• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    一次性力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)HIF-1α轉(zhuǎn)基因鼠骨骼肌Nrf2抗氧化信號(hào)的影響

    2018-12-07 10:30:48王林佳
    體育科學(xué) 2018年11期
    關(guān)鍵詞:力竭骨骼肌轉(zhuǎn)基因

    王林佳,張 纓

    ?

    一次性力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)HIF-1α轉(zhuǎn)基因鼠骨骼肌Nrf2抗氧化信號(hào)的影響

    王林佳,張 纓

    北京體育大學(xué) 運(yùn)動(dòng)生物化學(xué)教研室 北京 100084

    目的:探討一次性力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)HIF-1α轉(zhuǎn)基因鼠骨骼肌Nrf2抗氧化信號(hào)的影響。方法:HIF-1α轉(zhuǎn)基因鼠和野生型C57BL/6J小鼠各20只。隨機(jī)分為野生安靜組(WC組)、野生運(yùn)動(dòng)組(WE組)、轉(zhuǎn)基因安靜組(HC組)和轉(zhuǎn)基因運(yùn)動(dòng)組(HE組)。正式實(shí)驗(yàn)時(shí)運(yùn)動(dòng)組小鼠做遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)直至力竭,運(yùn)動(dòng)后即刻取材,脫頸處死后取兩側(cè)小腿骨骼肌。采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定骨骼肌Nrf2-ARE結(jié)合活性,實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定骨骼肌Nrf2下游抗氧化基因表達(dá),Western Blot法測(cè)定骨骼肌中蛋白表達(dá),高質(zhì)熒光測(cè)定法測(cè)定小鼠骨骼肌ROS。結(jié)果:1)與WC組相比,HC組小鼠骨骼肌Nrf2 mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加,Nrf2-ARE結(jié)合活性顯著增加,靶基因SOD1、SOD2、NQO-1 mRNA表達(dá)顯著增加,NQO-1蛋白表達(dá)顯著增加,骨骼肌ROS水平極顯著下降;2)與HC組相比,HE組小鼠骨骼肌核蛋白Nrf2含量顯著性增加,SOD2和NQO-1 mRNA表達(dá)量顯著增加,且NQO-1蛋白表達(dá)顯著增加,ROS無(wú)明顯變化;3)與WE組相比,HE組小鼠Nrf2 mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加,Nrf2核蛋白及P-Nrf2表達(dá)增加。骨骼肌SOD2和NQO-1mRNA表達(dá)增加,NQO-1蛋白表達(dá)顯著增加,骨骼肌ROS含量極顯著下降。結(jié)論:適當(dāng)?shù)腍IF-1α高表達(dá)可提高安靜狀態(tài)下小鼠骨骼肌Nrf2-ARE通路的激活,且對(duì)一次力竭運(yùn)動(dòng)后骨骼肌ROS的消除也有積極的調(diào)節(jié)作用。

    運(yùn)動(dòng);氧化應(yīng)激;核因子E2相關(guān)因子2;低氧誘導(dǎo)因子1-α亞基

    低氧訓(xùn)練作為提高運(yùn)動(dòng)員運(yùn)動(dòng)能力的輔助措施,是運(yùn)動(dòng)員經(jīng)常采用的訓(xùn)練方法之一[21]。運(yùn)動(dòng)和環(huán)境低氧可刺激機(jī)體使之產(chǎn)生適應(yīng)[6,8]。低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)是調(diào)節(jié)機(jī)體缺氧適應(yīng)的核心轉(zhuǎn)錄因子。其功能性亞基HIF-1α發(fā)揮主要調(diào)節(jié)作用,低氧和運(yùn)動(dòng)均可促進(jìn)其表達(dá)[4,12]。

    核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor-erythroid 2 p45-related factor 2,Nrf2)是機(jī)體氧化應(yīng)激中起著中樞調(diào)節(jié)作用的一個(gè)核轉(zhuǎn)錄因子[16]。在正常生理狀態(tài)下,Nrf2與胞漿中的keap1蛋白結(jié)合并被固定在胞漿中,當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激刺激時(shí),Nrf2與keap1蛋白解離并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核,與核內(nèi)Maf蛋白二聚化后可識(shí)別并結(jié)合靶基因DNA啟動(dòng)子序列——抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element,ARE),促進(jìn)下游靶基因抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄,如超氧化物歧化酶(SOD)、醌氧化還原酶(NQO-1)、過(guò)氧化氫酶(CAT)等一系列抗氧化和Ⅱ相解毒酶。提高機(jī)體對(duì)抗氧化應(yīng)激的能力[9,15]。綜上所述,Nrf2-ARE系統(tǒng)在機(jī)體抗氧化反應(yīng)中發(fā)揮著非常重要作用[9]。

    運(yùn)動(dòng)、低氧可導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)氧化還原平衡破壞[4,15]。目前有研究發(fā)現(xiàn),HIF-1α的高表達(dá)可能在機(jī)體對(duì)低氧適應(yīng)中起到保護(hù)作用,但HIF-1α高表達(dá)對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)后小鼠骨骼肌Nrf2-ARE通路的影響目前并不清楚。本實(shí)驗(yàn)采用野生鼠與HIF-1α轉(zhuǎn)基因鼠,探討安靜狀態(tài)和一次性力竭運(yùn)動(dòng)后小鼠骨骼肌Nrf2-ARE抗氧化信號(hào)的變化,進(jìn)一步揭示HIF-1α和骨骼肌Nrf2抗氧化信號(hào)的關(guān)系。

    1 研究對(duì)象與方法

    1.1 研究對(duì)象

    健康8周齡C57BL/6J小鼠20只(W),誘導(dǎo)型HIF-1α轉(zhuǎn)基因鼠20只(H),HIF-1α采用C57BL/6J小鼠制做HIF-1α轉(zhuǎn)基因鼠[22]。所有小鼠均購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,體重為18±2 g。兩種小鼠骨骼肌內(nèi)HIF-1α蛋白檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。

    圖1 小鼠骨骼肌HIF-1α蛋白表達(dá)

