• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    黑芝菌發(fā)酵產(chǎn)生胞外多糖的工藝優(yōu)化及其抗氧化活性

    2018-12-04 03:38:08王儲(chǔ)炎程俊文
    關(guān)鍵詞:酵母粉胞外氮源

    王儲(chǔ)炎,程俊文,祝 超

    (1.合肥學(xué)院生物與環(huán)境工程系,安徽合肥230601;2.浙江省林業(yè)科學(xué)研究院,浙江 杭州310023;3.浙江省森林食品研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江杭州310023)

    黑芝(Fructificatio amaurodermatis Rudae)屬真菌門、擔(dān)子菌亞門、層菌綱、非褶菌目、靈芝科、靈芝屬高等真菌,分布于福建、廣東、湖南、浙江、廣西、云南、西藏等地野外林中地上和地下的腐木上[1-2]。黑芝表面紫黑色至近黑色或紫褐色,菌蓋呈近圓形、半圓形或近小馬蹄形,菌柄側(cè)生或背側(cè)生,形狀為圓柱形或近念珠狀,直徑大小不一、粗細(xì)不等[3-5]?!渡褶r(nóng)本草經(jīng)》上把黑芝列為上品,認(rèn)為黑芝“味咸平,主耳聾,利關(guān)節(jié),益腎氣,通九竅,聰察,久食輕身不老延年仙”。中醫(yī)認(rèn)為,黑芝具有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、扶正固本、延年益壽、增強(qiáng)免疫力等功效。江西黑芝含有人體所需要的微量元素鐵、鋅、銅、錳等,而且能夠清除DPPH自由基,具有較強(qiáng)抗氧化活性,其抗氧化能力強(qiáng)于赤芝[6-10]。

    目前,關(guān)于黑芝的研究主要集中在發(fā)酵工藝方面,廖偉等[5]開展了黑芝菌菌絲體液體培養(yǎng)基的優(yōu)化研究,唐興國等[2]選用了果糖、蔗糖和乳糖作為碳源,探討了黑芝菌絲體發(fā)酵中不同水平的無機(jī)鹽與碳源之間的交互作用,葉明等[11]研究了黑芝多糖的提取工藝條件,廖婷婷等[12]研究了不同發(fā)酵時(shí)間、pH值和基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)黑芝菌絲體液態(tài)發(fā)酵的影響。利用黑芝菌發(fā)酵產(chǎn)生胞外多糖的發(fā)酵工藝研究尚未有報(bào)道。本研究以野生黑芝菌作為供試菌種,通過液體發(fā)酵技術(shù)來生產(chǎn)胞外多糖,采用響應(yīng)面法來優(yōu)化其發(fā)酵條件,并對(duì)胞外多糖的抗氧化活性進(jìn)行探究,從而為黑芝菌液體發(fā)酵胞外多糖以及多糖的開發(fā)利用提供依據(jù)和參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    菌種從浙江省野外黑芝中分離純化而得,經(jīng)鑒定為黑芝菌(Fructificatio amaurodermatis Rudae),菌種編號(hào)FA003,目前保存于浙江省林業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所。

    斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯 200 g·L-1,葡萄糖 15 g·L-1,瓊脂15 ~20 g·L-1,自然 pH。

    種子培養(yǎng)基:馬鈴薯 100 g·L-1,葡萄糖 15 g·L-1,酵母粉 5 g·L-1,KH2PO41 g·L-1,MgSO40.5 g·L-1。

    搖瓶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基:葡萄糖20 g·L-1,酵母粉 5 g·L-1,KH2PO41 g·L-1,MgSO40.5 g·L-1。

    玉米粉、小麥粉、豆餅粉、麥麩來自上海三豐糧油有限公司。酵母粉、蛋白胨、牛肉浸膏購自武漢華辰生物技術(shù)有限公司。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)來自美國Sigma公司。葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、苯酚、濃硫酸、乙醇、水楊酸、FeSO4、維生素C均為分析純。馬鈴薯市售。

