水楊酸對(duì)兩種海洋微藻生長(zhǎng)及油脂積累的影響

張誠鵬，朱 堯,張仁璇,姜 思,佟少明

(遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 遼寧省植物生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116081)

綠色、可再生的生物質(zhì)能源的開發(fā)和利用是替代化石能源最有吸引力的途徑之一[1]。生物質(zhì)能源較為清潔，可降低對(duì)環(huán)境的污染[2]。在過去十年間，隨著全球生物柴油和生物乙醇產(chǎn)量的急劇增加，許多跨國(guó)公司投資于這一產(chǎn)業(yè)，利用大片土地來生產(chǎn)生物燃料。但在最近幾年，其中部分公司由于缺少原料以及對(duì)原料缺乏一定的了解等原因，已經(jīng)延緩生產(chǎn)甚至已經(jīng)停產(chǎn)[3]。因此，要想實(shí)現(xiàn)從非可再生能源向生物質(zhì)能源的可行性轉(zhuǎn)化，尋找廉價(jià)、豐富的原料成為了當(dāng)務(wù)之急。

光合微藻以其獨(dú)特的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)受到廣泛關(guān)注，因?yàn)樗哂泄夂闲矢?、生長(zhǎng)繁殖快、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)和不占用耕地等優(yōu)勢(shì)[4]，同時(shí)，這些優(yōu)點(diǎn)還造就了其在除了生物能源生產(chǎn)以外的其他領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值，如污水凈化、高附加值食品及藥品的提取和作為水產(chǎn)餌料等等[5]。有研究指出，相同單位面積微藻的產(chǎn)油量高于高等植物的產(chǎn)油量，具有良好的開發(fā)價(jià)值[6]，因此，微藻也被認(rèn)為是產(chǎn)生三?；视?TAG)最有希望和最環(huán)保的來源之一，成為了眾多研究者的研究目標(biāo)[7]。然而，由于用大規(guī)模培養(yǎng)藻類來生產(chǎn)生物柴油的方法比較昂貴，導(dǎo)致以生物柴油取代化石燃料的大規(guī)模生產(chǎn)在經(jīng)濟(jì)上難以實(shí)現(xiàn)[8]。因此，基于降低成本的原則，研究人員嘗試過許多方案，如篩選脂質(zhì)含量高的藻類、用合適的廢水培養(yǎng)藻類，或者利用其他各種各樣的條件，以達(dá)到增強(qiáng)藻類脂質(zhì)積累的目的[9]。

水楊酸(salicylic acid，SA)是植物體內(nèi)普遍存在的小分子酚類化合物，在逆境條件下會(huì)在植物體內(nèi)積累，提高植物對(duì)抗逆境的能力[10]。 SA還可以調(diào)節(jié)藻類多種生理代謝功能[11]，如外源添加SA能夠緩解海帶葉片的氧化損傷[12]，雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)經(jīng)SA誘導(dǎo)后提高了類胡蘿卜素相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)了蝦青素的積累[13]，SA還能夠增加?xùn)旁?Scenedesmus)細(xì)胞中的ATP水平[14]。擬微綠球藻(Phaeodactylumt-r-i-c-o-r-n-u-t-u-m)和三角褐指藻(Nannochloropsismaritime)均為單細(xì)胞的經(jīng)濟(jì)型海洋微藻，且都已完成測(cè)序。除了生長(zhǎng)周期短和繁殖速度快等特點(diǎn)，最重要的是具有較高的油脂含量，總脂含量分別占細(xì)胞干質(zhì)量的31%～68%和20%～30%[15],可作為生產(chǎn)生物柴油的潛在來源。

本文中，筆者研究不同濃度SA對(duì)擬微綠球藻和三角褐指藻生長(zhǎng)和油脂積累的影響，以期為提高藻細(xì)胞內(nèi)油脂含量的生產(chǎn)實(shí)踐提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻類的培養(yǎng)