    Figure 1. Expression of HIF-1α Protein in Mice

    注:@表示與野生鼠比較<0.05,下同。

    1.2 研究對(duì)象分組

    HIF-1α轉(zhuǎn)基因鼠和野生型C57BL/6J小鼠各20只。隨機(jī)分為野生安靜組(WC組)、野生運(yùn)動(dòng)組(WE組)、轉(zhuǎn)基因安靜組(HC組)和轉(zhuǎn)基因運(yùn)動(dòng)組(HE組)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于北京體育大學(xué)動(dòng)物房,分籠飼養(yǎng),每籠3~4只,溫度保持在20~25℃,相對(duì)濕度保持在50%~70%,每天進(jìn)行12 h模擬自然光照射。動(dòng)物飼養(yǎng)采用國(guó)家嚙齒類動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)飼料,整個(gè)飼養(yǎng)過(guò)程中動(dòng)物能夠自由進(jìn)食和飲水。

    1.3 運(yùn)動(dòng)方式

    HC組、HE組小鼠均進(jìn)行一次性遞增負(fù)荷至力竭跑臺(tái)運(yùn)動(dòng),坡度為5%,起始速度為10 m/min,每3 min增加1級(jí),直至力竭(表1)。

    表1 本研究小鼠遞增負(fù)荷至力竭的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)方案

    Table 1 Exhaustion Exercise Running Scheme of Mice

    適應(yīng)性訓(xùn)練在正式實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前兩天進(jìn)行,共進(jìn)行2天,時(shí)間為10 min/天。正式實(shí)驗(yàn)時(shí),力竭判斷標(biāo)準(zhǔn)為電擊10 s仍不運(yùn)動(dòng)即視為已達(dá)到力竭。

    1.4 取材

    所有小鼠均采用脫頸處死,運(yùn)動(dòng)組小鼠運(yùn)動(dòng)后即刻取材,取小腿腓腸肌,用錫紙包裹,標(biāo)記,投入液氮中。而后,將所有取好的組織存入-80℃冰箱,保存待用。

    1.5 實(shí)驗(yàn)試劑、儀器及方法

    1.5.1 酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定骨骼肌總蛋白Nrf2-ARE結(jié)合活性

    采用美國(guó)Pierce公司生產(chǎn)的蛋白濃度試劑盒,通過(guò)BCA方法,測(cè)定蛋白勻漿液蛋白濃度。根據(jù)測(cè)定的蛋白濃度,計(jì)算各樣品蛋白含量,調(diào)整為10 μg所需稀釋比例。采用美國(guó)Active Motif公司生產(chǎn)的Trans AM Nrf2試劑盒測(cè)定Nrf2-ARE結(jié)合活性,操作完全按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。結(jié)果以(測(cè)定孔OD值-空白孔OD值)/[對(duì)照組(測(cè)定孔OD-空白孔OD值)平均值]表示。

    1.5.2 骨骼肌蛋白提取

    將100 mg骨骼肌加入800 μl裂解液A(已加入EDTA)中,勻漿機(jī)高速充分勻漿;于冰上靜置10 min,渦旋振蕩 5 s,再于冰上靜置10 min,渦旋振蕩5 s,15 000 rpm,4℃離心10 min;取上清即為胞漿蛋白,于-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

    1.5.3 Western Blot測(cè)定骨骼肌蛋白表達(dá)

    采用美國(guó)Pierce公司生產(chǎn)的蛋白濃度試劑盒,BCA法測(cè)定骨骼肌的胞漿蛋白及核蛋白濃度。根據(jù)測(cè)定的核蛋白濃度以及上樣蛋白量20 μg計(jì)算上樣的體積。采用美國(guó)life technologies 公司生產(chǎn)的Bolt 4%~12% Bis-Tris Plus凝膠,電泳分離目的蛋白及內(nèi)參,而后采用美國(guó)Invitrogen公司的iBlot2進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。5%的脫脂牛奶封閉1 h,加一抗于4℃孵育過(guò)夜。一抗稀釋比例為:Nrf2(SC-722,1:200),p-Nrf2(Ser40)(BS-2013R 1:1 000),NQO-1(SC-16464,1:500),SOD1(SC-11407,1:500),SOD2(SC-30080, 1:3 000),CAT(SC-50508,1:500),內(nèi)參蛋白β-actin(SC-47778,1:1 000),H1(SC-10806,1:1 500)。次日以1×TBST洗3次,每次10 min。加二抗室溫孵育1 h,然后1×TBST洗3次,每次10 min。洗膜后,加入發(fā)光液(Thermo 34095),曝光結(jié)果采用Image Lab軟件讀取條帶積分灰度值,結(jié)果用以下公式計(jì)算的比值表示。

    1.5.4 實(shí)時(shí)熒光定量測(cè)定骨骼肌抗氧化基因mRNA表達(dá)量

    取小鼠骨骼肌50 mg,瀝干,加入0.8 ml Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司),組織研磨、分相、分離、洗滌和提純總RNA。采用日本Toyobo公司生產(chǎn)的熒光染料反應(yīng)體系(SYBR Green Realtime PCR Master Mix)及引物Nrf2(QT00095270),SOD1(QT00165039),SOD2(QT00161707),CAT(QT01058106),NQO-1(QT00094357)。采用美國(guó)ABI7500熒光定量PCR儀測(cè)定SOD1等基因mRNA水平,用該儀器自帶軟件讀取熒光定量CT值。目的基因結(jié)果以比較CT法相對(duì)定量表示。計(jì)算公式為:目的基因=2-△△CT。

    1.5.5 熒光比色法測(cè)定小鼠骨骼肌ROS含量

    采用GENMED高質(zhì)熒光測(cè)定試劑盒測(cè)定小鼠骨骼肌ROS含量:取小鼠100 mg的腿部腓腸肌,勻漿,離心后測(cè)定蛋白濃度?,F(xiàn)配染色液工作液2 000 μl:10 μl染色液+ 190 μl預(yù)熱的稀釋液C,加入190 μl的染色液,37℃水槽孵育20 min,避免光照。熒光分光光度計(jì):激發(fā)波長(zhǎng)490 nm,散發(fā)波長(zhǎng)520 nm。

    1.6 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

    使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,使用雙因素方差分析處理數(shù)據(jù)。若有交互作用則采用簡(jiǎn)單效應(yīng)檢驗(yàn),若無(wú)交互作用則采用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)。最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果用M±SE表示。<0.05和<0.01表示在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義,其中,<0.05表示有顯著性差異,<0.01表示有非常顯著性差異。

