兩種方法處理冷凝標(biāo)本的結(jié)果分析

洪華林 ，嚴(yán)莉 ，沈燕

（1.長興縣中醫(yī)院，浙江 湖州 313100；2.浙江省人民醫(yī)院，浙江 杭州 310014）

在實際工作中，影響血細(xì)胞分析儀檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的因素始終存在，包括儀器、試劑、環(huán)境溫度、人為因素、病理因素以及規(guī)章制度等[1]。比如冷凝集樣本對血細(xì)胞分析儀的檢測參數(shù)、散點圖和直方圖均有明顯干擾，導(dǎo)致多項檢測結(jié)果與真實結(jié)果并不相符，解決冷凝集對全自動血細(xì)胞分析儀檢測結(jié)果的影響以往多使用水浴法[2-4]，但當(dāng)含有高效價冷凝集素的標(biāo)本時，水浴法往往不能有效解決此問題。在工作中發(fā)現(xiàn)多次使用Sysmex-XS500i稀釋模式加水浴法能更快、更好地處理高效價凝集標(biāo)本，現(xiàn)對直接水浴儀器法測定結(jié)果與預(yù)稀釋再水浴儀器法作比較，報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 1例于2018年3月20日夜間因急性呼吸道感染到長興縣中醫(yī)院就診患者，男，65歲。血常規(guī)檢查：RBC 為 1.18×1012/L，HGB 為 131g/L，WBC 為 9.92×109/L，PLT 為 199×109/L，血細(xì)胞比容（Hct）為 12.3%，紅細(xì)胞平均容積（MCV）104.2fL，紅細(xì)胞平均血紅蛋白量（MCH）為110.0pg，紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度（MCHC）為1065g/L。急診Sysmex-XS500i血細(xì)胞分析儀報警提示紅細(xì)胞雙峰、紅細(xì)胞凝集。肉眼可見抗凝管內(nèi)壁有較多凝集顆粒，呈磨砂狀，標(biāo)本制作血涂片，瑞-姬氏染色發(fā)現(xiàn)RBC大量聚集成塊。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 日本Sysmex-XS500i全自動血液分析儀及其配套試劑和校準(zhǔn)物以及國產(chǎn)質(zhì)控品，上海博迅HHS型電熱恒溫水浴箱，奧林巴斯CX31雙目顯微鏡。

1.2.2 檢測方法 分析前Sysmex-XS500i高、低兩個水平的室內(nèi)質(zhì)控，質(zhì)控品來源于山東煙臺卓越生物科技有限公司。將用EDTA-K2抗凝的急診冷凝集標(biāo)本分為2等份。其中一份標(biāo)本分成10小等份，不做稀釋處理，放入37℃水浴箱溫育不同時間后立即用Sysmex-XS500i檢測2次，結(jié)果取平均值；另一份標(biāo)本按Sysmex-XS500i稀釋模式1:7比例稀釋處理，再分成10等份，同樣放入37℃水浴箱溫育不同時間后立即用Sysmex-XS500i稀釋模塊同樣檢測2次，結(jié)果取平均值。儀器檢測前肉眼觀察20份標(biāo)本，完成檢測后立即制作血涂片，瑞-姬氏染色觀察紅細(xì)胞聚集情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 以《WS/T406-2012臨床血液學(xué)檢驗常規(guī)項目分析質(zhì)量要求》中的比對試驗接受標(biāo)準(zhǔn)作為判斷差異大小的標(biāo)準(zhǔn)，比較直接水浴儀器法與預(yù)稀釋再水浴儀器法測定結(jié)果的差異。

2 結(jié)果

2.1 儀器檢測 從表1中可知：（1）兩種方法處理后水浴相同時間內(nèi)WBC結(jié)果差異較明顯（大于規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)7.5%），同一方法水浴不同時間WBC變化較?。ㄐ∮谝?guī)定標(biāo)準(zhǔn)7.5%）；（2）兩種方法處理后水浴相同時間內(nèi)RBC結(jié)果差異較明顯，（大于規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)3.0%），同一方法水浴不同時間，A組變化較小，B組在水浴5分鐘后變化明顯，兩者隨著水浴時間的延長，RBC計數(shù)慢慢增高，與起始水浴的情況相比差異較明顯；（3）HBG無論是不同方法還是不同時間，結(jié)果均較穩(wěn)定（小于規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)3.5%）；（4）Hct變化與 RBC 相似；（5）MCV 與 HGB 相似；（6）MCH與MCHC變化趨勢大致相同，即兩種方法處理后水浴相同時間內(nèi)MCH與MCHC結(jié)果差異較明顯（大于規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)3.5%），同一方法水浴不同時間A組變化較小，B組水浴5分鐘后變化明顯，兩者隨著水浴時間的延長，MCH與MCHC呈降低趨勢，與起始水浴的情況相比差異較明顯；（7）PLT經(jīng)兩種方法處理后水浴相同時間內(nèi)結(jié)果差異較明顯（大于規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)12.5%），未稀釋水浴法處理標(biāo)本后，水浴不同時間PLT變化不大（小于規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)12.5%），而預(yù)稀釋水浴法隨著水浴時間延長PLT計數(shù)呈升高趨勢，與起始情況相比差異較明顯。

