QuEChERS-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蔬菜中105種農(nóng)藥殘留

鄧慧芬, 張建瑩, 黃 科, 鐘恬恬, 林麗敏

(深圳海關(guān)食品檢驗檢疫技術(shù)中心, 廣東 深圳 518045)

農(nóng)藥殘留涉及食品、環(huán)境、貿(mào)易和日常生活安全等多方面,隨著農(nóng)藥殘留監(jiān)測工作的深入開展,有關(guān)農(nóng)藥殘留安全性的報道逐漸增多,農(nóng)藥的超量、濫用等不規(guī)范使用所帶來的環(huán)境污染和農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留超標(biāo)問題越來越受到各國政府和公眾的廣泛關(guān)注。在食品安全日益受到關(guān)注的同時,尋求一種簡便快速、準(zhǔn)確高效、價格低廉的多農(nóng)殘分析方法,將更能滿足食品安全檢測的需要。

目前,蔬菜中農(nóng)藥殘留的檢測方法有分光光度法[1]、酶聯(lián)免疫測定法[2,3]、生物傳感器測定法[4,5]、氣相色譜法(GC)[6,7]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[8,9]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[10-12]、液相色譜法(LC)[13-15]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[16-19]等。分光光度法靈敏度和選擇性不夠好;而免疫測定和生物傳感器測定法雖測定快速,但該方法在使用上有著很大的局限性:只能對有特異性反應(yīng)的氨基甲酸酯類農(nóng)藥以及代謝物進(jìn)行測定,不能對種類繁多的農(nóng)藥殘留進(jìn)行測定。氣相色譜法或液相色譜法易受雜質(zhì)干擾,且在檢測器的靈敏度及確證檢測技術(shù)上存在不足。而LC與MS聯(lián)用的方法,操作簡便,檢出限低,定性能力好,能對復(fù)雜食品基質(zhì)中農(nóng)藥多殘留進(jìn)行很好的分析。QuEChERS方法步驟少,目標(biāo)化合物損失少,試劑消耗少,經(jīng)濟(jì)環(huán)?？焖俑咝?適合的樣品基質(zhì)及農(nóng)藥種類多,已成為多殘留分析的首選方法。

本研究的主要目的是針對我國最廣泛使用及常檢出的農(nóng)藥種類,優(yōu)化QuEChERS前處理方法,建立蔬菜中105種農(nóng)藥多殘留檢測的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定性及定量檢測方法。該方法操作簡便、快速,選擇性好,準(zhǔn)確度高,具有較大的實(shí)用意義。

1 實(shí)驗部分

1.1 儀器、材料與試劑

液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(日本Shimadzu公司);均質(zhì)儀(美國Omni公司);旋渦振蕩儀(德國Heidolph公司);往復(fù)振蕩儀(日本Yamato公司);高速冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司);超純水儀(美國Millipore公司); 0.22 μm有機(jī)濾膜。

N-丙基乙二胺吸附劑(PSA)、石墨化炭黑(GCB)、封端十八烷基鍵合硅膠吸附劑(EC-C18)(美國Supelco公司)。甲醇、乙腈、正己烷、甲酸、乙酸銨均為色譜純(德國Merck公司),無水MgSO4、NaCl均為分析純(成都市科龍化工試劑廠);水為Milli-Q超純水。

105種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品的純度均≥95%(德國Dr. Ehrenstorfer公司)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的溶解度選用甲醇、乙腈或丙酮等溶劑配制質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的各個農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備液,再移取適量單標(biāo)準(zhǔn)儲備液使用乙腈配制成10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(-30 ℃避光存放)。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1樣品處理

稱取10.0 g(精確至0.01 g)蔬菜樣品于50 mL具塞離心管中,加入5 mL水,再加入10 mL乙腈,在28 000 r/min下均質(zhì)1 min,然后加入4.0 g無水MgSO4、1.0 g NaCl、1.0 g檸檬酸鈉和0.5 g檸檬酸氫二鈉,加蓋迅速搖勻,振蕩提取10 min, 9 500 r/min離心5 min。取上清液,待凈化。

