河南部分地區(qū)烏雞群鴨源雞桿菌的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

皇甫和平，杜振隆，董 青，王宏魁，孫彥婷，郭宏偉，姬向波，賈含笑，余萌薇，卜亞歌

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，鄭州 450046)

鴨源雞桿菌是雞桿菌屬的代表種，是雞上呼吸道和下生殖道的一種常在菌，具有條件致病性，是雞輸卵管炎和腹膜炎的重要致病因子[1]。資料顯示國(guó)內(nèi)外雞群中雞桿菌流行廣泛，2008年王川慶等[1]首次對(duì)河南地區(qū)進(jìn)行鴨源雞桿菌感染情況調(diào)查，結(jié)果顯示雞場(chǎng)普遍存在鴨源雞桿菌的感染，隨后陸續(xù)見(jiàn)到山東、山西、四川、河北和湖北等地區(qū)雞群中鴨源雞桿菌感染的報(bào)道[2-7]，2014年楊曉林等[8]從四川鴿場(chǎng)中分離出雞桿菌基因種3型；2018年，El-Adawy 等[9]報(bào)道德國(guó)雞群中有雞桿菌的流行，Elbestawy 等[10]報(bào)道埃及的雞群中也有鴨源雞桿菌的流行。鴨源雞桿菌的易感禽類包括雞、鴨、鵝、鵪鶉、火雞和鴿等[1]。

烏雞作為我國(guó)的一種特有珍禽，以其高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值聞名天下，在我國(guó)禽類養(yǎng)殖中占有特殊的地位，截至目前國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)到烏雞中雞桿菌流行情況的報(bào)道。因此，了解烏雞中雞桿菌的流行情況、流行種類及生物學(xué)特性，對(duì)烏雞的健康養(yǎng)殖具有重要意義。

16S rRNA基因進(jìn)化速度緩慢，保守性強(qiáng)，是細(xì)菌分類的黃金標(biāo)準(zhǔn)。gyrB基因編碼DNA促旋酶B亞基，進(jìn)化速度較16S rRNA快、堿基替換率高，在DNA復(fù)制等功能起重要作用[11]，rpoB基因作為一個(gè)單一拷貝的管家基因，是RNA聚合酶的重要組成部分。gyrB基因和rpoB基因也可以作為一種分析方法，輔助進(jìn)行16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析[12-17]。因此，在此前工作的基礎(chǔ)上，筆者擬選取16S rRNA、rpoB和gyrB三個(gè)基因位點(diǎn)對(duì)分離的鴨源雞桿菌進(jìn)行遺傳進(jìn)化和耐藥性分析。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

ETC-811 PCR儀為北京東勝創(chuàng)新生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Universal Hood II凝膠成像系統(tǒng)為美國(guó)伯樂(lè)公司產(chǎn)品；3-30K高速冷凍離心機(jī)為德國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。

DNA Marker購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司(以下簡(jiǎn)稱上海生工)；TaKaRa ExTaq、10×Ex.TaqBuffer(Mg2+)、dNTP混合物、Premix ExTaq、ROX Reference Dye II均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；綿羊血平板培養(yǎng)基購(gòu)自鄭州福博賽生物技術(shù)有限責(zé)任公司；OXOID藥敏紙片購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

1.2 引物

參考Weisburg等[18]和Christensen等[19]的方法分別設(shè)計(jì)16S rRNA和rpoB基因的PCR引物；參考Johuson等[20]的方法設(shè)計(jì)gyrB基因的PCR引物；根據(jù)Huangfu等[21]的方法設(shè)計(jì)鴨源雞桿菌的q-PCR引物和探針；參考Bojesen等[22]的方法設(shè)計(jì)雞桿菌特異性PCR的兩對(duì)引物，1133fgal、114r分別定位于16S rRNA和23S rRNA基因，另一對(duì)引物與rpoB基因PCR引物一致，作為內(nèi)參。委托上海生工合成上述引物及探針，序列詳見(jiàn)表1。

1.3 樣品采集

從河南省信陽(yáng)和南陽(yáng)的兩個(gè)烏雞場(chǎng)隨機(jī)采樣，每只烏雞采集上腭裂和泄殖腔棉拭子各一份，南陽(yáng)地區(qū)的烏雞場(chǎng)采集12只，信陽(yáng)地區(qū)的烏雞場(chǎng)采集10只，共采集了22只烏雞的44份樣品，所采集的22只烏雞均為外觀健康雞。