    1.2 儀器與設(shè)備

    ZHWY-211B搖床發(fā)酵箱,上海智城分析儀器制造有限公司;752PC紫外可見分光光度計(jì),上海光譜儀器有限公司;YXQ-LS-75SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器,上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;GZX-9140 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱,上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;Anke DL-4000B冷凍離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 菌種培養(yǎng)

    參照文獻(xiàn)[13-14]的方法,先從母種試管中切出蠶豆?fàn)畹木z塊,接種在斜面培養(yǎng)基,置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d;然后從活化的斜面菌種中取種接于液體培養(yǎng)基,25℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d;最后在三角瓶中裝入搖瓶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)液150 mL,按照10%的比例接入液體培養(yǎng)菌種,25 ℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)。

    1.3.2 胞外多糖含量測(cè)定

    收集深層發(fā)酵培養(yǎng)液,3 000 r·min-1離心15 min,將上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,加入3~4倍體積的75%乙醇進(jìn)行醇析,4℃冰箱醇沉24 h,4 000 r·min-1離心15 min 得到沉淀物,60 ℃烘干至恒質(zhì)量,即得胞外多糖(extracellular polysaccharides,EPS),然后采用苯酚硫酸法測(cè)定其含量[15]。

    1.3.3 單因素試驗(yàn)

    碳源試驗(yàn):以蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、小麥粉、玉米粉分別取代搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖,按1.3.1節(jié)方法進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)7 d,選擇產(chǎn)生多糖含量最高的碳源開展10、15、20、25、30 g·L-1共5 個(gè)濃度的碳源梯度試驗(yàn),檢測(cè)胞外多糖的含量。

    氮源試驗(yàn):以酵母粉、豆餅粉、麥麩、蛋白胨、牛肉浸膏,分別取代搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中的酵母粉,按1.3.1節(jié)方法進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)7 d,選擇產(chǎn)生多糖含量最高的氮源開展 2、4、8、12、16 g·L-1共5個(gè)濃度的氮源梯度試驗(yàn),檢測(cè)胞外多糖的含量。

    發(fā)酵時(shí)間試驗(yàn):采用含20 g·L-1最高碳源和5 g·L-1最高氮源的搖瓶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基,按照1.3.1 節(jié)方法,培養(yǎng)2、3、4、5、6、7、8 d,適時(shí)取樣檢測(cè)胞外多糖的含量。

    1.3.4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

    在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,選擇蔗糖、酵母粉、發(fā)酵時(shí)間3個(gè)因素,運(yùn)用Box-Behnken中心組合進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì),利用Design Expert 8.05軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析[16-18]。各試驗(yàn)因素及水平編碼表見表1。

    1.3.5 胞外多糖抗氧化活性測(cè)定

    DPPH自由基清除能力的測(cè)定:參照Nsimba等[19]、張娜等[20]的方法,在波長(zhǎng) 517 nm 處測(cè)定多糖溶液的吸光度,計(jì)算DPPH清除率。

    式中:D1為多糖溶液的吸光度;D0為蒸餾水的吸光度。

    ·OH自由基清除能力的測(cè)定:參照WANG等[21]、徐懷德等[22]的方法,反應(yīng)體系中含 1.0 mL 8.8 mmol·L-1H2O2、1.0 mL 9.0 mmol·L-1FeSO4、1.0 mL 9.0 mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液和1.0 mL不同濃度的多糖溶液。加H2O2啟動(dòng)反應(yīng),37℃反應(yīng)30 min,以蒸餾水為參比,在510 nm下測(cè)定吸光度??紤]到樣品本身吸光值,以1.0 mL 9.0 mmol·L-1FeSO4、1.0 mL 9.0 mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液、1.0 mL不同濃度多糖溶液和1.0 mL蒸餾水作為樣品的本底吸收值,計(jì)算樣品對(duì)·OH 的清除率[23]。

    表1 試驗(yàn)因素及水平編碼表Table 1 Experimental factors and horizontal code

    其中:D0為空白對(duì)照吸光度;Dx為加入樣品溶液后吸光度;Dx0為不加顯色劑H2O2樣品溶液本底吸光度。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