1.2.2樣品凈化

取5 mL上清液,移入含900 mg MgSO4、150 mg PSA、150 mg EC-C18、30 mg GCB吸附劑的15 mL具塞離心管中,搖勻后,振蕩3 min,以9 500 r/min離心5 min。取上清液1 mL,經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后,供LC-MS/MS測定。

楊應(yīng)龍，播州宣慰使楊烈之子?！澳伦诼c五年，烈死，子應(yīng)龍請襲，命姑予職。神宗萬歷元年，給播州新襲宣慰使楊應(yīng)龍敕書”[3]1250?？梢?，萬歷元年開始，播州便正式成為楊應(yīng)龍管轄區(qū)域。在其統(tǒng)治下，播州為何一再被勘，邢玠在被派去勘播州時招撫政策是否失當(dāng)，下面便一一展開論述。

1.3 色譜條件

色譜柱:Poroshell 120 EC-C18 2.7 μm, 100 mm×2.1 mm(美國Agilent公司)。流動相A為5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸,v/v),流動相B為甲醇。梯度洗脫程序:0～0.2 min, 10%B; 0.2～1.5 min, 10%B～40%B; 1.5～8 min, 40%B～70%B; 8～10 min, 70%B～80%B; 10～13 min, 80%B～100%B; 13～15 min, 100%B; 15～15.1 min, 100%B～10%B; 15.1～18 min, 10%B。流速:0.3 mL/min。柱溫40 ℃。進(jìn)樣量2 μL。

1.4 質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧離子源(ESI)。掃描方式:正負(fù)離子同時掃描。離子源溫度:300 ℃。霧化氣流速:3.0 L/min。干燥氣流速:10.0 L/min。脫溶劑管溫度:200 ℃。加熱模塊溫度:400 ℃。加熱氣流速:10.0 L/min。離子源電壓:4.0 kV。采用分段多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式。分辨率:0.6 amu。駐留時間:30 ms。

2 結(jié)果與討論

2.1 目標(biāo)農(nóng)藥的選取

農(nóng)藥種類繁多,目前世界上共有幾千種,我國常用的農(nóng)藥也有幾百種。隨著生產(chǎn)的實(shí)際需要和農(nóng)藥工業(yè)的不斷發(fā)展,農(nóng)藥新品種每年都在增加。本研究根據(jù)我國禁限用66種農(nóng)藥名單,選取了蔬菜中禁用的15種農(nóng)藥;在《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》標(biāo)準(zhǔn)(GB 2763-2016)對蔬菜制定了限量的農(nóng)藥中選取了90種農(nóng)藥項目。所選取的105種農(nóng)藥均為適用于LC-MS/MS分析的常檢出的代表性農(nóng)藥。

2.2 QuEChERS前處理方法的優(yōu)化

2.2.1提取溶劑的選擇

圖 1 PSA、C18和GCB加入量對部分農(nóng)藥回收率的影響

在農(nóng)藥多殘留分析中,常用的提取溶劑有甲醇、丙酮、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷等,而非極性溶劑如二氯甲烷或者二氯甲烷-石油醚毒性很大,會對分析工作者的健康構(gòu)成威脅。本實(shí)驗考察了甲醇、丙酮、乙腈、乙酸乙酯這4種有機(jī)溶劑對樣品提取效果的差異。結(jié)果表明,以甲醇作為提取溶劑時較難分層;乙酸乙酯較適用于有機(jī)磷農(nóng)藥的提取,對于極性較大的農(nóng)藥則不易提取且極性小的脂肪、油脂等易被共萃出來;丙酮提取出的雜質(zhì)和色素較多;而乙腈對農(nóng)藥的溶解性較強(qiáng),加入乙腈的樣品提取效果良好,且對油脂和色素類雜質(zhì)的溶解度較小,因此本試驗選用乙腈作為提取試劑。在加入乙腈之前先加入一定量的水可以明顯提高樣品在提取劑中的浸潤效果,使樣品在試劑中分布更均勻。