表1引物和探針

Table1Primersandprobes

引物名稱Primer name基因Gene引物序列(5′→3′)Primer sequence(5′→3′)F1R116S rRNACCGAATTCGACAACAGAGTTTGATCATGGCTCAGCCCGGGATCCAAGCTTACGGTTACCTTGTTACGACTTrpoB-LrpoB-RrpoBGCAGTGAAAGARTTCTTTGGTTCGTTGCATGTTIGIACCCATgyrB-FgyrB-RgyrBTGTGCGTTTCTGGCCAAGTCCGCTCACCAACTGCAGATTCPrimer-FPrimer-RProbe_INgtxAATGGGACATTCTATCGCAAACCAACGGCGGTAGAGGCATTAGFAM-TGTTAATACAAGTAGCGGGAAAGCGGC-TAMRA1133fgal114r16S rRNA23S rRNATATTCTTTGTTACCARCGGGGTTTCCCCATTCGG

1.4 雞桿菌的分離與鑒定

1.4.1 雞桿菌的分離 無(wú)菌方法將棉拭子涂布于血平板培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取圓形、隆起、直徑1～2 mm、β溶血的菌落，顯微鏡檢查后，接種于含5%胎牛血清的LB肉湯，37 ℃ 200 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h后，參考Huangfu等[21]的方法提取疑似菌株DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 雞桿菌PCR鑒定 反應(yīng)體系：10× Buffer(含Mg2+)2.5 μL，dNTP(10 U)0.5 μL，濃度均為25 μmol·L-1的引物1133fgal、114r、rpoB-L和rpoB-R各0.5 μL，Taq酶1.25 U，模板2 μL，補(bǔ)充滅菌去離子水至25 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。電泳檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物。

1.5 棉拭子樣品的q-PCR檢測(cè)

參考Huangfu等[21]的方法提取44份棉拭子樣品的DNA然后進(jìn)行q-PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系(20 μL)：Premix ExTaq10 μL，引物Primer-F(10 μmol·L-1) 和Primer-R(10 μmol·L-1)各0.4 μL，探針Probe_IN(10 μmol·L-1) 0.6 μL，ROX DyeⅡ 0.2 μL，棉拭子DNA 2 μL，補(bǔ)充滅菌去離子水至20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，40個(gè) 循環(huán)；在每個(gè)循環(huán)60 ℃結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果Ct值小于35判定為陽(yáng)性。

1.6 分離株的管家基因PCR擴(kuò)增和測(cè)序

參考皇甫和平等[17]的方法擴(kuò)增分離菌株的16S rRNA、rpoB基因，參考Johnson等[20]的方法擴(kuò)增gyrB基因，PCR產(chǎn)物純化后，提交上海生工測(cè)序。

1.7 分離菌株的藥敏試驗(yàn)

參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)抗菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)(M100-S23)，選取13種藥敏片(氨芐西林、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、克林霉素、慶大霉素、左氧氟沙星、頭孢曲松、氯霉素、頭孢噻肟、阿米卡星、妥布霉素、氧氟沙星、四環(huán)素)，采取紙片法對(duì)分離的4株鴨源雞桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

1.8 遺傳進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建及相似性分析

以多殺性巴氏桿菌為外群，將分離株與雞桿菌屬其他種進(jìn)行比較分析，菌株信息見(jiàn)表2，利用DNAStar軟件中的MegAlign程序計(jì)算種間相似性，再利用MEGA5.0 構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)(NJ建樹(shù)法，1 000 個(gè)重復(fù))，對(duì)于遺傳差異顯著的基因，推導(dǎo)出氨基酸序列后，利用DNAStar和在線軟件(http://www.expasy.ch)進(jìn)行氨基酸序列的比較分析。