    2 研究結(jié)果

    2.1 HIF-1α對(duì)小鼠骨骼肌Nrf2 mRNA和Nrf2、p-Nrf2、核蛋白Nrf2蛋白表達(dá)的影響

    如圖2所示,HC組與WC組相比,小鼠Nrf 2mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加(<0.05)。pNrf2和核蛋白Nrf2蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。WE組與WC組相比,小鼠骨骼肌Nrf2 mRNA顯著增加,Nrf2蛋白表達(dá)有增加趨勢(shì)但無(wú)顯著性,小鼠骨骼肌pNrf2和核蛋白Nrf2蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。HE組與HC組相比,小鼠Nrf2 mRNA和蛋白表達(dá)均無(wú)顯著性。HE組與WE組相比,小鼠Nrf2 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著增加(<0.05),P-Nrf2和核蛋白Nrf2蛋白表達(dá)顯著增加(<0.05)。

    圖2 小鼠骨骼肌Nrf2mRNA表達(dá)、Nrf2、p-Nrf2、核蛋白Nrf2蛋白表達(dá)

    Figure 2. Expression of Nrf2 mRNA and Nrf2/p-Nrf2/ Nuclear Nrf2 Protein in Mice

    注:*表示與WC組相比<0.05,#表示與WE組相比<0.05,&表示與HC組相比<0.05,下同。

    2.2 HIF-1α對(duì)小鼠骨骼肌Nrf2-ARE結(jié)合活性和Nrf2靶基因mRNA表達(dá)的影響

    如圖3所示,HC組與WC相比,小鼠Nrf2-ARE結(jié)合活性顯著增加,Nrf2下游靶基因SOD1、SOD2及NQO-1 mRNA表達(dá)顯著增加。WE組與WC組相比,小鼠骨骼肌Nrf2-ARE結(jié)合活性顯著增加,小鼠骨骼肌SOD1、SOD2 mRNA表達(dá)顯著增加,CAT和NQO-1 mRNA表達(dá)量雖有增加趨勢(shì)但無(wú)顯著性。HE組與HC組相比,小鼠骨骼肌Nrf2-ARE結(jié)合活性無(wú)明顯變化。HE組與WE組相比,小鼠Nrf2-ARE結(jié)合活性無(wú)明顯變化,小鼠骨骼肌SOD2和NQO-1 mRNA表達(dá)顯著增加,SOD1、CAT mRNA表達(dá)雖有增加趨勢(shì)但無(wú)顯著性。HE組與WE組相比,小鼠SOD1和CAT mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化,SOD 2mRNA表達(dá)量顯著增加,NQO-1 mRNA表達(dá)極顯著增加。

    圖3 小鼠骨骼肌Nrf2-ARE結(jié)合活性和Nrf2靶基因表達(dá)

    Figure 3. Nrf2-ARE Binding Activity and Expression of Nrf2 Target Genes in Mice

    2.3 HIF-1α對(duì)小鼠骨骼肌抗氧化酶表達(dá)的影響

    如圖4所示,HC組與WC相比,小鼠Nrf2下游靶基因SOD1、SOD2、CAT、NQO-1蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。WE與WC相比,小鼠骨骼肌SOD1、SOD2、CAT、NQO-1蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。HE組HC組相比,小鼠骨骼肌SOD1、SOD2、CAT、NQO-1均增加,但僅有NQO-1蛋白表達(dá)具有顯著性增加。HE組與WE組相比,小鼠Nrf2下游靶基因SOD1、SOD2、CAT、NQO-1均出現(xiàn)增加,但僅有NQO-1蛋白表達(dá)具有顯著性增加。

    圖4 小鼠骨骼肌抗氧化蛋白表達(dá)

    Figure 4. Expression of Peroxiredoxins in Mice

    2.4 HIF-1α對(duì)小鼠骨骼肌ROS水平的影響

    由圖5可知,HC組小鼠骨骼肌ROS水平極顯著低于WC組。WE組與WC組相比,小鼠骨骼肌ROS出現(xiàn)增加趨勢(shì)但無(wú)顯著差異。HE組與HC組相比,小鼠骨骼肌ROS無(wú)明顯變化。HE組小鼠骨骼肌ROS極顯著低于WE組。

    圖5 小鼠骨骼肌ROS水平

    Figure 5. The ROS Level in Skeletal of Mice

    注:**表示與WC組相比<0.01,##表示與WE組相比<0.01。

    3 分析討論

    3.1 安靜狀態(tài)HIF-1α高表達(dá)對(duì)小鼠骨骼肌抗氧化信號(hào)影響

    目前研究發(fā)現(xiàn),HIF-1α高表達(dá)對(duì)機(jī)體的多個(gè)方面都具有調(diào)節(jié)作用。通過(guò)轉(zhuǎn)染使GRC-1細(xì)胞HIF-1α高表達(dá),發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的水平會(huì)受到HIF-1α的影響。HIF-1α可作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)下調(diào)細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平,從而避免鈣超載[3]。Lunde等[13]對(duì)成年大鼠誘導(dǎo)14天使HIF-1α高表達(dá)后發(fā)現(xiàn),肌纖維橫截面面積增加,氧化酶活性增強(qiáng)和肌凝蛋白增加。然而,HIF-1α高表達(dá)對(duì)抗氧化系統(tǒng)的影響,目前缺乏文獻(xiàn)報(bào)道,因此,本研究試圖通過(guò)對(duì)野生鼠和HIF-1α轉(zhuǎn)基因鼠骨骼肌內(nèi)Nrf2-ARE抗氧化信號(hào)通路各指標(biāo)的對(duì)比,探究HIF-1α高表達(dá)對(duì)抗氧化系統(tǒng)的影響。

