跨膜蛋白39A基因SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測方法的建立及評價

李向茸，王興隴，2，李 倩，2，馬瑞仙，2，張海霞，李瓊毅，2，馬忠仁，馮若飛，*

(1．西北民族大學生物醫(yī)學研究中心，甘肅蘭州730030;2．西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730030)

跨膜蛋白39A(Transmembrane protein 39A，TMEM39A)是一種多通道膜蛋白，與跨膜蛋白39B同屬于跨膜蛋白39家族，這2種亞型由可變剪接形成［1］。跨膜蛋白鑲嵌于細胞膜兩端，它作為通道或裝運碼頭來支配相關分子在生物膜上的運輸或進入，也可將產(chǎn)生的副產(chǎn)品運出細胞［2］。Park 等［3］的研究表明，TMEM39A 的 mRNA含量在膠質(zhì)瘤組織和細胞樣本中明顯上調(diào)，推測TMEM39A可能作為一種新的診斷標志物和治療靶點在神經(jīng)膠質(zhì)瘤和其他癌癥的治療中發(fā)揮作用。針對TMEM39A的深入研究可以為臨床治療某些自身免疫疾病、腫瘤和癌癥等提供新思路。目前，針對TMEM39A的檢測方法國內(nèi)外均無相關報道，本研究建立了 TMEM39A基因的SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測方法，為進一步研究TMEM39A的生物學功能及與其他蛋白的相互作用奠定了一定的基礎，同時在臨床上也為與TMEM39A相關的某些疾病的預防及治療提供了一種快速檢測和定量分析技術。

1 材料與方法

1．1 細胞、菌株及質(zhì)粒

人皮膚鱗癌細胞(A431)、敘利亞倉鼠腎細胞(BHK-21)、中國倉鼠卵巢細胞(CHO-K1)、大鼠腦膠質(zhì)瘤細胞(C6)、小鼠成肌細胞(C2C12)、甘加羊腎細胞(GJY)、人胚腎細胞(HEK293)、人宮頸癌細胞(HeLa)、粉紋夜蛾卵巢細胞(Hi-5)、河曲馬睪丸細胞(HQM)、人肝癌細胞(HuH-7)、牛腎細胞(MDBK)、犬腎細胞(MDCK)、人胚肺成纖維細胞(MRC-5)、豬腎細胞(PK15)、草地夜蛾卵巢細胞(Sf9)、豬睪丸細胞(ST)、非洲綠猴腎細胞(Vero)均由甘肅省動物細胞工程技術研究中心提供;大腸埃希菌(Escherichia coli)BL21感受態(tài)細胞購自生工生物工程(上海)有限公司;pMD18-T載體購自寶生物工程(大連)有限公司;pMD18-T-TMEM39B、 pMD18-T-TMEM43 及pMD18-T-IFITM2克隆載體均由生物工程與技術國家民委重點實驗室提供。

1．2 主要試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自蘭州百靈生物技術有限公司;胎牛血清購自蘭州民海生物工程有限公司;細胞總RNA提取試劑盒、M-MLV及質(zhì)粒小提試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司;DNA凝膠回收試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司;Xho I內(nèi)切酶、Not I內(nèi)切酶及LA Taq聚合酶均購自寶生物工程(大連)有限公司;SYBRSelect Master Mix購自美國 ThermoFisher Scientific公司。

1．3 引物設計與合成

根據(jù) GenBank中的 TMEM39A基因序列(BC021277.2)，利用 Primer Premier 5.0設計 1對擴增TMEM39A全長開放閱讀框(ORF)的常規(guī)PCR引物和1對熒光定量通用性引物，選取不同種屬TMEM39A基因的保守區(qū)域設計熒光定量引物，由寶生物工程(大連)有限公司合成(表1)。

1．4 TMEM39A質(zhì)粒標準品的制備

提取HEK293細胞總RNA，采用兩步法反轉錄合成cDNA。以此cDNA為模板，用常規(guī)PCR引物進行PCR，擴增全長TMEM39A基因片段。PCR反應條件為:94℃ 5 min;94℃ 30 s，59℃60 s，72 ℃ 2 min，35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化PCR產(chǎn)物，將其克隆于pMD18-T載體上，構建重組克隆質(zhì)粒pMD18-T-TMEM39A。進行酶切和測序鑒定，測定重組質(zhì)粒的濃度，計算每μL質(zhì)粒含有的拷貝數(shù)，將該質(zhì)粒標準品命名為TMEM39A-Standard。

表1 引物序列Table 1 Nucleotide sequences of the primers

1．5 TMEM39A熒光定量 PCR方法的建立及優(yōu)化

采用SYBR GreenⅠ染料法，利用合成的熒光定量PCR通用性引物TMEM39A qF/R，在ABI熒光定量PCR儀上進行擴增和結果分析。以Ct值最小和熒光值最高及溶解曲線不出現(xiàn)非特異性擴增產(chǎn)物為標準，分別對引物濃度(5、10、15、20 μmol·L－1)、退火溫度(55、56、57、58、59、60、61、62℃)等條件進行優(yōu)化，建立TMEM39A基因的熒光定量PCR反應。

