轉(zhuǎn)錄組揭示禁水環(huán)境下雙峰駝結(jié)腸組織適應(yīng)機(jī)制

凌 宇，齊 昱，曹俊偉，王申元，周歡敏, 張焱如

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010019)

駱駝科現(xiàn)存的物種分別為雙峰駝(bactrian camel)、單峰駝(arabian camel)、原駝(guanaco)、大羊駝(llama)、小羊駝(vicugna)、羊駝(alpaca)。其中駱駝屬包含雙峰駝和單峰駝。嚴(yán)苛的生存環(huán)境使得駱駝屬進(jìn)化出抗旱、抗病、耐粗飼、耐高溫的特性，使駱駝成為蒙古高原的優(yōu)勢畜牧品種。目前，人們對駱駝的研究主要集中在駱駝屬的進(jìn)化歷史，以及人工選擇在駱駝遺傳物質(zhì)中留下的馴化痕跡，也發(fā)現(xiàn)雙峰駝在長期進(jìn)化中形成了胰島素不敏感[1]。已有的轉(zhuǎn)錄組研究顯示，駱駝腎能夠很好的利用血液中高濃度的葡萄糖，維持腎細(xì)胞的高滲透特征，證明高濃度血糖對于雙峰駝本身正常生理代謝是有利的[2]，但針對于雙峰駝耐旱的生理學(xué)特征的研究尚屬空白。

動物在消化吸收過程中，小腸和胃等組織主要負(fù)責(zé)食物中特定氨基酸和礦物質(zhì)的消化吸收。結(jié)腸作為消化系統(tǒng)的末端組織，承擔(dān)著代謝產(chǎn)物存儲與收集的任務(wù)。與小腸不同的是，結(jié)腸主要功能是吸收食物殘?jiān)写罅康乃郑瑢U物殘?jiān)凶詈蟮乃趾望}回收。結(jié)腸對水吸收的機(jī)制是通過黏膜滲透壓梯度進(jìn)行的，梯度滲透是水逆腸內(nèi)滲透梯度的重吸收。腸內(nèi)壁的細(xì)胞將鈉離子泵入細(xì)胞間隙，提高細(xì)胞間液的滲透壓，這種高滲液體產(chǎn)生滲透壓，通過緊密連接和相鄰細(xì)胞的滲透將水驅(qū)入側(cè)向細(xì)胞間隙，再穿過基膜進(jìn)入毛細(xì)血管，同時鈉離子再次泵入細(xì)胞間液中[3-4]。雖然水在每個單獨(dú)的步驟中沿著滲透梯度下行，但總體而言，由于將鈉離子泵入細(xì)胞間液中，水通常逆著滲透梯度行進(jìn)運(yùn)輸。盡管與腸腔內(nèi)的液體相比，毛細(xì)血管的血液是低滲的，但這允許大腸吸收水分。人類結(jié)腸約1.5 m長，每天吸收1.5 L水，對水分回收有著重要的作用。

盡管人們對于駱駝的水代謝能力有所了解，但目前尚未有研究揭示其水代謝的機(jī)制。本研究對極端缺水環(huán)境下的駱駝結(jié)腸進(jìn)行基因表達(dá)測序與分析，為人們進(jìn)一步探討缺水環(huán)境下駱駝結(jié)腸的水適應(yīng)方式提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)及理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動物處理與樣品采集 選取6峰6～9歲 的成年阿拉善雙峰駝，隨機(jī)分為2組，第一組為對照組(colon1_3)，正常采食飼料與水；第二組為禁水組(colon3)，不給駱駝飲水，其他處理(飼草量)與對照組相同，禁水24 d。

1.1.2 儀器與試劑 樣品總RNA提取采用TaKaRa公司RNA提取試劑盒(TaKaRa RNAiso Plus 9108)。總RNA質(zhì)控試劑盒為RNA nanoAssay(Agilent 公司)。使用RNase Free Water溶解樣品，檢測試劑盒為RNA6000，檢測儀使用Agilent 2100。