表2雞桿菌菌株信息

Table2InformationofGallibacteriumstrains

菌株Strain種Speices登陸號(hào)Accession基因Gene分離地Separation of placesGAC017鴨源雞桿菌MH393185MH423846MH42384216S rRNA rpoBgyrB河南信陽(yáng)GAC018鴨源雞桿菌MH393186MH423847MH42384316S rRNArpoBgyrB河南信陽(yáng)GAC021鴨源雞桿菌MH393187MH423848MH42384416S rRNA rpoBgyrB河南南陽(yáng)GAC193鴨源雞桿菌MH393188MH423849MH42384516S rRNArpoBgyrB河南南陽(yáng)CCM 5976鴨源雞桿菌HQ629846.1rpoB丹麥Yu-JZ-WZ-YQ-5-SLG鴨源雞桿菌GQ464991.1rpoB河南鄭州19987/2輸卵管炎雞桿菌EU424019.1rpoB瑞士F292虎皮鸚鵡雞桿菌EU424008.1rpoB瑞士B7/99/1海藻糖發(fā)酵雞桿菌EU424013.1rpoB瑞士CCM5974雞桿菌基因種1AY314033.1rpoB瑞士59/S3/89雞桿菌基因種3EU424017.1rpoB瑞士K323巴氏桿菌AY683501.1rpoB丹麥Yu-JZ-WZ-YQ-5-SLG鴨源雞桿菌JN828469.116S rRNA河南鄭州F149鴨源雞桿菌NR036870.116S rRNA丹麥F292虎皮鸚鵡雞桿菌EU423990.116S rRNA瑞士B7/99/1海藻糖發(fā)酵雞桿菌EU423995.116S rRNA瑞士CCM5975雞桿菌基因種1AF228016.116S rRNA丹麥CCM5976雞桿菌基因種2AF228017.116S rRNA丹麥59/S3/89雞桿菌基因種3EU423999.116S rRNA瑞士CCUG17976巴氏桿菌NR041809.116S rRNA美國(guó)Yu-JZ-WZ-YQ-5-SLG鴨源雞桿菌JN828478.1gyrB河南鄭州GAF465鴨源雞桿菌JQ648194.1gyrB美國(guó)CCUG23139雞桿菌基因種1AY258267.1gyrB丹麥Pm25多殺性巴氏桿菌KM111361.1gyrB吉林長(zhǎng)春

2 結(jié) 果

2.1 雞桿菌的分離鑒定

共分離到4株疑似菌株，菌株在血平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落呈圓形、隆起、透明、邊緣整齊的形態(tài)，β溶血(圖1)。油鏡下細(xì)菌為革蘭陰性菌，呈短桿狀、單個(gè)或成對(duì)存在。LB肉湯均變渾濁，有的管底可見(jiàn)絮狀沉淀。4株疑似菌株經(jīng)雞桿菌PCR擴(kuò)增，均擴(kuò)增到預(yù)期的3條DNA條帶(1 030、790和560 bp)，表明均為雞桿菌，見(jiàn)圖2。

圖1 雞桿菌分離菌株血平板生長(zhǎng)狀態(tài)
Fig.1 Blood plate growth state of isolated Gallibacterium
strains

M.DL2000 DNA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；B. 空白對(duì)照；P. 陽(yáng)性對(duì)照；1. GAC017；2. GAC018；3. GAC021；4. GAC193
M. DL2000 DNA marker; B. Blank control; P. Positive control; 1. GAC017; 2. GAC018; 3. GAC021; 4.GAC193
圖2 雞桿菌特異性PCR鑒定
Fig.2 Gallibacterium specific PCR

2.2 棉拭子樣品的q-PCR檢測(cè)

44份棉拭子樣品中共檢出23個(gè)陽(yáng)性樣本，鴨源雞桿菌陽(yáng)性烏雞16只，檢出率達(dá)72.7%(16/22)，q-PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。

B.空白對(duì)照和陰性樣品；P. 陽(yáng)性對(duì)照；1. 陽(yáng)性樣品
B. Blank control and negative samples; P. Positive control; 1. Positive samples
圖3 棉拭子樣品q-PCR檢測(cè)結(jié)果
Fig.3 q-PCR test results of cotton swab samples

2.3 分離株的PCR擴(kuò)增

三個(gè)管家基因PCR均擴(kuò)增到了預(yù)期的目的片段，16S rRNA基因1 600 bp，rpoB基因560 bp，gyrB基因561 bp，電泳結(jié)果如圖4所示。

a、b和c分別為16S rRNA、rpoB和gyrB基因的電泳結(jié)果。M. DL2000 DNA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；B. 空白對(duì)照；P. 陽(yáng)性對(duì)照；1. GAC017；2. GAC018；3. GAC021；4. GAC193。條帶中有標(biāo)記的代表強(qiáng)陽(yáng)性
a, b and c were electrophoretic results of 16S rRNA, rpoB and gyrB genes. M. DL2000 DNA marker; B. Blank control; P. Positive control; 1. GAC017; 2. GAC018; 3. GAC021; 4.GAC193. The tagged bands represent strong positive
圖4 雞桿菌分離株3個(gè)基因的PCR產(chǎn)物檢測(cè)
Fig.4 Detection of PCR products of three genes of Gallibacterium isolates