1．6 標準曲線的繪制

將TMEM39A-Standard進行10倍倍比稀釋，分別取 3.937 ×108、3.937 ×107、3.937 ×106、3.937 ×105、3.937 ×104、3.937 ×103拷貝·μL－16個濃度梯度的質(zhì)粒作為模板，依照上述優(yōu)化的TMEM39A SYBR GreenⅠ熒光定量PCR反應條件進行擴增。以相應拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標，Ct值為縱坐標繪制標準曲線。待熒光定量PCR的反應結束后，繼續(xù)對反應產(chǎn)物進行加熱，溫度升高至95℃，反應15 s，接著溫度降低至65℃，反應1 min，DNA雙鏈復性，熒光分子綁定在DNA雙鏈上，所以熒光信號值到達最高點。從65℃緩慢升溫至95℃，持續(xù)記錄此時的熒光信號變化量，然后以溫度作為橫坐標，單位時間內(nèi)熒光信號的變化量為縱坐標繪制溶解曲線。如果溶解峰是單一的，表示產(chǎn)物擴增特異;反之，則意味有非特異性擴增。

1．7 特異性試驗

分別以本實驗室構建的質(zhì)粒濃度均為3.937×107拷貝·μL－1的其他3種跨膜蛋白陽性克隆載體 pMD18-T-TMEM39B、 pMD18-T-TMEM43、pMD18-T-IFITM2及TMEM39A-Standard為模板，采用上述反應體系和條件，分別進行熒光定量PCR，檢測該方法的特異性。

1．8 敏感性試驗

取3.937×108～3.937×101拷貝·μL－18個濃度梯度的TMEM39A-Standard分別作為模板，進行熒光定量PCR，以確定本方法的檢測下限。同時采用常規(guī)PCR方法進行檢測［12］，比較2種方法的敏感性。

1．9 重復性試驗

隨機選取3個濃度(3.937×107、3.937×106、3.937×103拷貝·μL－1)的 TMEM39A-Standard分別作為模板，進行熒光定量PCR。組內(nèi)和組間試驗各做3次重復，評價本方法的重復性。

1．10 不同種屬細胞樣品檢測

分別提取人源、豬源、猴源、鼠源、犬源、羊源、馬源、牛源及昆蟲細胞等18種不同細胞的總RNA，反轉錄后利用上述建立并優(yōu)化的TMEM39A SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法進行檢測，分析試驗結果。

2 結果與分析

2．1 TMEM39A質(zhì)粒標準品的制備與鑒定

TMEM39A基因擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在1.5 kb處可見一條特異性條帶，大小與預期一致(圖1-A)。重組質(zhì)粒pMD18-TTMEM39A經(jīng)XhoⅠ、NotⅠ雙酶切后，出現(xiàn)2條清晰的條帶，約為2.6 kb和1.5 kb，與預期相符(圖1中B)。測序結果與BC021277.2參考序列進行比對，核苷酸和氨基酸序列同源性分別為99.9%和99.8%，為特異性目的序列，表明TMEM39AStandard質(zhì)粒標準品構建成功。測得該質(zhì)粒濃度為650 ng·μL－1，根據(jù)拷貝數(shù)計算公式得出對應的拷貝數(shù)為3.937 ×1011拷貝·μL－1。

2．2 SYBR GreenⅠ熒光定量PCR反應條件的優(yōu)化

經(jīng)條件優(yōu)化最終確定的SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR反應體系為:SYBRSelect Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，TMEM39A qF/R(10 μmol·L－1)各 1.0 μL，模板 2.0 μL。反應條件為:95℃ 30 s;95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40次循環(huán)。根據(jù)擴增曲線得出最佳的引物使用濃度為10 μmol·L－1，最佳退火溫度為 58 ℃。

2．3 標準曲線的繪制

圖1 TMEM39A基因PCR擴增(A)及重組質(zhì)粒pMD18-T-TMEM39A的酶切鑒定(B)Fig．1 Identification of TMEM39A gene and its recombinant plasmid pMD18-T-TMEM39A

將TMEM39A-Standard進行倍比稀釋后，取6個濃度梯度進行熒光定量PCR。標準曲線方程Y= －3.564logX+45.706，相關系數(shù)(r)為0.999，在3.937×108～3.937×103之間Ct值與質(zhì)粒濃度呈現(xiàn)良好的線性關系(圖2-A)，且擴增效率為90.813%，滿足要求(r＞0.99，110＞Eff% ＞90)，表明標準曲線建立成功。在溶解溫度為(80±1)℃處出現(xiàn)單一的特異性峰，無非特異性擴增及引物二聚體出現(xiàn)(圖2-B)。

