泳儀電源 北京榮陽經(jīng)典科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肉樣預(yù)處理 將肉樣置于0～4 ℃條件下進(jìn)行成熟,在熟化的第2、6、12、24、48、96、168 h,分別從TB、ML、SM三個(gè)部位取適量肉樣,用于Bcl-2家族蛋白、Cyt-C、Caspase家族酶、Caspases活力和剪切力的測(cè)定。

1.2.2 線粒體的分離 參考Li等[10]方法,分別取TB、ML和SM部位肉樣各20 g,切成碎屑,加入緩沖液A(70 mmol/L蔗糖,220 mmol/L甘露醇,2.0 mmol/L乙二胺四乙酸,5.0 mmol/L 4-嗎啉丙磺酸和0.5%牛血清白蛋白(BSA);pH7.4)(重量:體積=1/10),在4 ℃、1000 r/min下離心10 min,取上清液再次在4 ℃、1000×g下離心10 min。隨后,在上清液中加入適量緩沖液B(稀釋7.5倍不含BSA的緩沖液A),在80 ℃、8000 r/min下離心20 min,得到線粒體(沉淀)和細(xì)胞溶質(zhì)(上清液)。并將所得的線粒體沉淀物懸浮于100 mL緩沖液B中。

1.2.3 SDS-PAGE結(jié)合免疫印跡分析測(cè)定蛋白表達(dá)量 參考李晶晶[11]的方法,采用分離膠濃度12%,濃縮膠濃度5%對(duì)線粒體蛋白和細(xì)胞溶質(zhì)蛋白進(jìn)行電泳。電泳分離后用半干轉(zhuǎn)膜儀將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,轉(zhuǎn)印后的PVDF膜用含5%脫脂奶粉的TTBS溶液(0.05% Tween 20,50 mmol/L Tris-HCl,150 mmol/L NaCl,5 mmol/L KCl,pH7.5)25 ℃封閉1 h,再用TTBS溶液漂洗,再與用含5%脫脂奶的TTBS溶液1∶500稀釋的Bcl-2抗體、Bax抗體、抗細(xì)胞色素C、抗Caspase-3、抗Caspase-8、抗Caspase-9和兔抗GAPDH在4 ℃下分別反應(yīng)12 h,GAPDH作為內(nèi)參抗體。TTBS溶液洗去多余抗體之后,與相對(duì)應(yīng)的二抗(1∶1000稀釋的過氧化物標(biāo)記Goat Anti-Rabbit IgG)抗體在25 ℃條件下孵育1 h,TTBS浸洗后,用DBA試劑盒顯色,根據(jù)條帶分子量計(jì)算Bcl-2、Bax、Cyt-C和Caspase家族酶的表達(dá)量。

1.2.4 Caspases酶活力測(cè)定 參考Huang等[12]方法,分別取TB、ML、SM各200 mg,加入0.5 mL 100 mmol/L HEPES(10%蔗糖,0.1% NP-40,10 mmol/L二硫蘇糖醇,pH7.5)對(duì)肉樣進(jìn)行裂解,在冰上粉碎并進(jìn)行三次凍融循環(huán)(在-20 ℃下冰凍1 h,在4 ℃下融化3 h)。18000×g離心30 min后,取20 μL上清液至0.2 mL蛋白酶測(cè)定緩沖液(10% 蔗糖,0.1% CHAPS,100 mmol/L HEPES,pH7.5)中,然后加入5 μL重建熒光底物Ac-DEVD-AMV、AV-IETD-AMC和Ac-LEHD-AMC(分別用于Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9),混合物在37 ℃下孵育1 h。將反應(yīng)液置于96孔板的酶標(biāo)儀中,37 ℃條件下孵化1 h,然后分別于360 nm和460 nm的激發(fā)和發(fā)射波長下讀取熒光強(qiáng)度。使用Bicinchoninic Acid Protein試劑盒,測(cè)定上清液的蛋白質(zhì)含量,酶活力單位用每min,每mg肉樣的相對(duì)熒光強(qiáng)度表示。

1.2.5 剪切力測(cè)定 參考Wiklund等[13]的方法,分別取TB、ML、SM樣品30 g進(jìn)行蒸煮,待中心溫度達(dá)到75 ℃時(shí)取出樣品冷卻至室溫,沿肌纖維方向取3～5個(gè)直徑為1.5 cm的肉柱,用嫩度儀沿肌纖維垂直方向切斷肉柱,記錄剪切力值。

1.2.6 圖像獲取與分析 使用凝膠成像系統(tǒng)獲取凝膠圖像,Quantity One分析軟件進(jìn)行軌跡定量分析,計(jì)算目的條帶的光密度值。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 每組試驗(yàn)做3次重復(fù)實(shí)驗(yàn),數(shù)據(jù)處理用SPSS 19.0分析軟件,用Duncan法進(jìn)行多重比較,圖形制作用Origin 8.0作圖軟件。顯著水平α=0.05,采用標(biāo)記字母法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 宰后牛肉成熟過程中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)