    2.1.1 碳源

    從圖1可看出,蔗糖、葡萄糖、小麥粉和玉米粉都是黑芝菌發(fā)酵所需要的優(yōu)質(zhì)碳源,以蔗糖為碳源時(shí),黑芝胞外多糖含量為218.66 mg·L-1,高于其他碳源,故后續(xù)試驗(yàn)選擇蔗糖作為碳源。由圖2可知,多糖含量隨著蔗糖濃度的增加呈先升高后保持穩(wěn)定的趨勢(shì),在蔗糖濃度為20 g·L-1時(shí),黑芝胞外多糖的含量達(dá)到最大值218.78 mg·L-1。

    2.1.2 氮源

    圖1 不同碳源對(duì)液體發(fā)酵胞外多糖的影響Fig.1 Influence of different carbon sources on EPS yield

    圖2 蔗糖濃度對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.2 Influence of sucrose concentrations on EPS yield

    圖3 不同氮源對(duì)液體發(fā)酵胞外多糖的影響Fig.3 Influence of different nitrogen sources on EPS yield

    由圖3可知,酵母粉、蛋白胨和牛肉浸膏都是較好的氮源。以酵母粉作為氮源時(shí),黑芝胞外多糖含量為206.80 mg·L-1,高于蛋白胨以及其他氮源,故后續(xù)試驗(yàn)選擇酵母粉作為氮源。由圖4可知,隨著酵母粉濃度的增加,胞外多糖的積累量也逐漸增加,酵母粉濃度超過8 g·L-1后,多糖的積累量趨于平穩(wěn)。

    2.1.3 發(fā)酵時(shí)間

    由圖5可知,發(fā)酵前期,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),黑芝胞外多糖含量顯著增大,發(fā)酵6 d以后,胞外多糖的產(chǎn)量開始趨于平穩(wěn)。綜合考慮時(shí)間、產(chǎn)出比、影響效率等因素,選取5、6、7 d作為響應(yīng)面試驗(yàn)中發(fā)酵時(shí)間的3個(gè)水平。

    2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

    圖4 酵母粉濃度對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.4 Influence of yeast powder concentrations on EPS yield

    圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.5 Influence of fermentation time on EPS yield

    根據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn),共有17個(gè)試驗(yàn)組合,具體試驗(yàn)結(jié)果見表2。

    表2 黑芝液體發(fā)酵培養(yǎng)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface test results of liquid submerged fermentation

    2.2.1 模型建立和顯著性分析

    利用Design expert軟件對(duì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和多元回歸擬合,建立以EPS為函數(shù)的二次回歸方程,并對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn),結(jié)果見表3。EPS(Y)與蔗糖(X1)、酵母粉(X2)和發(fā)酵時(shí)間(X3)的二次回歸方程為:9.96X3+227.18 。

    從表3可知,本試驗(yàn)所選用回歸模型具有良好的顯著性(P<0.05),失擬項(xiàng) P=0.1013>0.05,表明該模型失擬項(xiàng)不顯著。模型決定系數(shù)R2為0.954 6,表明此模型擬合度較好,校正系數(shù)Adj R2=0.896 2,說明該模型方程能夠解釋89.62%的響應(yīng)值變化,可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析[24],同時(shí)可以運(yùn)用該模型方程進(jìn)行黑芝菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的理論預(yù)測(cè)。另外,X1、X2、X3以及 X21、X22均比較顯著,說明它們對(duì)胞外多糖的合成有顯著影響。

    2.2.2 響應(yīng)面分析

    將模型中蔗糖、酵母粉及發(fā)酵時(shí)間的其中一個(gè)因素固定在0水平,得到另外2個(gè)因素的交互影響結(jié)果(圖6、圖7、圖8)。蔗糖和發(fā)酵時(shí)間的交互作用對(duì)胞外多糖得率影響最為顯著,相比而言,發(fā)酵時(shí)間和酵母粉、蔗糖和酵母粉的交互作用對(duì)胞外多糖得率影響較小,說明酵母粉對(duì)胞外多糖得率的協(xié)同作用不如蔗糖和發(fā)酵時(shí)間。