2．4 特異性

分別以本課題組構建的 pMD18-TTMEM39B、pMD18-T-TMEM43、pMD18-T-IFITM2及TMEM39A-Standard為模板，采用本研究建立的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法進行擴增，結果顯示，除TMEM39A-Standard能夠出現(xiàn)特異性擴增外，其他跨膜蛋白均不產(chǎn)生擴增。表明該方法特異性較好(圖3)。

2．5 靈敏度

分別以 3.937 ×108、3.937×107、3.937 ×106、3.937 × 105、3.937 × 104、3.937 × 103、3.937×102、3.937×101拷貝·μL－18個濃度梯度的TMEM39A-Standard作為模板，進行熒光定量PCR以及常規(guī)PCR擴增，比較2種方法的檢測下限。本方法能檢出的最低模板濃度為3.937×102拷貝·μL－1(圖4-A)，而普通PCR方法的檢測下限為3.937×104拷貝·μL－1(圖4-B)，表明本方法的敏感性較高，比常規(guī) PCR靈敏度高100倍左右。

2．6 重復性

圖2 SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR標準曲線(A)和熔解曲線(B)Fig．2 The standard curve(A)and melting curve(B)of SYBR Green Ⅰ real-time PCR amplification for TMEM39A gene

圖3 引物TMEM39A qF/R的SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR特異性Fig．3 Specificity of primers TMEM39A qF/R by SYBR GreenⅠreal-time PCR amplification

以3個濃度梯度的TMEM39A-Standard進行3次組內(nèi)及3次組間重復測定，由統(tǒng)計分析結果可知，其組內(nèi)變異系數(shù)為0.121% ～0.169%，組間變異系數(shù)為0.285% ～0.950%，均小于1.0%(表 2)，表明本研究建立的 TMEM39A SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測方法具有良好的重復性和穩(wěn)定性。

2．7 不同種屬細胞樣品檢測

以本研究建立的SYBR GreenⅠ實時熒光定量 PCR 方法對 HEK293、C6、ST、MDCK、MRC-5、HeLa、BHK-21、MDBK、SF9、HuH-7、Vero、CHOK1、GJY、Hi-5、A431、PK15、C2C12、HQM 細胞的cDNA進行檢測。結果顯示，不同種屬的細胞樣品中均能檢測到TMEM39A基因，但含量不同，HeLa細胞中的 TMEM39A含量最高，其次為HEK293細胞，HQM細胞中TMEM39A基因含量最少(圖5)，表明該方法可用于不同種屬樣品細胞中TMEM39A基因的檢測。

圖4 引物TMEM39A qF/R的SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR與常規(guī)PCR靈敏性試驗Fig．4 Sensitivity detection of primers TMEM39A qF/R by using series plasmid dilutions with real-time PCR and PCR

3 討論

目前，有關TMEM39A基因的研究較少，僅發(fā)現(xiàn)其在某些自身免疫疾病、腫瘤和癌癥的治療中發(fā)揮作用［4－11］，而且國內(nèi)外針對 TMEM39A 的檢測方法尚處空白。基于此，快速、準確檢測TMEM39A在細胞或者組織中的含量變化對于某些自身免疫疾病、腫瘤和癌癥等的診斷及治療尤為重要。通過基因序列比對發(fā)現(xiàn)，不同物種TMEM39A基因同源性為90% ～97%，針對不同物種TMEM39A基因的保守區(qū)域設計熒光定量引物，可以提高種屬通用性。

表2 SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR的組內(nèi)、組間重復性實驗Table 2 Inter-assay and intra-assay reproducibility of SYBR GreenⅠreal-time PCR

圖5 不同種屬細胞的TMEM39A熒光定量PCR檢測Fig．5 Different species of cells detection by the established TMEM39A real-time PCR assay

本實驗成功建立了TMEM39A基因的SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測方法。此方法經(jīng)過條件優(yōu)化后，特異性較好，僅TMEM39A-Standard能夠出現(xiàn)特異性擴增，跨膜蛋白39B基因(TMEM39B)、跨膜蛋白43基因(TMEM43)及干擾素誘導的跨膜蛋白2基因(IFITM2)的陽性克隆載體均不產(chǎn)生擴增;靈敏性可達3.937×102拷貝·μL－1，是常規(guī) PCR方法靈敏度的100倍左右;組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于1%，具有較高的重復性和穩(wěn)定性;可以檢測不同種屬來源細胞中的TMEM39A基因含量，具有種屬通用性。但不同種屬來源細胞中TMEM39A基因的表達水平不同，其中，腫瘤細胞(A431、HuH-7及 HeLa)中TMEM39A基因均呈高水平表達。有研究表明，TMEM39可能參與Parkin介導的線粒體自噬［12］，線粒體自噬和線粒體被認為是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要調(diào)控因子［13－15］。鑒于 TMEM39A 與腫瘤細胞的相關性，自噬可能成為TMEM39A進一步研究的方向［16］。該方法的建立為臨床提供了一種TMEM39A的快速檢測和定量分析技術，并為進一步研究TMEM39A功能奠定了基礎。