2.2.2樣品的凈化與吸附劑的選擇

農(nóng)藥多殘留分析需解決的主要問題之一是去除共提取的基質(zhì)干擾物對定量準(zhǔn)確度、靈敏度及儀器污染的影響。因此,樣品前處理中對基質(zhì)凈化方法的選擇及優(yōu)化是多殘留檢測的關(guān)鍵。QuEChERS方法使用分散固相萃取(dSPE)凈化,固相吸附劑直接加入樣品提取液以吸附干擾物。本工作分別考察了PSA、EC-C18和GCB的加入量，結(jié)果見圖1。

PSA加入量的確定 PSA可吸附糖、脂肪酸、有機(jī)酸等極性干擾物。本研究以白菜為試驗對象,在白菜樣品中添加0.100 mg/kg的105種農(nóng)藥,分別考察了加入50、100、150、200 mg PSA進(jìn)行前處理時農(nóng)藥的回收率。實(shí)驗結(jié)果表明,當(dāng)PSA添加量為50、100 mg時,有部分農(nóng)藥化合物的回收率較低;當(dāng)PSA添加量為150 mg時,105種農(nóng)藥的回收率在77.8%～110%,符合正?；厥章室?當(dāng)PSA添加量為200 mg時,有部分農(nóng)藥如(涕滅威、涕滅威砜)的回收率大于120%,而芐嘧磺隆和生物芐呋菊酯的回收率則偏低(分別為53.0%和70.7%);部分回收率數(shù)據(jù)見圖1-PSA。

EC-C18加入量的確定 EC-C18可吸附脂肪和蠟質(zhì)等非極性干擾物。比較了添加50、100、150、200 mg EC-C18進(jìn)行前處理時農(nóng)藥的回收率。實(shí)驗結(jié)果表明,當(dāng)EC-C18的添加量為150 mg和200 mg時,98.1%的農(nóng)藥回收率達(dá)到最佳,回收率為79.8%～98.2%;3.8%的農(nóng)藥如喹螨醚的回收率在添加量為150 mg時(79.8%)優(yōu)于添加量為200 mg時(66.7%);部分回收率數(shù)據(jù)見圖1-EC-C18。

GCB加入量的確定 GCB可吸附色素、甾醇等大分子非極性干擾物。比較了添加10、20、30、40、50 mg GCB進(jìn)行前處理時農(nóng)藥的回收率。實(shí)驗結(jié)果表明,與PSA、C18相比,GCB去除色素的效果最佳,5 mL提取液經(jīng)30 mg GCB凈化就能有效去除色素,使樣品更加澄清,從而減小對儀器的污染;但GCB也吸附具有平面結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥,如多菌靈、噻菌靈、氯吡脲等,導(dǎo)致回收率降低;當(dāng)GCB添加量為40 mg時,多菌靈、噻菌靈、氯吡脲的回收率分別為77.6%、78.1%、74.2%;當(dāng)GCB添加量增至50 mg以上時,其回收率明顯降低,回收率不到60.0%;部分回收率數(shù)據(jù)見圖1-GCB。

綜上,本工作最終確定以PSA、C18、GCB三者混合作為吸附劑,其用量分別為150 mg、150 mg、30 mg,對于色素含量高顏色較深的蔬菜樣品,可適量增加GCB的用量,但不超過45 mg。

2.3 LC-MS/MS條件的優(yōu)化

在電噴霧離子源正負(fù)離子模式下,先對各農(nóng)藥目標(biāo)物的單標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描,獲得穩(wěn)定的母離子,SIM掃描模式優(yōu)化碎裂電壓;再進(jìn)行子離子掃描,每個目標(biāo)物選取2對響應(yīng)值高的特征離子對作為定量、定性離子對,進(jìn)一步優(yōu)化碰撞能量。優(yōu)化結(jié)果見表1。

表 1 105種農(nóng)藥的類型、保留時間和質(zhì)譜參數(shù)

表 1 (續(xù))

表 1 (續(xù))

表 1 (續(xù))

表 1 (續(xù))

* Quantitative ions.