擬微綠球藻和三角褐指藻為遼寧師范大學(xué)藻類研究室保存藻種，均用滅菌的f/2培養(yǎng)基在3 L的三角瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為(23±1)℃，光強(qiáng)為40 μmol/(m2·s)，光暗比12 h∶ 12 h，每天早晚各手搖1次，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后在超凈工作臺(tái)下進(jìn)行分裝，每個(gè)100 mL三角瓶中加入65 mL藻液，用于加入SA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 水楊酸處理

水楊酸SA購自美國(guó)Sigma公司。實(shí)驗(yàn)共設(shè)3組，分別設(shè)置不同的濃度梯度加入擬微綠球藻和三角褐指藻中。其中，擬微綠球藻的處理質(zhì)量濃度為4、8和12 μg/mL，三角褐指藻的處理質(zhì)量濃度為2.5、10和40 μg/mL。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)重復(fù)及無SA處理的藻液為空白對(duì)照。

1.3 藻類生長(zhǎng)及光化學(xué)活性的測(cè)量

加入SA后，每隔兩天在超凈工作臺(tái)下取出2 mL藻液，黑暗處理30 min，使藻細(xì)胞完全適應(yīng)黑暗，用Multi-Color PAM(Heinz-Walz,德國(guó))測(cè)量實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度(Ft)、光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)的實(shí)際光合效率(YⅡ)、調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)額YNPQ等各項(xiàng)光化學(xué)活性指標(biāo)。

藻類生長(zhǎng)的測(cè)量采用Ft值，通過建立的Ft值與藻細(xì)胞數(shù)之間的回歸方程計(jì)算出藻細(xì)胞數(shù)，再進(jìn)行比較。

1.4 油脂含量的測(cè)定

油脂含量測(cè)定采用尼羅紅染色法。具體方法為：藻細(xì)胞經(jīng)SA誘導(dǎo)15 d后，取2 mL藻液，5 000 r/min離心5 min去除培養(yǎng)基，加入等體積20%的二甲基亞砜(DMSO)溶液，40 ℃水浴20 min，加入尼羅紅染液使其終質(zhì)量濃度為1 μg/mL，暗處理20 min。未經(jīng)SA處理的藻細(xì)胞作為對(duì)照，利用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為530 nm，測(cè)定其在波長(zhǎng)580 nm處的熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與討論

2.1 SA對(duì)2種藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

分別采用Multi-Color PAM及細(xì)胞計(jì)數(shù)方法測(cè)定2種藻細(xì)胞的Ft值及對(duì)應(yīng)的藻細(xì)胞數(shù)，建立Ft值與兩種藻細(xì)胞數(shù)的相關(guān)曲線分別為：y=556x-179.34，R2=0.992 6(擬微綠球藻)；y=216.01x-28.69，R2=0.996 8(三角褐指藻)。

圖1為SA對(duì)2種藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響結(jié)果。由圖1(a)可知：擬微綠球藻經(jīng)SA誘導(dǎo)3 d后，各濃度處理組與對(duì)照組的細(xì)胞數(shù)基本相同，誘導(dǎo)6天后，除4 μg/mL處理組略高于對(duì)照組外，8及12 μg/mL處理組仍與對(duì)照組基本相同。第9天之后，4 μg/mL處理組仍然高于對(duì)照組，而12 μg/mL處理組開始低于對(duì)照組；在誘導(dǎo)第12天之后，8 μg/mL處理組的細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組仍然無顯著差異，而4 μg/mL的處理組比對(duì)照組增加了8.29%，12 μg/mL處理組比對(duì)照組減少了5.70%(P<0.05)。

由圖1(b)可知：當(dāng)SA的質(zhì)量濃度低于2.5 μg/mL，三角褐指藻的生長(zhǎng)與對(duì)照組相比沒有變化，在2.5～40 μg/mL的處理范圍內(nèi),SA對(duì)三角褐指藻的生長(zhǎng)均具有抑制作用，且SA濃度越高，抑制作用越明顯。誘導(dǎo)12 d后，經(jīng)不同質(zhì)量濃度SA(2.5、10和40 μg/mL)處理后的三角褐指藻的細(xì)胞數(shù)分別比對(duì)照組下降了8.51%、22.87%和40.43%(P<0.05)。