表1 兩種不同方法處理冷凝集標(biāo)本檢測結(jié)果

2.2 肉眼觀察及瑞-姬氏染色鏡檢 肉眼觀察時，直接水浴標(biāo)本（A組）始終能看到磨砂狀的肉眼凝集（圖1），而預(yù)稀釋再水浴標(biāo)本（B組）一開始有磨砂狀凝集，5分鐘后即消失（圖2）；標(biāo)本血涂片鏡檢下，A組始終能看到大片聚集現(xiàn)象（圖3）；B組很難觀察到肉眼凝集，血涂片除最初階段有少量凝集之外，后續(xù)時間紅細(xì)胞聚集少見或者未見（圖4-5）。詳見表2。

3 討論

冷凝集是指由冷凝集素引起的RBC在低溫環(huán)境下凝集成團(tuán)的現(xiàn)象。冷凝集反應(yīng)一般出現(xiàn)在30℃以下，0～4℃時最強，尤以RBC凝集最為明顯[5]。冷凝集素是一種針對RBC膜抗原的IgM型自身抗體，是一種可逆性抗體，在低溫時可與自身RBC、“O”型RBC發(fā)生冷凝集，溫度提高后凝集可消失。健康人血液中可存在低滴度的冷凝集素，其滴度往往在1:16以下[6]，一般不引起RBC凝集，但當(dāng)冷凝集素滴度明顯增高時，則可引起比較嚴(yán)重的RBC凝集。自身免疫性疾病、支原體感染、非特異性炎癥、傳染性單核細(xì)胞增多癥及漿細(xì)胞瘤等可引起冷凝集素滴度輕度增高（特殊情況下可以明顯增高），而高滴度冷凝集素主要見于原發(fā)性冷凝集素綜合征[7]。冷凝集現(xiàn)象會干擾血細(xì)胞分析儀檢測，對血常規(guī)多項參數(shù)造成不同程度的影響。通過對比分析具有冷凝集現(xiàn)象的血標(biāo)本經(jīng)過不同處理方式在37℃水浴前、后各參數(shù)的檢測結(jié)果變化，以RBC、Hct、MCH、MCHC等參數(shù)受冷凝集的影響最為敏感，其次為WBC、PLT（造成其結(jié)果降低）。冷凝集現(xiàn)象可引起RBC、Hct結(jié)果明顯減低，但HGB結(jié)果無明顯變化，使RBC、Hct與HGB的關(guān)系嚴(yán)重不符，造成MCH、MCHC 結(jié)果顯著增高[8]。

目前，處理冷凝集的報道多偏向于熱水浴的方法和血漿置換法。但血漿置換法操作比較繁瑣，且操作過程中會造成WBC、PLT有所減少，需要手工校正[7]。本研究建議對水浴法不能完全消除干擾的冷凝集標(biāo)本，可采用預(yù)稀釋水浴法，并用Sysmex-XS500i稀釋模塊檢測。本實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過以上方法，WBC、RBC、Hct、MCH、MCHC、PLT 與未稀釋水浴結(jié)果比較偏倚分別大于7.5%、3.0%、3.5%、3.5%、3.5%、12.5%，效果明顯，而且操作方便，在預(yù)稀釋水浴25～30分鐘后各參數(shù)趨于穩(wěn)定。主要原因在于1:7稀釋標(biāo)本時，降低了標(biāo)本的凝集效價，增加了細(xì)胞間的距離，降低了細(xì)胞表面電荷的作用，從而減少細(xì)胞間的聚集，降低冷凝集素的干擾[7]。涂片顯微鏡下觀察顯示，紅細(xì)胞無凝集現(xiàn)象，上機檢測時血常規(guī)各項參數(shù)檢測結(jié)果均恢復(fù)正常，直方圖恢復(fù)正常，Sysmex-XS500i無報警提示。王加勇等[9]研究過使用血液分析儀Sysmex-XN9000預(yù)稀釋再水浴處理冷凝集標(biāo)本，效果顯著，符合美國實驗室修正法規(guī)（CLIA’88）規(guī)定的室間質(zhì)量評價要求。需要注意的是，稀釋時比例必須嚴(yán)格按照稀釋模式比例進(jìn)行，并選擇良好的量具，否則會造成較大誤差。

綜上所述，對懷疑有冷凝集的標(biāo)本，上機檢測前應(yīng)仔細(xì)觀察每份血常規(guī)標(biāo)本的外觀，當(dāng)搖動血液時，觀察到管壁上有明顯的磨砂狀的凝集顆粒應(yīng)將血標(biāo)本預(yù)稀釋置37℃水浴25～30分鐘，待冷凝集現(xiàn)象消除后，立即上機檢測。因此，在日常工作中要自覺地按實驗要求對每份血細(xì)胞檢測結(jié)果仔細(xì)分析，在審核報告單時，除了重點審查WBC、RBC、HGB、PLT等主要指標(biāo)外，還需核對MCH、MCHC等指標(biāo)，當(dāng)MCH與MCHC明顯增高時，且觀察到散點圖、直方圖異常及儀器報警提示，往往表示有冷凝集現(xiàn)象。如發(fā)現(xiàn)冷凝集標(biāo)本，應(yīng)密切結(jié)合臨床，查明原因，通過預(yù)稀釋37℃水浴25～30分鐘等方法排除干擾，防止檢驗報告錯誤，影響臨床診療。