    2.2.3 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

    通過對(duì)回歸方程進(jìn)行一階偏導(dǎo),得到以下3個(gè)方程:

    表3 響應(yīng)面試驗(yàn)回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model for response surface test

    圖6 蔗糖和酵母粉交互作用對(duì)黑芝胞外多糖含量的影響Fig.6 Influence of sucrose and yeast powder on EPS yield

    圖7 蔗糖和發(fā)酵時(shí)間交互作用對(duì)黑芝胞外多糖含量的影響Fig.7 Influence of sucrose and fermentation time on EPS yield

    圖8 酵母粉和發(fā)酵時(shí)間交互對(duì)黑芝胞外多糖得率的影響Fig.8 Influence of yeast powder and fermentation time on EPS yield

    求解得出最佳培養(yǎng)條件為:蔗糖20.60 g·L-1,酵母粉 11.22 g·L-1,發(fā)酵時(shí)間 6.09 d。在此條件下,胞外多糖產(chǎn)量理論值可達(dá)230.06 mg·L-1??紤]到實(shí)際操作,培養(yǎng)條件調(diào)整為:蔗糖

    20.6 g·L-1,酵母粉 11.2 g·L-1,發(fā)酵時(shí)間 6 d。在此條件下,胞外多糖產(chǎn)量理論值可達(dá)237.35 mg·L-1。通過實(shí)驗(yàn)證實(shí),此時(shí)胞外多糖含量為236.83 mg·L-1,與理論值十分接近,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型符合良好,說明該模型能較好地預(yù)測(cè)黑芝胞外多糖產(chǎn)量。

    2.3 抗氧化活性分析

    由圖9和圖10可知,隨著黑芝胞外多糖濃度的增加,其對(duì)DPPH和羥基自由基的清除能力逐漸增強(qiáng)。多糖濃度為0.5 mg·mL-1時(shí),對(duì)DPPH清除率達(dá)到63.87%,對(duì)羥基自由基清除率達(dá)到67.73%。多糖濃度超過0.5 mg·mL-1后,對(duì)自由基的清除率增加比較緩慢??傮w上,胞外多糖對(duì)DPPH的清除率強(qiáng)于羥基,但低于陽性對(duì)照維生素C(VC)。黑芝胞外多糖的熱穩(wěn)定性高于VC,便于在食品加工中運(yùn)用。

    3 結(jié)論

    圖9 黑芝胞外多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.9 DPPH free radical scavenging ability of EPS

    圖10 黑芝胞外多糖對(duì)羥基自由基的清除能力Fig.10 ·OH free radical scavenging ability of EPS

    采用響應(yīng)面法優(yōu)化黑芝菌液體發(fā)酵產(chǎn)生胞外多糖工藝,結(jié)果表明,適當(dāng)增加碳源和氮源含量,能有效提高多糖含量。優(yōu)化的黑芝菌發(fā)酵產(chǎn)生胞外多糖的工藝參數(shù)為蔗糖20.6 g·L-1,酵母粉11.2 g·L-1,發(fā)酵時(shí)間 7 d。在此條件下,胞外多糖的含量可達(dá)到236.83 mg·L-1。濃度0~0.5 mg·mL-1時(shí),黑芝菌胞外多糖對(duì)DPPH和羥基自由基的清除能力逐漸增強(qiáng)。此研究結(jié)果可為后續(xù)開展黑芝液體發(fā)酵技術(shù)研究提供一定的參考。