圖1 不同質(zhì)量濃度SA對(duì)擬微綠球藻和三角褐指藻藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of different SA concentrations on the growth of N. maritime and P. tricornutum

SA是普遍存在于植物體內(nèi)的酚酸類物質(zhì)之一，作為一類重要的化感物質(zhì)，SA直接或間接地影響植物的代謝及對(duì)逆境脅迫的調(diào)控過程，但外源施加SA對(duì)植物代謝的影響還沒有統(tǒng)一的規(guī)律，其作用模式依賴于作用植物的種類、SA的作用濃度及環(huán)境因子(如，光和溫度等)。如，SA可以促進(jìn)小麥的種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)，促進(jìn)大豆幼芽及根的生長(zhǎng)；SA既會(huì)促進(jìn)小球藻的生長(zhǎng)[16]，也會(huì)有效抑制銅綠微囊藻的生長(zhǎng)[17]。本研究中發(fā)現(xiàn)，4 μg/mL的SA處理會(huì)對(duì)擬微綠球藻具有顯著的促進(jìn)作用，但當(dāng)SA質(zhì)量濃度達(dá)到12 μg/mL時(shí)會(huì)抑制擬微綠球藻的生長(zhǎng)，這一低促高抑的結(jié)果與SA對(duì)水華魚腥藻[18]的作用模式一致。而在2.5～40 μg/mL范圍內(nèi)，SA能夠抑制三角褐指藻的生長(zhǎng)，濃度越大抑制作用越明顯。

2.2 SA對(duì)2種藻YⅡ值的影響

圖2為不同濃度SA對(duì)擬微綠球藻和三角褐指藻的YⅡ值的影響結(jié)果。由圖2(a)可知：誘導(dǎo)前6天，SA處理組的YⅡ值與對(duì)照組相比，無明顯變化。誘導(dǎo)9 d之后，12 μg/mL處理組的YⅡ值開始高于對(duì)照組，直至誘導(dǎo)第12天后，12 μg/mL處理組明顯高于對(duì)照組，比對(duì)照組增加了20.54%(P<0.05)，而4 μg/mL處理組和8 μg/mL處理組均未出現(xiàn)顯著性差異。

由圖2(b)可知：40 μg/mL的SA對(duì)三角褐指藻的Y Ⅱ 值具有顯著的抑制作用(P<0.05)。SA誘導(dǎo)3 d后，40 μg/mL處理組的Y Ⅱ 值開始顯著低于對(duì)照組，直至誘導(dǎo)12 d后，40 μg/mL處理組的Y Ⅱ 值比對(duì)照組降低了15.93%，而2.5 和20 μg/mL處理組的無顯著性差異。

SA對(duì)光合作用的影響對(duì)不同植物反應(yīng)也不盡相同。如SA雖然能夠促進(jìn)大豆幼芽和根的生長(zhǎng)，但是其對(duì)大豆的光合作用卻沒有影響，而SA對(duì)印度芥茉[19]的光合作用有顯著的影響。SA在高等植物中促進(jìn)光合作用的提高很可能是通過促進(jìn)氣孔開張及光合碳同化相關(guān)酶的活性來起作用的，也有報(bào)道表明，SA的處理會(huì)顯著提高植物葉綠素的含量、光合電子傳遞效率(ETR)及PSⅡ調(diào)節(jié)性能量耗散(NPQ)，YNPQ[16，19]。但對(duì)于SA的處理對(duì)藻類光合作用的影響還鮮有報(bào)道。本研究中發(fā)現(xiàn)，SA的處理(12 μg/mL SA)使擬微綠球藻的光合效率提高了20.54%，其光合電子傳遞效率也提高了20.69%，且YNPQ的值無顯著變化，因此，SA促進(jìn)擬微綠球藻的光合效率的提高可能是通過提高PSⅡ的電子傳遞效率來實(shí)現(xiàn)的。另外，在本研究中也發(fā)現(xiàn)，40 μg/mL SA的處理降低了三角褐指藻的光合效率，而SA對(duì)三角褐指藻的光合電子傳遞效率沒有顯著影響(數(shù)據(jù)未顯示)，但其YNPQ顯著提高(數(shù)據(jù)未顯示)，因此YNPQ的提高是高濃度的SA對(duì)三角褐指藻光合效率產(chǎn)生抑制的主要原因。