Bcl-2屬于Bcl-2家族蛋白中的保護(hù)者,大多位于線粒體膜上,屬于抗凋亡蛋白;Bax屬于效應(yīng)者,生理狀態(tài)下以未活化的單體存在于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中,受到凋亡信號(hào)后構(gòu)象改變,易位到線粒體外模并被激活,活化后的Bax相互作用,形成多聚體致使線粒體外模通透,誘發(fā)細(xì)胞凋亡,從而改善肉的嫩度[14]。由圖1和圖2可知,宰后成熟過程中檢測(cè)到Bax和Bcl-2,在宰后168 h內(nèi),不同部位牛肉中Bax/Bcl-2相對(duì)含量呈上升趨勢(shì),宰后2～168 h,TB、ML和SM中的Bax/Bcl-2相對(duì)含量均顯著升高(p<0.05)。

圖1 宰后牛肉成熟過程中Bax和Bcl-2蛋白免疫印跡表達(dá)Fig.1 The immunoblot of Bax and Bcl-2 proteins during the post-mortem beef maturation

圖2 宰后牛肉成熟過程中Bax/Bcl-2相對(duì)含量變化Fig.2 The relative content of Bax/Bcl-2 during the maturation of post-mortem beef注:圖中小寫字母表示差異顯著(p<0.05),圖4、圖6同。

Bax與Bcl-2之間的平衡決定細(xì)胞凋亡程度,Bax表達(dá)量過高可激活凋亡過程[15]。宰后成熟過程可促進(jìn)Bax/Bcl-2比例的增加,在宰后12～24 h,TB、ML和SM中的bax/Bcl-2相對(duì)含量顯著升高(p<0.05)。Bcl-2可通過直接鎮(zhèn)壓VDAC或異二聚化促凋亡Bcl-2家族成員,阻止線粒體膜通透性的擴(kuò)增。Bax激活后會(huì)轉(zhuǎn)移到線粒體中,然后插入細(xì)胞外膜并低聚形成大通道[16]。上述發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步表明,氧化應(yīng)激可影響B(tài)cl-2家族蛋白的表達(dá)和線粒體途徑。然而,Bcl-2家族中其他蛋白對(duì)牛肉線粒體凋亡途徑中的調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

2.2 宰后牛肉成熟過程中胞漿Cyt-C蛋白表達(dá)

Cyt-C是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要蛋白質(zhì),存在于線粒體內(nèi)膜。Cyt-C進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后會(huì)引起Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng),水解肌纖維蛋白。由圖3和圖4可得,宰后成熟過程中在TB、ML和SM中均檢測(cè)到Cyt-C,在宰后168 h內(nèi),不同部位牛肉中胞漿Cyt-C相對(duì)含量呈升高趨勢(shì),宰后12～24 h升高極顯著(p<0.01)。

圖3 宰后牛肉成熟過程中Cyt-C免疫印跡表達(dá)(主要條帶用箭頭表示)Fig.3 Cyt-C immunoblot expression during maturation of post-slaughter beef(the main bands indicated by arrows)

圖4 宰后牛肉成熟過程中胞漿Cyt-C相對(duì)含量變化Fig.4 The change of cytosolic Cyt-C content during the maturation of post-slaughter beef

有關(guān)研究表明,細(xì)胞凋亡過程中,Cyt-C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)的過程對(duì)Caspase的激活具有至關(guān)重要的作用[17]。因此,研究了宰后成熟過程TB、ML和SM中Cyt-C的釋放。為探究Cyt-C從線粒體到細(xì)胞質(zhì)中的釋放過程,用Western印跡分析對(duì)細(xì)胞質(zhì)中Cyt-C進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明,宰后成熟過程中,Cyt-C的含量顯著增加(p<0.05),在12～24 h快速上升,這可能是因?yàn)?在宰后12～24 h,Bax/Bcl-2相對(duì)含量增加,從而引發(fā)凋亡的線粒體途徑。Bcl-2家族蛋白水平的改變引發(fā)MOMP,Cyt-C的釋放啟動(dòng)細(xì)胞凋亡[18-19]。

2.3 宰后牛肉成熟過程中胞漿中Caspase蛋白表達(dá)

Caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)被激活后,上游起始酶Caspase-8、Caspase-9自我剪切為有活性的18、23 kDa片段,激活下游效應(yīng)酶caspase-3剪切為17 kDa活性片段,水解肌原纖維蛋白,最終導(dǎo)致不可逆的細(xì)胞凋亡[11,14,20]。本研究通過SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡對(duì)Caspases進(jìn)行免疫印跡分析,17、18和23 kDa分別代表Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活性片段。圖6表明,在2～12 h宰后牛肉中,Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活化片段蛋白含量顯著升高(p<0.01),12～24 h顯著降低(p<0.05),隨后變化趨于平穩(wěn),宰后12～24 h,ML的活化片段含量均顯著高于TB和SM(p<0.05)。