    猜你喜歡
    酵母粉胞外氮源
    酵母吹氣球
    硝化顆粒污泥胞外聚合物及信號(hào)分子功能分析
    I Helped Mum:包皓文
    生物膜胞外聚合物研究進(jìn)展
    水華期間藻類分層胞外聚合物與重金屬的相互作用機(jī)制研究
    無機(jī)氮源對(duì)紅曲霉調(diào)控初探
    中國釀造(2016年12期)2016-03-01 03:08:11
    酵母“吹氣球”
    中藥渣生產(chǎn)蛋白飼料的氮源優(yōu)化研究
    中國釀造(2014年9期)2014-03-11 20:21:03
    響應(yīng)面分析法和氮源改進(jìn)優(yōu)化L-賴氨酸發(fā)酵工藝
    動(dòng)物雙歧桿菌RH胞外多糖基因簇的克隆及分析
    一区二区日韩欧美中文字幕 | 人人妻人人澡人人看| xxx大片免费视频| 99久久综合免费| 日韩一区二区三区影片| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲精品国产av蜜桃| 久久av网站| 夜夜爽夜夜爽视频| 精品人妻熟女毛片av久久网站| av.在线天堂| 波多野结衣一区麻豆| 日本与韩国留学比较| 一本色道久久久久久精品综合| 久久久久久伊人网av| 视频中文字幕在线观看| 久热久热在线精品观看| 久久久久国产网址| 免费在线观看黄色视频的| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲国产色片| 日韩欧美一区视频在线观看| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 亚洲精品国产色婷婷电影| xxxhd国产人妻xxx| 国产成人欧美| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产 一区精品| 国产男女内射视频| 亚洲人与动物交配视频| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产一区二区三区av在线| 青春草亚洲视频在线观看| 国产精品嫩草影院av在线观看| av在线app专区| 久久精品人人爽人人爽视色| 又大又黄又爽视频免费| 9191精品国产免费久久| 新久久久久国产一级毛片| 黄色一级大片看看| 亚洲天堂av无毛| 中国国产av一级| 日韩 亚洲 欧美在线| 美女中出高潮动态图| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 精品午夜福利在线看| 国产精品久久久久久av不卡| 精品亚洲成国产av| 久久精品人人爽人人爽视色| 一级毛片 在线播放| 9191精品国产免费久久| 丝袜喷水一区| 永久免费av网站大全| 欧美精品国产亚洲| 欧美xxxx性猛交bbbb| 秋霞伦理黄片| 国产黄频视频在线观看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 久久久久久久久久久免费av| 日日撸夜夜添| 最后的刺客免费高清国语| 老熟女久久久| 亚洲第一区二区三区不卡| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 精品国产国语对白av| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 老司机亚洲免费影院| 日本91视频免费播放| 99精国产麻豆久久婷婷| 99久久中文字幕三级久久日本| 最后的刺客免费高清国语| 极品少妇高潮喷水抽搐| 边亲边吃奶的免费视频| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 如何舔出高潮| 女性生殖器流出的白浆| www.色视频.com| 一二三四中文在线观看免费高清| 婷婷成人精品国产| 女性生殖器流出的白浆| av又黄又爽大尺度在线免费看| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲av欧美aⅴ国产| 日韩三级伦理在线观看| 久久精品夜色国产| a级片在线免费高清观看视频| 精品福利永久在线观看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 秋霞在线观看毛片| 欧美人与善性xxx| 一区在线观看完整版| 久久97久久精品| 久久人人97超碰香蕉20202| 不卡视频在线观看欧美| 99香蕉大伊视频| 国精品久久久久久国模美| 丝袜在线中文字幕| 香蕉丝袜av| 各种免费的搞黄视频| 99久国产av精品国产电影| 日韩视频在线欧美| 国产精品偷伦视频观看了| xxxhd国产人妻xxx| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲内射少妇av| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲,欧美精品.| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| av在线播放精品| av线在线观看网站| av网站免费在线观看视频| 一级a做视频免费观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲综合精品二区| 欧美精品高潮呻吟av久久| 午夜福利网站1000一区二区三区| 青青草视频在线视频观看| 中文字幕制服av| 免费高清在线观看日韩| 国产亚洲欧美精品永久| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 精品少妇黑人巨大在线播放| 最黄视频免费看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 赤兔流量卡办理| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 色视频在线一区二区三区| 内地一区二区视频在线| 欧美精品一区二区大全| 国产综合精华液| 中文字幕制服av| 最近中文字幕2019免费版| xxx大片免费视频| 少妇 在线观看| 午夜福利,免费看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 