圖2 不同濃度SA對(duì)擬微綠藻和三角褐指藻的YⅡ值的影響Fig.2 Effects of different SA concentrations on the YⅡ of N. maritime and P. tricornutum

2.3 SA對(duì)2種藻油脂積累的影響

圖3為SA對(duì)2種藻油脂積累的影響結(jié)果。由圖3可知：經(jīng)過不同濃度的SA處理后，擬微綠球藻和三角褐指藻的油脂積累都發(fā)生了一定的變化。在擬微綠球藻中，8 μg/mL組和12 μg/mL組的油脂含量均明顯高于對(duì)照組，比對(duì)照組分別增加了23.21%和45.87%(P<0.05)，而4 μg/mL組則無明顯變化。

圖3 不同濃度SA對(duì)擬微綠球藻和三角褐指藻油脂積累的影響Fig.3 Effects of different SA concentrations on the lipid accumulation of N. maritime and P. tricornutum

三角褐指藻經(jīng)SA誘導(dǎo)后，2.5 μg/mL組和10 μg/mL組的油脂含量與對(duì)照組相比均無顯著差異，而40 μg/mL組的油脂含量比對(duì)照組增加了87.48%，有顯著的促進(jìn)作用(P<0.05)。

目前，植物激素及其類似物已經(jīng)在幾種微藻中發(fā)現(xiàn)，盡管對(duì)其功能還知之甚少，但這些分子的外源添加會(huì)對(duì)藻類代謝產(chǎn)生影響。例如，在促進(jìn)藻類脂質(zhì)的積累方面，適當(dāng)濃度的黃腐酸會(huì)促進(jìn)單針藻的生長(zhǎng)及油脂含量積累[20]，適當(dāng)濃度的吲哚-3-乙酸(IAA)誘導(dǎo)小球藻2 d和8 d后均能促進(jìn)小球藻的油脂積累[21]，而適當(dāng)濃度的水楊酸僅能夠促進(jìn)淡水小球藻中的油脂積累[22]。除了促進(jìn)總脂含量的積累，SA還能夠改變脂肪酸的組成結(jié)構(gòu)，如經(jīng)SA處理的梨葉在感染輪文菌后，不飽和脂肪酸含量上升，而飽和脂肪酸含量下降[23]。亞麻經(jīng)SA預(yù)浸泡后，增加了亞麻酸的比例，減少了棕櫚酸的比例[24]。低溫下施用 SA 還可以顯著提高黃瓜幼苗根系脂肪酸的不飽和程度[25]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)濃度的水楊酸處理能夠促進(jìn)擬微綠球藻及三角褐指藻細(xì)胞中中性油脂的積累，但對(duì)藻細(xì)胞中脂肪酸結(jié)構(gòu)的影響還有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

研究了外源添加SA會(huì)對(duì)擬微綠球藻和三角褐指藻的生長(zhǎng)、光化學(xué)活性及油脂積累的影響。研究發(fā)現(xiàn)SA對(duì)于不同藻類的作用效果不盡相同。SA對(duì)擬微綠球藻的生長(zhǎng)具有低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的作用，而對(duì)三角褐指藻的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用；SA顯著提高了擬微綠球藻的光合效率，對(duì)三角褐指藻的光合效率卻有顯著的抑制作用。在油脂積累方面，適當(dāng)濃度的SA對(duì)擬微綠球藻和三角褐指藻的油脂積累都具有顯著促進(jìn)作用，為生物柴油的生產(chǎn)提供了切實(shí)可行的方法。