    在本實(shí)驗(yàn)中,安靜狀態(tài)下,HIF-1α高表達(dá)小鼠骨骼肌Nrf2蛋白表達(dá)水平明顯高于野生鼠。這可能是通過(guò)HIF-1α對(duì)其下游靶基因的調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn)。促紅細(xì)胞生成素(EPO)是位于HIF-1α下游的一種細(xì)胞因子,它可以刺激骨髓造血功能,促進(jìn)紅細(xì)胞生成。同時(shí),它也被認(rèn)為是一種具有抗炎和細(xì)胞保護(hù)作用的抗氧化劑,可以調(diào)控Nrf2的激活[5,11,12,17,24]。Genc等[7]研究發(fā)現(xiàn),對(duì)人體SH-SY5Y細(xì)胞加入EPO孵育24 h后,Nrf2胞漿蛋白和核蛋白表達(dá)均升高。這提示,HIF-1α可能可以通過(guò)其下游的EPO促使Nrf2表達(dá)增加。此外,HIF-1α轉(zhuǎn)基因鼠骨骼肌內(nèi)Nrf2-ARE結(jié)合活性顯著高于野生鼠,這可能如文獻(xiàn)所述,Nrf2的活化與NF-κB這一炎性轉(zhuǎn)錄因子的活化存在著競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用[23],HO-1不僅是Nrf2的靶基因也是HIF-1α的靶基因。HIF-1α可上調(diào)血紅素加氧酶(HO-1)表達(dá)。而較多的HO-1可抑制NF-κB活化從而促進(jìn)上游蛋白Nrf2的解離及入核[2]。這也提示,HIF-1α對(duì)Nrf2-ARE結(jié)合活性的調(diào)控可以通過(guò)二者共同的靶基因HO-1來(lái)實(shí)現(xiàn)。

    ROS是反映機(jī)體氧化應(yīng)激程度的指標(biāo),Nrf2可通過(guò)激活其下游抗氧化蛋白的表達(dá)來(lái)清除機(jī)體內(nèi)過(guò)多的ROS。李鐵瑛[1]的研究發(fā)現(xiàn),HIF-1α轉(zhuǎn)基因鼠骨骼肌抗氧化蛋白SOD2顯著增加,反映氧化應(yīng)激程度的脂質(zhì)過(guò)氧化物4-HNE蛋白表達(dá)量低于野生鼠。本研究中,HIF-1α轉(zhuǎn)基因小鼠Nrf2靶基因mRNA(SOD1、SOD2、NQO-1)及抗氧化蛋白(SOD2、NQO-1)表達(dá)量顯著升高。與WC組小鼠相比,HIF-1α轉(zhuǎn)基因小鼠骨骼肌ROS水平極顯著降低,與上述文獻(xiàn)所述結(jié)果一致。這表明,HIF-1α的高表達(dá)可以使小鼠骨骼肌Nrf2-ARE轉(zhuǎn)錄活性提高,抗氧化蛋白表達(dá)增多,以及抗氧化能力提高。

    3.2 一次性力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)HIF-1α轉(zhuǎn)基因鼠骨骼肌抗氧化信號(hào)的影響

    HIF-1α是介導(dǎo)機(jī)體對(duì)低氧適應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子。低氧可刺激HIF-1α的表達(dá)[18]。而劇烈運(yùn)動(dòng)可使體內(nèi)自由基產(chǎn)生增多,過(guò)多的自由基會(huì)使機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激進(jìn)而造成組織損傷[5]。目前有研究發(fā)現(xiàn),在這種運(yùn)動(dòng)引起氧化應(yīng)激中,HIF-1α的高表達(dá)可能具有一定的保護(hù)作用[20]。適度低氧(10% O2)干預(yù)后,PC12細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)增多,細(xì)胞總抗氧化能力增強(qiáng)[25]。以上研究表明,HIF-1α的增加對(duì)于機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)的調(diào)節(jié)具有積極作用,但它的增加是否通過(guò)Nrf2-ARE信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激狀態(tài)并不清楚。因此,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較野生鼠與HIF-1α轉(zhuǎn)基因鼠一次性力竭運(yùn)動(dòng)后骨骼肌內(nèi)Nrf2 mRNA、蛋白表達(dá)、Nrf2-ARE結(jié)合活性及下游抗氧化靶基因及抗氧化蛋白表達(dá)的變化,來(lái)探討在一次性力竭運(yùn)動(dòng)引起的氧化應(yīng)激中,HIF-1α對(duì)機(jī)體的調(diào)節(jié)作用及對(duì)Nrf2-ARE信號(hào)通路的影響。

    在本研究中,HIF-1α轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)過(guò)一次性力竭運(yùn)動(dòng)后骨骼肌Nrf2核蛋白及p-Nrf2蛋白表達(dá)顯著增加,而野生鼠在運(yùn)動(dòng)后并未出現(xiàn)變化。這可能是由于轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的HIF-1α高表達(dá)在安靜狀態(tài)時(shí)已經(jīng)造成了細(xì)胞內(nèi)Nrf2蛋白有較多的累積,大強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)造成的氧化應(yīng)激刺激促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因小鼠骨骼肌內(nèi)Nrf2的核易位及磷酸化。一次性遞增負(fù)荷至力竭運(yùn)動(dòng)后,本研究中,HE組小鼠骨骼肌Nrf2 mRNA和蛋白表達(dá)明顯高于WE組,且下游靶基因SOD2及NQO-1 mRNA表達(dá)及NQO-1蛋白表達(dá)水平也顯著高于WE組。這提示,進(jìn)行一次性力竭運(yùn)動(dòng)時(shí),HIF-1α的高表達(dá)可以通過(guò)促進(jìn)小鼠骨骼肌Nrf2 mRNA和蛋白表達(dá),使小鼠在高強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)下依然可以保持較高的抗氧化能力,使機(jī)體免受氧化應(yīng)激所造成的損傷。

    4 結(jié)論

    適當(dāng)?shù)腍IF-1α高表達(dá)不但可提高安靜狀態(tài)下小鼠骨骼肌Nrf2-ARE通路的激活,而且對(duì)一次力竭運(yùn)動(dòng)后骨骼肌ROS的消除也有積極的調(diào)節(jié)作用。

    [1] 李鐵瑛.耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)HIF-1α轉(zhuǎn)基因鼠骨骼肌Nrf2及抗氧化蛋白表達(dá)的影響[D]. 北京:北京體育大學(xué), 2016.

    [2] 吳丹. HO-1調(diào)控Nrf2-ARE信號(hào)通路對(duì)腦出血后神經(jīng)保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[D]. 南昌:南昌大學(xué), 2014.