2.4 分離株的藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，由表可知4株鴨源雞桿菌均為多重耐藥菌株，耐藥數(shù)量別為9、7、11和11，有3種耐藥譜：AMP-C-CIP-OFX-LEV-SXT-TE-CTX-DA、AMP-C-CIP-OFX-SXT-TE-DA、AMP-C-CIP-OFX-LEV-SXT-TE-CN-TOB-AK-DA。分離菌株對(duì)頭孢曲松、頭孢噻肟、阿米卡星和妥布霉素等藥物敏感。

2.5 分離株的遺傳進(jìn)化及相似性分析

以多殺性巴氏桿菌為外群，建立遺傳進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖5。除GAC193在rpoB基因位點(diǎn)與多殺性巴氏桿菌位于同一分支、GAC017在gyrB基因位點(diǎn)與雞桿菌基因種1在一個(gè)小的分支之外，4株細(xì)菌在三個(gè)進(jìn)化樹(shù)中均與鴨源雞桿菌參考株在同一分支。

表3藥敏試驗(yàn)結(jié)果

Table3Drugsensitivitytestresults

藥物名稱Drug nameGAC017GAC018GAC021GAC193氨芐西林AMPRRRR環(huán)丙沙星CIPRRRR復(fù)方新諾明SXTRRRR克林霉素DARRRR慶大霉素CNSSRR左氧氟沙星LEVRIRR頭孢曲松CROISII氯霉素CRRRR頭孢噻肟CTXRSII阿米卡星AKSSRR妥布霉素TOBSSRR氧氟沙星OFXRRRR四環(huán)素TERRRR

S.高度敏感；I. 中度敏感；R. 耐藥

S. Highly sensitive; I. Moderately sensitive; R. Resistant

3個(gè)管家基因相似性分析結(jié)果(表4)顯示：分離株與參考鴨源雞桿菌16S rRNA基因相似性在99.1%～99.8%之間、rpoB基因相似性在85.4%～99.6%之間、gyrB基因相似性在92.7%～99.8%之間。分離株與雞桿菌基因種1型16S rRNA基因相似性在96.3%～97.0%之間、rpoB基因相似性在83.8%～92.7%之間、gyrB基因相似性在89.0%～96.1%之間。將rpoB基因序列推導(dǎo)為氨基酸序列，進(jìn)行氨基酸序列分析，發(fā)現(xiàn)GAC193分離株的RpoB氨基酸序列有10處氨基酸的替換，替換后其穩(wěn)定性參數(shù)由40.42升高為45.64，不穩(wěn)定性升高；同時(shí)對(duì)氨基酸序列進(jìn)行相似性分析，GAC193分離株的氨基酸序列與巴氏桿菌相似性為95.6%，與其他鴨源雞桿菌的相似性為93.7%。

3 討 論

作為一種條件性致病菌，鴨源雞桿菌的致病性和致病機(jī)制正逐漸被人們揭示，Kristensen等[23]報(bào)道了鴨源雞桿菌的GtxA毒素，該毒素具有細(xì)胞毒性和溶血活性；張秀平等[24]用鴨源雞桿菌感染原代輸卵管上皮細(xì)胞，感染的上皮細(xì)胞分泌的促炎細(xì)胞因子明顯增多，能夠造成輸卵管上皮細(xì)胞的損傷；此外，鴨源雞桿菌的外膜囊泡、菌毛和金屬蛋白酶等毒力因子也見(jiàn)諸報(bào)道[25-28]。因此，鴨源雞桿菌感染導(dǎo)致的相關(guān)疾病也應(yīng)引起人們重視。

本研究通過(guò)細(xì)菌分離、顯微鏡鏡檢、q-PCR及管家基因序列分析等方法證實(shí)烏雞中有鴨源雞桿菌存在，具有較高的檢出率(72.7%)，并分離到了4株鴨源雞桿菌。烏雞中較高的鴨源雞桿菌檢出率與蛋雞中鴨源雞桿菌的流行情況一致[1-2]，提醒人們也要關(guān)注烏雞中鴨源雞桿菌感染引起的相應(yīng)疾病問(wèn)題。22只烏雞中鴨源雞桿菌的檢出率為72.7%，而只分離到4株鴨源雞桿菌，雞桿菌的低分離率與細(xì)菌的分離方法有關(guān)，鴨源雞桿菌處于一個(gè)弱勢(shì)菌群，分離時(shí)難免有大腸桿菌等優(yōu)勢(shì)菌群與之相競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致雞桿菌的分離率較低。