2.4 流動相的選擇

選擇5 mmol/L乙酸銨水溶液-甲醇、5 mmol/L乙酸銨水溶液-乙腈和5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)-甲醇作為流動相進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)選用5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%(v/v)甲酸)-甲醇作為流動相時,目標(biāo)化合物的響應(yīng)信號更強(qiáng),離子化效果更好,因此選擇5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)-甲醇作為流動相。105種農(nóng)藥化合物的MRM總離子流圖見圖2。

圖 2 105種農(nóng)藥的MRM總離子流色譜圖

2.5 線性關(guān)系和定量限

在優(yōu)化的條件下進(jìn)行了方法學(xué)考察。分別配制了0.010、0.020、0.050、0.100、0.200 mg/L的系列基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,105種農(nóng)藥在0.010～0.200 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)在0.990 1～0.999 9之間,詳見表2。

以MRM定量離子的色譜峰面積(y)對分析物的質(zhì)量濃度(x, mg/L)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,同時取經(jīng)檢測不含待測目標(biāo)農(nóng)藥化合物的白菜空白基質(zhì)進(jìn)行定量限的考察,以信噪比(S/N)≥10確定定量限(LOQ), 105種農(nóng)藥化合物的定量限為0.010 mg/kg,能夠滿足蔬菜中農(nóng)藥殘留的測定要求。

2.6 回收率和精確度

本實(shí)驗用空白白菜、韭菜、土豆樣品作為驗證基質(zhì),每種基質(zhì)進(jìn)行3個水平的加標(biāo)回收實(shí)驗,加標(biāo)水平分別為0.010、0.050、0.100 mg/kg,每個水平進(jìn)行6次平行實(shí)驗,按上述優(yōu)化后的方法提取、凈化樣品,并進(jìn)行LC-MS/MS分析,外標(biāo)法定量。基于基質(zhì)效應(yīng),在進(jìn)行回收試驗時,采用匹配的空白基質(zhì)提取液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。白菜基質(zhì)的回收率結(jié)果及RSD見表2。所測化合物的回收率均在68.2%～108%之間,精密度均小于11.8%,方法的回收率和精密度均符合殘留分析的要求。

表 2 白菜中105種農(nóng)藥的線性方程、相關(guān)系數(shù)、回收率和RSD

表 2 (續(xù))

表 2 (續(xù))

y: peak area;x: mass concentration, mg/L.

2.7 實(shí)際樣品檢測及不同方法的結(jié)果比較

應(yīng)用所建立的分析方法對市場采購的芥蘭、菜心、彩椒、豇豆、芹菜等蔬菜樣品進(jìn)行檢測,同時選用GB/T 20769-2008方法進(jìn)行檢測。分別在芥蘭、菜心、彩椒、豇豆、芹菜、油麥菜、黃瓜、白菜中檢出吡唑醚菌酯、烯酰嗎啉、咪鮮胺、噻蟲胺、氧樂果、克百威、嘧霉胺、多菌靈、噻蟲嗪等農(nóng)藥殘留,結(jié)果表明兩種方法的檢測結(jié)果相近,見表3。

表 3 農(nóng)藥殘留檢測結(jié)果及兩種方法比對結(jié)果

3 結(jié)論

本研究選取了蔬菜中常檢出的105種農(nóng)藥,建立并優(yōu)化了QuEChERS-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。該方法高效便利、準(zhǔn)確可靠、檢測通量高、成本較低,特別適用于日常蔬菜樣品中農(nóng)藥多殘留檢測的定性定量分析,同時也為風(fēng)險評估提供了一種高效可靠的檢測手段。