    [3] 楊清滔,谷江,張永春,等. 高表達(dá)HIF-lα對(duì)腎癌細(xì)胞增殖及細(xì)胞內(nèi)STC-1、Ca2+水平的影響[J]. 貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2013, 38(5): 461-464.

    [4] AMELN H, GUSTAFSSON T, SUNDBERG78 C J,. Physiological activation of hypoxia inducible factor-1 in human skeletal muscle [J]. FASEB J, 2005, 19(8):1009-1011.

    [5] BRINES M. Emerging biological roles for erythropoietin in the nervous system[J]. Nat Rev Neurosci, 2005, 6(6):484-94.

    [6] FERICHE B, ARCFA A. Resistance training using different hypoxic training strategies: A basis for hypertrophy and muscle power development [J] . Sports Med Open, 2017, 3(1):12.

    [7] GENC K, EGRILMEZ M Y, GENC S. Erythropoietin induces nuclear translocation of Nrf2 and heme oxygenase-1 expression in SH-SY5Y cells[J]. Cell Biochem Funct, 2010, 28(3):197-201.

    [8] GIRARD O, BROCHERIE F, MILLET G P. Effects of altitude/hypoxia on single-and multiple-sprint performance: A comprehen-sive review[J]. Sports Med, 2017(6):1-19.

    [9] ISHII T, ITOH K, YAMAMOTO M,. Transcription factor Nrf2 coordinately regulates a group of oxidative stress-inducible genes in macrophages [J]. J Biol Chem,2000,275 (21):16023-16029.

    [10] KANG K W, LEE S J, PARK J W,. Phosphatidylinositol 3-kinase regulates nuclear translocation of NF-E2-related factor 2 through actin rearrangement in response to oxidative stress[J]. Mol Pharmacol, 2002, 62(5):1001-1010.

    [11] KENSLER T W, WAKABAYASHI N, BISWAL S. Cell survival responses to environmental stresses via the Keap1-Nrf2-ARE pathway[J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2007, 47(1):89-116.

    [12] KUMAR H, CHOI D K. Hypoxia inducible factor pathway and physiological adaptation: A cell survival pathway? [J]. Mediat Inflamm, 2015, 2015(3):1-11.

    [13] LUNDE I G, ANTON S L, BRUUSGAARD J C,. Hypoxia inducible factor 1α links fast‐patterned muscle activity and fast muscle phenotype in rats[J]. J Physiol, 2011, 589(6):1443-1454.

    [14] MAGESH S, CHEN Y, HU L. Small molecule modulators of Keap1-Nrf2-ARE pathway as potential preventive and therapeutic agents [J]. Med Res Rev, 2012, 32(4): 687-726.

    [15] MOI P, CHAN K, ASUNIS I,. Isolation of NF-E2-related factor 2 (Nrf2) , a NF-E2-like basic leucine zipper transcriptional activator that binds to the tandem NF-E2/APl repeat of the beta-globin locus control region [J]. Proc Natl Acad Sci USA,1994,91(21):9926-9930.

    [16] MUTHUSAMY V R, KANNAN S, SADHAASIVAM K,. Acute exercise stress activates Nrf2/ARE signaling and promotes antioxidant mechanisms in the myocardium [J]. Free Radic Biol Med, 2012, 2(2): 366-376.

    [17] NAKASO K, YANO H, FUKUHARA Y,. PI3K is a key molecule in the Nrf2-mediated regulation of antioxidative proteins by hemin in human neuroblastoma cells[J]. Febs Lett, 2003, 546(2):181-184.

    [18] O’ROURKE J F, TIAN Y M, RATCLIFFE P J,. Oxygen-regulated and transactivating domains in endothelial PAS protein 1: Comparison with hypoxia-inducible factor-1α[J]. J Biol Chem, 1999, 274(4):2060-2071.

    [19] POLOTSKY V Y, SAVRANSKY V, BEVANSFONTI S,. Intermittent and sustained hypoxia induce a similar gene express-ion profile in human aortic; endothelial cells [J]. Physiol Genomic, 2010, 41(3):b306-314.

    [20] SALCEDA S, BECK I, SRINIVAS V,. Complex role of protein phosphorylation in gene activation by hypoxia[J]. Kidney Int, 1997, 51(2):556.

    [21] WILBER R L. Application of altitude/hypoxic: Training by elite athletes [J]. Med Sci Sports Exerc,2007, 39(9):1610-1624.

    [22] ZHANG Y, JI W X, ZHANG L F. Effects of HIF-1α on ERRα/γ protein expression in mouse skeletal muscle [J] Edorium J Biomed Technol, 2015, 25(1):4-10.

    [23] ZHANG F, WANG S, ZHANG M,. Pharmacological induction of heme oxygenase-1 by a triterpenoid protects neurons against ischemic injury[J]. Stroke, 2012, 43(5):1390.

    [24] ZIPPER L M, MULACHYR T. Erk activation is required for Nrf2 nuclear localization during pyrrolidine dithiocarbamate induction of glutamate cysteine ligase modulatory gene expression in HepG2 cells[J]. Toxicol Sci, 2003, 73(1):124.

    Effects of Acute Exhaustive Exercise on the Antioxidant Signal of Nrf2 in Skeletal Muscle of HIF-1α Transgenic Mice

    WANG Lin-jia , ZHANG Ying

    Beijing Sport University, Beijing 100084,China.