基于16S rRNA基因的相似性和進(jìn)化樹(shù)分析顯示，4株分離株與其他鴨源雞桿菌參考株的相似性在99.1%～99.8%之間，大于97%，并且歸在同一個(gè)分支中，證明了4株分離菌株均為鴨源雞桿菌[29]。rpoB基因進(jìn)化樹(shù)中GAC017、GAC018和GAC021與鴨源雞桿菌參考菌株歸在一個(gè)分支，而GAC193分離株與巴氏桿菌位于同一分支，經(jīng)同源性分析發(fā)現(xiàn)：GAC193菌株與其他鴨源雞桿菌相似性在85.2%～86.0%，而與外群巴氏桿菌相似性為86.9%，其氨基酸序列與巴氏桿菌相似性為95.6%，與其他鴨源雞桿菌的相似性為93.7%，對(duì)該菌株的rpoB基因序列的比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)其發(fā)生了大范圍的突變，GAC193分離株rpoB基因編碼氨基酸序列有10處氨基酸的替換，替換后的RpoB不穩(wěn)定性升高。但該基因突變究竟為適應(yīng)烏雞品種適應(yīng)性改變還是藥物壓力選擇等，以及其突變后相應(yīng)功能是否發(fā)生改變均需要進(jìn)一步深入的研究。gyrB基因進(jìn)化樹(shù)顯示：GAC017分離株與其他鴨源雞桿菌不在同一分支中，同源性分析顯示：GAC017分離株gyrB基因序列與雞桿菌基因種1型的相似性最高，為該基因的部分堿基的替換導(dǎo)致。上述研究結(jié)果表明烏雞中分離的部分鴨源雞桿菌在rpoB和gyrB基因具有明顯的遺傳進(jìn)化差異，也驗(yàn)證了16S rRNA基因保守性明顯高于rpoB和gyrB基因[30-31]。

雞桿菌屬目前包括鴨源雞桿菌、輸卵管炎雞桿菌、虎皮鸚鵡雞桿菌、海藻糖發(fā)酵雞桿菌以及三個(gè)基因種(G.genomosp.1、2、3)[32-33]，該屬中部分鴨源雞桿菌、雞桿菌基因種1和雞桿菌基因種2具有溶血活性。本次研究從烏雞中僅分離到溶血表型的鴨源雞桿菌，這與本研究中使用的細(xì)菌分離方法有一定關(guān)系，具體烏雞中是否存在其他雞桿菌種，需要進(jìn)一步深入研究。

圖5 雞桿菌分離株與參考株基于3個(gè)基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)
Fig.5 Phylogenetic trees based on three genes of Gallibacterium isolates and reference strains

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，烏雞分離的4株鴨源雞桿菌產(chǎn)生了3種耐藥譜，耐藥數(shù)量最少的有7種，該結(jié)果與郭倫濤[34]、高冬生[35]的研究結(jié)果一致，說(shuō)明鴨源雞桿菌分離株嚴(yán)重的耐藥性；分離株的耐藥性與不同的地理來(lái)源有一定關(guān)系，信陽(yáng)分離的兩株細(xì)菌耐藥數(shù)量較少，且對(duì)慶大霉素、阿米卡星、妥布霉素三種藥物敏感，而南陽(yáng)分離的兩株雞桿菌耐藥數(shù)量較多，且耐藥譜一致，對(duì)慶大霉素、阿米卡星、妥布霉素藥物出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。鴨源雞桿菌嚴(yán)重的多重耐藥性已經(jīng)引起人們的重視，彭志鋒等[36]的研究表明鴨源雞桿菌Ⅰ類整合子與其多重耐藥有一定關(guān)聯(lián)，但并不能完全揭示該菌的多重耐藥機(jī)制，因此仍需進(jìn)一步深入研究。

表4相似性分析結(jié)果

Table4Analysisofsimilarity

%

-. 未找到該基因序列

-. The gene sequence was not found

4 結(jié) 論

烏雞體內(nèi)有鴨源雞桿菌存在，并具有較高的檢出率；本研究從烏雞中分離到4株鴨源雞桿菌，未分離到其他種雞桿菌；分離的鴨源雞桿菌多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，耐藥種類達(dá)11種；烏雞群中分離的部分鴨源雞桿菌在rpoB和gyrB基因位點(diǎn)具有明顯遺傳進(jìn)化差異。