99九九在线精品视频| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 日本av手机在线免费观看| 亚洲图色成人| 亚洲av国产av综合av卡| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 亚洲精品一区蜜桃| 大话2 男鬼变身卡| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲美女黄色视频免费看| 午夜福利视频精品| 日韩欧美一区视频在线观看| 又大又黄又爽视频免费| 九色亚洲精品在线播放| 国产免费现黄频在线看| 成人国语在线视频| 热re99久久精品国产66热6| 久久久久久久久久久免费av| xxx大片免费视频| 青春草国产在线视频| 大香蕉久久网| 男女高潮啪啪啪动态图| av黄色大香蕉| 久久99蜜桃精品久久| 精品少妇内射三级| 亚洲人成网站在线观看播放| 久久久久久伊人网av| 九色亚洲精品在线播放| 久久精品人人爽人人爽视色| 欧美精品av麻豆av| 免费黄频网站在线观看国产| 69精品国产乱码久久久| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产欧美亚洲国产| √禁漫天堂资源中文www| 黄色 视频免费看| 人体艺术视频欧美日本| 国产综合精华液| 国产在线一区二区三区精| 在线看a的网站| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 丝瓜视频免费看黄片| 交换朋友夫妻互换小说| 午夜福利视频精品| 久久亚洲国产成人精品v| 日韩制服骚丝袜av| 欧美成人午夜精品| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 男女国产视频网站| 亚洲伊人色综图| 制服丝袜香蕉在线| 国精品久久久久久国模美| 日本欧美视频一区| 免费人妻精品一区二区三区视频| 毛片一级片免费看久久久久| 人妻一区二区av| 99热国产这里只有精品6| 在线观看免费高清a一片| 午夜福利视频在线观看免费| 婷婷色综合大香蕉| 2021少妇久久久久久久久久久| 考比视频在线观看| 各种免费的搞黄视频| 欧美3d第一页| a级毛片在线看网站| 午夜福利视频精品| 熟女av电影| 美女国产视频在线观看| 另类精品久久| 22中文网久久字幕| 午夜91福利影院| 午夜免费男女啪啪视频观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 亚洲五月色婷婷综合| 十八禁网站网址无遮挡| 有码 亚洲区| 久久精品久久久久久久性| 日本免费在线观看一区| 亚洲精品av麻豆狂野| 成年动漫av网址| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 深夜精品福利| 午夜激情久久久久久久| 亚洲国产精品国产精品| 2022亚洲国产成人精品| 亚洲av免费高清在线观看| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲精品色激情综合| 蜜桃国产av成人99| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲成人手机| 欧美激情国产日韩精品一区| www.熟女人妻精品国产 | 亚洲综合色网址| 欧美亚洲日本最大视频资源| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 9191精品国产免费久久| 久久久久国产网址| 9色porny在线观看| 日韩一区二区视频免费看| 精品久久久久久电影网| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 久久99蜜桃精品久久| 2021少妇久久久久久久久久久| 国产一区二区三区综合在线观看 | 国产一区二区三区综合在线观看 | 日本黄色日本黄色录像| 亚洲欧洲日产国产| 亚洲第一av免费看| 国产一区二区在线观看日韩| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲精品视频女| 咕卡用的链子| 在线天堂中文资源库| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产高清三级在线| 搡女人真爽免费视频火全软件| 亚洲精品第二区| 亚洲国产精品999| 久久久久视频综合| 国产乱人偷精品视频| 91国产中文字幕| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产在线免费精品| 国产成人av激情在线播放| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 欧美 日韩 精品 国产| 22中文网久久字幕| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| kizo精华| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 国产精品蜜桃在线观看| 一区二区三区精品91| 热99国产精品久久久久久7| 成人免费观看视频高清| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 18禁国产床啪视频网站| 欧美国产精品一级二级三级| 亚洲国产看品久久| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 亚洲国产成人一精品久久久| 日本色播在线视频| 国产精品国产三级国产专区5o| 永久网站在线| 丰满少妇做爰视频| 久久久欧美国产精品| 精品午夜福利在线看| 99久久人妻综合| 18在线观看网站| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲国产日韩一区二区| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产精品国产av在线观看| 99久久中文字幕三级久久日本| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 超色免费av| 亚洲国产精品成人久久小说| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产精品熟女久久久久浪| 