    To examine the effect of HIF-1α on Nrf2-ARE antioxidant pathway in mice skeletal muscle after acute exhaustion exercise. Methods: HIF-1α high expression (H) and C57BL/6J mice (W) were used at 20 respectively and each kind of mice were randomly divided into two groups: control (C) and exercise (E). The treadmill exercise was preformed at the acute exhaustion exercise. On the day of acute exercise, mice allocated to perform treadmill running were subject to 5% incline and 5min at 10m/min, and then increased 3m/min every 3 minutes. Mice were sacrificed at the indicated time points following treadmill running.Nrf2, phosphor-Nrf2 (Ser40), nuclear Nrf2 protein were measured by Western Blot and Nrf2-ARE binding activity, the mRNA and proetin levels of Nrf2 target genes, key antioxidant enzymes (SOD1, SOD2, CAT, NQO-1) and ROS level, were also measured in skeletal muscles after the interventions. Results: 1) The results showed that compared with WC, RNA and protein expression level of Nrf2 were increased in HC skeletal muscles. Nrf2-ARE binding activity, Nrf2 target gene SOD1, SOD2, NQO-1 mRNA expression and NQO-1 protein expression were also increased in HC skeletal muscles. Meanwhile, ROS level in HC skeletal muscles decreased significantly. 2) After the acute exhaustion exercise, high HIF-1α expression mice (HE) had higher expression of p-Nrf2 (Ser 40) and nuclear Nrf2 protein than the wide type mice (WE). The mRNA expression of SOD1 and mRNA /protein of NQO-1 in HE increased as well. In contrast, ROS level decreased significantly in HE muscles. Conclusion: The result indicated that the proper high expression of HIF-1α could promote the antioxidant capacity of skeletal muscle in mice through Nrf2-ARE pathway.

    G804.7

    A

    1000-677X(2018)11-0060-06

    10.16469/j.css.201811006

    2018-08-08;

    2018-11-06

    國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31471134)。

    王林佳,女,在讀博士研究生,主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)生物化學(xué),E-mail:489499191@qq.com。

    張纓,女,教授,博士,博士研究生導(dǎo)師,主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)與骨骼肌代謝, E-mail:zhyi9256@126.com。