圖5 宰后牛肉成熟過程中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白免疫印跡表達(dá)(主要條帶用箭頭表示)Fig.5 Western blotting of Caspase-3,Caspase-8, and Caspase-9 proteins during maturation of post-mortem beef(the main bands indicated by arrows)

圖6 宰后牛肉成熟過程中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9相對(duì)含量變化Fig.6 The relative contents of Caspase-3,Caspase-8,and Caspase-9 during the maturation of post-slaughter beef

2.4 宰后牛肉成熟過程中Caspase活力變化

宰后成熟過程中,不同部位牛肉Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活力如圖7所示,Caspase活力均呈先增后減的趨勢(shì)。在2～12 h,不同肌肉Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活力顯著上升(p<0.01),最大活力值大多在在宰后12 h,ML中Caspase-3最大活力出現(xiàn)在宰后24 h。結(jié)果表明,在宰后成熟過程中會(huì)引發(fā)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng),且ML中Caspase-8、Caspase-9的激活發(fā)生在Caspase-3之前。

圖7 宰后牛肉成熟過程中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9酶活力變化Fig.7 Changes of Caspase-3,Caspase-8 and Caspase-9 enzyme activitiesduring maturation of post-mortem

在宰后成熟過程中,牛肌肉中Caspase-9和Caspase-3活性的顯著變化符合Krammer P H[21]的報(bào)告,他們也指出,宰后環(huán)境誘導(dǎo)Caspase-9的活化,Caspase-9通過牛肌肉內(nèi)在途徑激活Caspase-3。本研究還發(fā)現(xiàn),宰后12～24 h,Caspase-8、Caspase-9活力顯著增加(p<0.05),而Caspase-3極顯著增加(p<0.01),這可能是因?yàn)樵缀蟪墒爝^程中,Caspase-8的活化啟動(dòng)死亡受體途徑,激活Caspase-3。因此,宰后成熟過程中,牛肉細(xì)胞凋亡是線粒體途徑和死亡受體途徑綜合作用的結(jié)果。

2.5 宰后牦牛肉成熟過程中剪切力的變化

剪切力在一定程度上反映肉的嫩度,剪切力越小,肉質(zhì)越嫩。由圖8可知,宰后不同部位牦牛肉的剪切力值呈下降趨勢(shì),宰后6～48 h,剪切力值下降極顯著(p<0.01),隨后變化不顯著。宰后12～168 h,ML的剪切力顯著低于TB和SM。結(jié)果表明,在宰后6～48 h,牛肉嫩度極顯著提高(p<0.01),且ML嫩度優(yōu)于TB和SM。

圖8 宰后牛肉成熟過程中剪切力值的變化Fig.8 The shear force change in yak meat during postmortem aging

剪切力是一個(gè)重要且廣泛使用的指標(biāo),用于評(píng)價(jià)宰后成熟過程中肉的嫩化程度[22]。本研究指出,在宰后12～24 h,隨著不同部位牛肉Bax/Bcl-2相對(duì)含量顯著升高(p<0.05),Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活力顯著增加(p<0.05),剪切力值顯著下降(p<0.05),宰后12～168 h,ML的剪切力顯著低于TB和SM(p<0.05)。結(jié)果表明,宰后成熟過程中不同部位牛肉Bax/Bcl-2相對(duì)含量升高啟動(dòng)Caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng),水解肌原纖維蛋白引發(fā)細(xì)胞凋亡,從而提高肉的嫩度。

3 結(jié)論

結(jié)果顯示,在宰后12～24 h,在宰后2～12 h,TB、ML和SM的Bax/Bcl-2相對(duì)含量和Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活力均顯著上升(p<0.05),宰后6～48 h,剪切力值顯著下降(p<0.01)。牛肉宰后嫩化依賴于線粒體途徑和死亡受體途徑,Bcl-2蛋白通過介導(dǎo)Caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng),對(duì)牛肉嫩度進(jìn)行調(diào)控。不同部位牛肉Bax/Bcl-2相對(duì)含量的升高導(dǎo)致Cyt-C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì),啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng),激活Caspase-3水解肌原纖維蛋白,引發(fā)細(xì)胞凋亡,且ML中Caspase-8、Caspase-9的激活發(fā)生在Caspase-3之前,最終導(dǎo)致在宰后48 h內(nèi)牛肉嫩度不斷提高,且ML嫩度優(yōu)于TB和SM。本研究豐富了牛肉宰后嫰化理論,對(duì)于指導(dǎo)企業(yè)對(duì)牛肉的生產(chǎn)加工具有重要現(xiàn)實(shí)意義。