国产精品一区二区在线观看99| 国产成人av激情在线播放| 欧美变态另类bdsm刘玥| 免费av中文字幕在线| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲综合色惰| av黄色大香蕉| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 婷婷色综合大香蕉| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 久久99蜜桃精品久久| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产福利在线免费观看视频| 大香蕉97超碰在线| 人体艺术视频欧美日本| 最后的刺客免费高清国语| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 亚洲精品一区蜜桃| 精品一区二区免费观看| 十八禁高潮呻吟视频| 99热国产这里只有精品6| 妹子高潮喷水视频| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 日本黄大片高清| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 久久国产精品大桥未久av| 高清不卡的av网站| 大香蕉久久网| 午夜福利视频精品| 亚洲经典国产精华液单| 大片免费播放器 马上看| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 国产av码专区亚洲av| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 亚洲性久久影院| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲欧美成人精品一区二区| 在线观看国产h片| 久久久欧美国产精品| 多毛熟女@视频| 日韩电影二区| 久久人人爽人人爽人人片va| 久久婷婷青草| 一级毛片电影观看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产精品一区二区在线不卡| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 天堂8中文在线网| a级片在线免费高清观看视频| www.熟女人妻精品国产 | 国产av国产精品国产| 不卡视频在线观看欧美| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产欧美亚洲国产| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲国产日韩一区二区| 国产成人免费无遮挡视频| 久久精品国产亚洲av涩爱| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲,欧美,日韩| 久久热在线av| 国产在线视频一区二区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 国产成人精品久久久久久| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产男女超爽视频在线观看| 亚洲综合精品二区| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 美女国产高潮福利片在线看| 1024视频免费在线观看| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产极品天堂在线| 韩国高清视频一区二区三区| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 热99国产精品久久久久久7| 制服丝袜香蕉在线| 下体分泌物呈黄色| 亚洲精品自拍成人| 啦啦啦啦在线视频资源| 美女主播在线视频| 丝瓜视频免费看黄片| 极品人妻少妇av视频| 亚洲图色成人| 久久久久视频综合| 日韩一区二区视频免费看| 欧美另类一区| 伦精品一区二区三区| 日韩成人av中文字幕在线观看| 捣出白浆h1v1| 亚洲成人手机| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| av不卡在线播放| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 大香蕉97超碰在线| 精品人妻偷拍中文字幕| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲天堂av无毛| 中文字幕亚洲精品专区| 国产一区二区在线观看av| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 在线观看三级黄色| 久久毛片免费看一区二区三区| av天堂久久9| 国产成人一区二区在线| 国产免费视频播放在线视频| 国产熟女欧美一区二区| 国内精品宾馆在线| 男女边摸边吃奶| 久久人人爽人人片av| 大香蕉久久成人网| 久久久久久人人人人人| 亚洲美女视频黄频| 国产成人精品一,二区| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲丝袜综合中文字幕| 中文字幕最新亚洲高清| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 成人影院久久| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 亚洲,欧美,日韩| 人人澡人人妻人| 捣出白浆h1v1| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产有黄有色有爽视频| 97人妻天天添夜夜摸| 蜜臀久久99精品久久宅男| 性色av一级| 观看av在线不卡| 亚洲伊人色综图| 亚洲精品色激情综合| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 丰满乱子伦码专区| 捣出白浆h1v1| 性色avwww在线观看| 免费观看在线日韩| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 香蕉国产在线看| 亚洲欧美一区二区三区国产| 九九在线视频观看精品| www.