    猜你喜歡
    力竭骨骼肌轉(zhuǎn)基因
    探秘轉(zhuǎn)基因
    轉(zhuǎn)基因,你吃了嗎?
    西歸粗多糖對(duì)游泳力竭小鼠的抗運(yùn)動(dòng)性疲勞作用
    中成藥(2018年3期)2018-05-07 13:34:34
    心多大才好
    歲月(2017年7期)2017-07-18 18:52:11
    富硒板黨對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)能力的影響及機(jī)制
    紋狀體A2AR和D2DR對(duì)大鼠力竭運(yùn)動(dòng)過(guò)程中蒼白球GABA和Glu釋放的調(diào)控研究
    8-羥鳥(niǎo)嘌呤可促進(jìn)小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞的增殖和分化
    骨骼肌細(xì)胞自噬介導(dǎo)的耐力運(yùn)動(dòng)應(yīng)激與適應(yīng)
    天然的轉(zhuǎn)基因天然的轉(zhuǎn)基因“工程師”及其對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的意蘊(yùn)
    骨骼肌缺血再灌注損傷的機(jī)制及防治進(jìn)展
    久久久久久人人人人人| 91精品三级在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 69精品国产乱码久久久| 亚洲av欧美aⅴ国产| 免费观看在线日韩| 久久精品人人爽人人爽视色| 久久毛片免费看一区二区三区| 考比视频在线观看| 人妻一区二区av| av女优亚洲男人天堂| 人人澡人人妻人| 亚洲情色 制服丝袜| 在线观看免费高清a一片| 日本欧美国产在线视频| 最近的中文字幕免费完整| 精品久久久精品久久久| 婷婷色综合www| 国产 精品1| 超碰97精品在线观看| 免费少妇av软件| 国产一区有黄有色的免费视频| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 欧美 日韩 精品 国产| 婷婷成人精品国产| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 欧美精品高潮呻吟av久久| 免费少妇av软件| 热99久久久久精品小说推荐| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 草草在线视频免费看| 午夜日本视频在线| freevideosex欧美| 午夜日本视频在线| 午夜日本视频在线| 久久99一区二区三区| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 男女免费视频国产| 久久久久久久久久人人人人人人| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 国产免费福利视频在线观看| 亚洲国产日韩一区二区| 久久鲁丝午夜福利片| 97超碰精品成人国产| 欧美激情 高清一区二区三区| 在线观看免费视频网站a站| 青春草视频在线免费观看| 国产色婷婷99| av视频免费观看在线观看| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 免费观看av网站的网址| 男女啪啪激烈高潮av片| 免费观看a级毛片全部| 少妇人妻久久综合中文| 99热网站在线观看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 久久久久久久久久久久大奶| 在线天堂中文资源库| 97超碰精品成人国产| 蜜桃在线观看..| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 免费大片黄手机在线观看| 国产av精品麻豆| 国产av码专区亚洲av| av播播在线观看一区| 我的女老师完整版在线观看| 咕卡用的链子| 国产又爽黄色视频| 亚洲av国产av综合av卡| 青春草亚洲视频在线观看| 久久久久国产精品人妻一区二区| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲av欧美aⅴ国产| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 在线观看免费日韩欧美大片| 黄色怎么调成土黄色| 热re99久久精品国产66热6| videos熟女内射| 精品一区二区三卡| 91成人精品电影| 免费黄色在线免费观看| 精品一区二区三区视频在线| av电影中文网址| 在线免费观看不下载黄p国产| 99热6这里只有精品| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 少妇 在线观看| 黄色 视频免费看| 老女人水多毛片| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 美国免费a级毛片| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 婷婷成人精品国产| 色网站视频免费| 成人国语在线视频| 国产 精品1| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产精品国产三级专区第一集| 久久热在线av| 韩国精品一区二区三区 | 丰满少妇做爰视频| 免费人成在线观看视频色| 伊人亚洲综合成人网| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 少妇人妻 视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 极品少妇高潮喷水抽搐| 边亲边吃奶的免费视频| 精品第一国产精品| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 精品一区二区三区视频在线| 欧美+日韩+精品| 99香蕉大伊视频| 美女福利国产在线| 免费人成在线观看视频色| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 中国国产av一级| 亚洲成人一二三区av| 伦精品一区二区三区| 国产成人精品无人区| 高清欧美精品videossex| 午夜激情av网站| 女的被弄到高潮叫床怎么办| tube8黄色片| 久久精品国产亚洲av涩爱| 永久免费av网站大全| 国产熟女午夜一区二区三区| 日本vs欧美在线观看视频| 日韩中文字幕视频在线看片| 综合色丁香网| 少妇 在线观看| 精品一品国产午夜福利视频| 日本免费在线观看一区| 成人国产麻豆网| 久久久久久久精品精品| 国产老妇伦熟女老妇高清| tube8黄色片| 看免费成人av毛片| 男女边摸边吃奶| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 日日摸夜夜添夜夜爱| 啦啦啦啦在线视频资源| 秋霞伦理黄片| 亚洲av电影在线进入| 男女啪啪激烈高潮av片| 久久这里只有精品19| 大片电影免费在线观看免费| 综合色丁香网| 国产精品熟女久久久久浪| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲精品一区蜜桃| 国产精品人妻久久久久久| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 爱豆传媒免费全集在线观看| 国国产精品蜜臀av免费| 高清不卡的av网站| 在线 av 中文字幕| 婷婷色av中文字幕| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 在线观看国产h片| 最近中文字幕高清免费大全6| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久精品久久久久久久性| 亚洲国产精品国产精品| av视频免费观看在线观看| 久久精品人人爽人人爽视色| 一级,二级,三级黄色视频| 欧美bdsm另类| 97在线视频观看| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产精品一区www在线观看| 丝瓜视频免费看黄片| 男女无遮挡免费网站观看| 久久久久国产网址| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 七月丁香在线播放| 成人影院久久| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲五月色婷婷综合| 韩国精品一区二区三区 | 99久久中文字幕三级久久日本| 久久ye,这里只有精品| 99久久综合免费| 国产日韩欧美视频二区| 亚洲伊人色综图| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 成人午夜精彩视频在线观看| 看十八女毛片水多多多| 天天操日日干夜夜撸| 五月伊人婷婷丁香| 免费av中文字幕在线| 午夜福利视频精品| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 日本91视频免费播放| 欧美激情 高清一区二区三区| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 国产福利在线免费观看视频| 日本-黄色视频高清免费观看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产精品久久久久久精品古装| 日本欧美视频一区| 在线天堂中文资源库| 亚洲av中文av极速乱| 少妇的丰满在线观看| av卡一久久| 麻豆乱淫一区二区| 日日啪夜夜爽| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 咕卡用的链子| 中文字幕亚洲精品专区| 秋霞伦理黄片| 全区人妻精品视频| 免费观看a级毛片全部| 久久热在线av| 九色亚洲精品在线播放| 丝袜喷水一区| 亚洲国产日韩一区二区| 免费人妻精品一区二区三区视频| 午夜激情久久久久久久| 好男人视频免费观看在线| 啦啦啦啦在线视频资源| 少妇的逼水好多| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 婷婷色综合大香蕉| 久久午夜综合久久蜜桃| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产又色又爽无遮挡免| 精品福利永久在线观看| 亚洲综合色惰| 在线观看免费高清a一片| 在线观看www视频免费| 国产精品国产av在线观看| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 美女国产视频在线观看| 91精品国产国语对白视频| 在线观看www视频免费| 蜜桃在线观看..| 母亲3免费完整高清在线观看 | 亚洲人成77777在线视频| 最黄视频免费看| 免费av中文字幕在线| 久久久久网色| 午夜福利视频在线观看免费| 久久久久久久久久人人人人人人| 国产熟女午夜一区二区三区| 久久影院123| 欧美日韩av久久| 国产精品久久久av美女十八| 看十八女毛片水多多多| 精品国产乱码久久久久久小说| 搡老乐熟女国产| 日韩一区二区三区影片| 国产精品国产av在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 精品午夜福利在线看| 9191精品国产免费久久| 九九爱精品视频在线观看| 欧美日本中文国产一区发布| av播播在线观看一区| www.熟女人妻精品国产 | 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 一区在线观看完整版| 天堂8中文在线网| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 午夜视频国产福利| 男女免费视频国产| 大码成人一级视频| 丰满少妇做爰视频| 国产乱人偷精品视频| 国产欧美亚洲国产| 欧美日韩精品成人综合77777| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲精品第二区| 亚洲国产精品999| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 国产激情久久老熟女| 一区二区三区乱码不卡18| a级毛色黄片| 午夜视频国产福利| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 亚洲av.av天堂| 久久97久久精品| 国产爽快片一区二区三区| 欧美xxⅹ黑人| 少妇的逼好多水| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 精品一区二区三卡| av网站免费在线观看视频| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产高清不卡午夜福利| 精品久久蜜臀av无| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产精品国产av在线观看| av播播在线观看一区| 丝袜美足系列| 精品人妻在线不人妻| 少妇被粗大猛烈的视频| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 久久这里有精品视频免费| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 少妇高潮的动态图| 少妇的逼好多水| 如何舔出高潮| 香蕉丝袜av| 国产片内射在线| 亚洲图色成人| 亚洲精品自拍成人| 美女内射精品一级片tv| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 香蕉国产在线看| 亚洲av免费高清在线观看| 国产成人一区二区在线| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 三级国产精品片| 大香蕉久久网| 成人黄色视频免费在线看| 大片免费播放器 马上看| 丝袜喷水一区| 欧美日韩综合久久久久久| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 在线观看人妻少妇| 亚洲精品,欧美精品| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 久久久欧美国产精品| 亚洲伊人久久精品综合| 99热6这里只有精品| 亚洲成人av在线免费| 久久午夜综合久久蜜桃| av黄色大香蕉| 国产黄色免费在线视频| 美女内射精品一级片tv| 18+在线观看网站| 日韩中字成人| 一本大道久久a久久精品| 成人综合一区亚洲| 久久免费观看电影| 在线观看美女被高潮喷水网站| 免费黄网站久久成人精品| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲精品国产av蜜桃| 全区人妻精品视频| 中国国产av一级| 老熟女久久久| 欧美精品一区二区大全| 黄片播放在线免费| 久久精品国产a三级三级三级| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 亚洲内射少妇av| 如何舔出高潮| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 男女高潮啪啪啪动态图| 婷婷成人精品国产| 伦理电影大哥的女人| 中国三级夫妇交换| a级毛片黄视频| 国产毛片在线视频| 又大又黄又爽视频免费| 国产在视频线精品| 久热这里只有精品99| 国产精品偷伦视频观看了| 两个人看的免费小视频| 久久人人97超碰香蕉20202| 最近中文字幕2019免费版| 日韩中文字幕视频在线看片| 97精品久久久久久久久久精品| 欧美人与善性xxx| 看非洲黑人一级黄片| 婷婷色综合www| 精品视频人人做人人爽| 久久久久久久久久久久大奶| 校园人妻丝袜中文字幕| av线在线观看网站| 精品人妻偷拍中文字幕| 伦理电影免费视频| 久久精品国产a三级三级三级| 日本与韩国留学比较| 久久韩国三级中文字幕| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产熟女欧美一区二区| 女人精品久久久久毛片| 午夜福利影视在线免费观看| 日本91视频免费播放| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲欧洲日产国产| 少妇熟女欧美另类| 亚洲,欧美,日韩| 最黄视频免费看| 丰满少妇做爰视频| 国产xxxxx性猛交| 久久久亚洲精品成人影院| 精品久久国产蜜桃| 国产成人aa在线观看| 97超碰精品成人国产| 欧美日韩视频精品一区| 午夜福利视频精品| 国产乱人偷精品视频| 永久网站在线| 国产成人精品婷婷| 亚洲国产精品成人久久小说| 精品人妻在线不人妻| 最新的欧美精品一区二区| 免费大片18禁| 中文字幕制服av| 丝袜人妻中文字幕| 热99国产精品久久久久久7| 另类亚洲欧美激情| 美女主播在线视频| 午夜福利影视在线免费观看| 精品一品国产午夜福利视频| 大香蕉久久成人网| 久久韩国三级中文字幕| 在线观看一区二区三区激情| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 一区二区三区四区激情视频| 免费黄频网站在线观看国产| 久久99一区二区三区| 在线观看国产h片| 自线自在国产av| 欧美精品一区二区大全| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| av在线app专区| 最新的欧美精品一区二区| 人妻人人澡人人爽人人| 人妻 亚洲 视频| 国产麻豆69| 亚洲精品第二区| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲情色 制服丝袜| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 免费在线观看黄色视频的| 97人妻天天添夜夜摸| 99国产综合亚洲精品| 日本爱情动作片www.在线观看| kizo精华| 午夜久久久在线观看| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 99久久综合免费| 国产淫语在线视频| 制服诱惑二区| av女优亚洲男人天堂| 久久久久久久久久人人人人人人| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产成人精品在线电影| 久久热在线av| 午夜视频国产福利| 亚洲精品色激情综合| 91成人精品电影| 少妇人妻 视频| 秋霞在线观看毛片| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 一区二区三区四区激情视频| av视频免费观看在线观看| 成人国产av品久久久| 亚洲精品国产色婷婷电影| av在线app专区| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 免费看不卡的av| 国产 一区精品| 亚洲av免费高清在线观看| 成年av动漫网址| 欧美日本中文国产一区发布| av免费在线看不卡| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 街头女战士在线观看网站| 下体分泌物呈黄色| 久久久久久久久久人人人人人人| 黄片播放在线免费| 免费人成在线观看视频色| 日日撸夜夜添| 成人二区视频| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 美国免费a级毛片| 伦理电影大哥的女人| 黄片播放在线免费| 日韩一区二区视频免费看| 国产麻豆69| 18禁动态无遮挡网站| 超色免费av| 国产成人aa在线观看| 男女免费视频国产| 日韩欧美精品免费久久| 在线精品无人区一区二区三| 黑人猛操日本美女一级片| 91成人精品电影| 亚洲欧洲国产日韩| 国产成人欧美| 街头女战士在线观看网站| 51国产日韩欧美| 国产成人精品久久久久久| 美女内射精品一级片tv| 久久鲁丝午夜福利片| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 午夜视频国产福利| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 丁香六月天网| 99热国产这里只有精品6| 成人二区视频| 超色免费av| 亚洲五月色婷婷综合| 美女大奶头黄色视频| 大香蕉97超碰在线| 99视频精品全部免费 在线| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲国产精品999| 夫妻午夜视频| 久久狼人影院| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产色爽女视频免费观看| 国产一区二区在线观看av| 18禁观看日本| 日韩中字成人| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲av欧美aⅴ国产| 在线 av 中文字幕| 精品熟女少妇av免费看| 成人无遮挡网站| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 亚洲情色 制服丝袜| 国产精品不卡视频一区二区| 欧美少妇被猛烈插入视频| 夜夜爽夜夜爽视频| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| av在线app专区| 美女国产视频在线观看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 日韩精品有码人妻一区| 国产深夜福利视频在线观看| 免费在线观看黄色视频的| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 久久99蜜桃精品久久| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 美女大奶头黄色视频| 久久久久精品性色| 天天操日日干夜夜撸| 国产精品久久久久久精品电影小说| 高清黄色对白视频在线免费看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 在线看a的网站| 在现免费观看毛片| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 日韩免费高清中文字幕av| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 午夜福利影视在线免费观看| 国产av码专区亚洲av| 一本大道久久a久久精品| 中文字幕人妻丝袜制服| 婷婷色综合www| 免费观看av网站的网址| 99久久精品国产国产毛片| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 婷婷色综合www| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 久久国内精品自在自线图片| 国产熟女欧美一区二区| 婷婷色综合www| 国产成人精品久久久久久| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产免费一级a男人的天堂| 国产 精品1| 18在线观看网站| 国产日韩欧美视频二区| 2022亚洲国产成人精品| 三级国产精品片| 黄片无遮挡物在线观看| 欧美亚洲日本最大视频资源| 婷婷色综合大香蕉| 男人舔女人的私密视频| 日韩制服骚丝袜av| 涩涩av久久男人的天堂| 精品久久蜜臀av无| 在线观看免费视频网站a站| 免费av中文字幕在线| 国产精品不卡视频一区二区| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 欧美人与善性xxx| 高清不卡的av网站| 老司机影院毛片| 亚洲综合精品二区| 男女下面插进去视频免费观看 | 亚洲国产日韩一区二区| 精品少妇内射三级| 99国产综合亚洲精品| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲精品日本国产第一区| 久久人妻熟女aⅴ| 久久久久网色| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 少妇熟女欧美另类| 国产精品成人在线| 亚洲精品国产av蜜桃| 亚洲综合色惰| 欧美精品高潮呻吟av久久| 国国产精品蜜臀av免费| 中国美白少妇内射xxxbb| 久久99热这里只频精品6学生| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 在现免费观看毛片| 精品人妻偷拍中文字幕|