熟女人妻精品国产 | 精品久久蜜臀av无| 国产爽快片一区二区三区| 国产精品偷伦视频观看了| 最近2019中文字幕mv第一页| 日本黄大片高清| 欧美人与性动交α欧美软件 | 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲精品美女久久av网站| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲,欧美,日韩| 成人漫画全彩无遮挡| 赤兔流量卡办理| 伦理电影免费视频| kizo精华| 国产视频首页在线观看| 永久网站在线| 精品卡一卡二卡四卡免费| 18禁国产床啪视频网站| 国产高清国产精品国产三级| 少妇的逼水好多| 亚洲综合色网址| 中文字幕制服av| 只有这里有精品99| 国产精品一二三区在线看| 1024视频免费在线观看| 51国产日韩欧美| 男女啪啪激烈高潮av片| 欧美精品亚洲一区二区| 母亲3免费完整高清在线观看 | 国产精品国产三级专区第一集| 丝袜喷水一区| 69精品国产乱码久久久| 如何舔出高潮| 国产黄色免费在线视频| av国产精品久久久久影院| 久久亚洲国产成人精品v| 青春草亚洲视频在线观看| 一个人免费看片子| av播播在线观看一区| 国产69精品久久久久777片| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲天堂av无毛| 蜜桃国产av成人99| 国产 一区精品| 青春草国产在线视频| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲国产精品成人久久小说| 人成视频在线观看免费观看| 99久国产av精品国产电影| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 春色校园在线视频观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花| av在线播放精品| 精品国产一区二区三区四区第35| 精品一区二区免费观看| 久久精品国产亚洲av天美| 色婷婷av一区二区三区视频| 男人舔女人的私密视频| 日韩精品有码人妻一区| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲美女视频黄频| 伊人久久国产一区二区| 久久这里只有精品19| 久久久精品区二区三区| 国产极品天堂在线| 久久久久网色| 成人毛片60女人毛片免费| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产片特级美女逼逼视频| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲精品国产av成人精品| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲成人手机| 欧美日韩综合久久久久久| 一区二区三区乱码不卡18| 国产熟女欧美一区二区| 在现免费观看毛片| 国产免费一级a男人的天堂| 狂野欧美激情性bbbbbb| 18在线观看网站| 成人二区视频| 99香蕉大伊视频| 高清毛片免费看| 美女国产视频在线观看| 亚洲国产精品国产精品| av网站免费在线观看视频| 国产成人aa在线观看| 蜜臀久久99精品久久宅男| 亚洲精品456在线播放app| 亚洲精品,欧美精品| 中文字幕制服av| 国产成人免费观看mmmm| 在线观看人妻少妇| www.色视频.com| 男女午夜视频在线观看 | 欧美少妇被猛烈插入视频| 免费在线观看完整版高清| 亚洲,一卡二卡三卡| 亚洲成色77777| 春色校园在线视频观看| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 少妇熟女欧美另类| 男人操女人黄网站| 自线自在国产av| 桃花免费在线播放| 少妇精品久久久久久久| 国产成人精品婷婷| 欧美变态另类bdsm刘玥| 久久午夜综合久久蜜桃| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 日本爱情动作片www.在线观看| 女人久久www免费人成看片| 国产免费一区二区三区四区乱码| 成人亚洲精品一区在线观看| av卡一久久| 国产免费现黄频在线看| 最后的刺客免费高清国语| 99国产综合亚洲精品| 热99国产精品久久久久久7| 交换朋友夫妻互换小说| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| av在线观看视频网站免费| 亚洲成人一二三区av| 日本午夜av视频| 免费黄网站久久成人精品| 草草在线视频免费看| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产一区二区在线观看av| 免费黄频网站在线观看国产| 一边亲一边摸免费视频| 两个人免费观看高清视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 国产av一区二区精品久久| 搡老乐熟女国产| 大香蕉久久网| 精品久久久精品久久久| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | www日本在线高清视频| 丝袜人妻中文字幕| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲美女黄色视频免费看| 国产深夜福利视频在线观看| 日本色播在线视频| videos熟女内射| 欧美精品国产亚洲| 蜜桃在线观看..| 最近中文字幕高清免费大全6| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲av免费高清在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 人妻系列 视频| 日本午夜av视频| 精品亚洲成国产av| 国产激情久久老熟女| 18禁国产床啪视频网站| xxxhd国产人妻xxx| 成人亚洲精品一区在线观看| 大片免费播放器 马上看| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲精品第二区| 男人操女人黄网站| 久久人人97超碰香蕉20202| 日韩中文字幕视频在线看片| h视频一区二区三区| 久久ye,这里只有精品| 十八禁网站网址无遮挡| 99久久综合免费|