1.2 方法

1.2.1 組織RNA提取及RNA質(zhì)量檢測 分別采集6峰駱駝的結(jié)腸組織，置于液氮中充分研磨，按照TaKaRa公司RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，提取總RNA樣品經(jīng)Agilent 2100檢測儀檢測，檢測樣品總量、RNA完整度以及OD值。

1.2.2 文庫構(gòu)建 樣品檢測合格后，poly A作為mRNA序列中的特征序列，以此特征來捕獲組織中所有的mRNA，方法是用帶有Oligo(dT)的磁珠富集雙峰駝樣本mRNA。隨后加入片段緩沖液將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物(random hexamers)合成一鏈cDNA，然后加入緩沖液、dNTPs和DNA polymerase I合成二鏈cDNA，隨后利用AMPure XP beads純化雙鏈cDNA。純化的雙鏈cDNA再進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測序接頭，然后用AMPure XP beads進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行PCR富集得到最終的cDNA文庫。

1.2.3 文庫檢測 測序文庫構(gòu)建完成后，先使用Qubit2.0進(jìn)行初步定量，稀釋文庫至1 ng·μL-1，隨后使用Agilent 2100對文庫的插入片段大小進(jìn)行檢測，符合預(yù)期后，使用qPCR方法對文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量(文庫有效濃度>2 nmol·L-1)，以保證文庫質(zhì)量。

1.2.4 測序與原始測序數(shù)據(jù)過濾評估 文庫檢測合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求，將各組中3峰動物取等量RNA混池后進(jìn)行測序。測序獲得原始數(shù)據(jù)，由于測得的堿基存在可能的錯誤，每個堿基測序錯誤率通過Q30進(jìn)行過濾。同時GC含量分布檢查用來評估有無AT、GC 分離現(xiàn)象，判斷是否在測序或文庫構(gòu)建過程中對堿基造成影響。本研究根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)使用FastQC軟件衡量測得的堿基質(zhì)量。

1.2.5 參考序列比對 本研究的物種屬于哺乳動物，所以選取使用軟件TopHat2，參數(shù) mismatch為2，其余選用默認(rèn)參數(shù)，選取NCBI已有雙峰駝基因組，版本號Ca_bactrianus_MBC_1.0(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/767/855/GCF_ 000767855.1_Ca_bactrianus_MBC_1.0/GCF_000767855.1_Ca_bactrianus_MBC_1.0_genomic.fna.gz)，基因組GFF文件(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/767/855/GCF_ 000767855.1_Ca_bactrianus_MBC_1.0/GCF_000767855.1_Ca_bactrianus_MBC_1.0_genomic.gff.gz)。將過濾后的測序序列進(jìn)行基因組定位分析。

1.2.6 基因表達(dá)水平分析及差異表達(dá)分析 本研究采用HTSeq(v0.6.1)，參數(shù)為-munion定量基因表達(dá)水平。獲得基因表達(dá)量列表，采用TMM和DEGSeq(1.10.1)對基因進(jìn)行差異表達(dá)分析，并根據(jù)|log2(Fold change)| > 1，且q-value< 0.005篩選顯著差異表達(dá)基因。

1.2.7 差異表達(dá)基因GO富集分析 通過軟件GOSeq對colon1-3與colon3比較得到的差異表達(dá)基因集合進(jìn)行GO富集分析，基于GO數(shù)據(jù)庫的功能，本研究對差異表達(dá)基因按照分子功能(molecular function)、生物過程(biological process)和細(xì)胞組成(cellular component)3個部分進(jìn)行分類。顯著富集的條件為校正P-value < 0.05。

1.2.8 差異表達(dá)基因KEGG富集分析 本研究使用KOBAS(2.0)(http://kobas. cbi. pku.edu.cn/download.php)進(jìn)行pathway富集分析，由于pathway顯著性富集分析以KEGG 數(shù)據(jù)庫中pathway為單位，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個基因組背景相比，在差異表達(dá)基因中顯著性富集的pathway，故將校正P-value < 0.05作為條件來篩選顯著富集通路。

2 結(jié) 果

2.1 禁水組與對照組雙峰駝結(jié)腸組織RNA提取質(zhì)量檢測

禁水組與對照組結(jié)腸組織提取RNA后，經(jīng)Agilent 2100檢測樣品濃度、RNA完整度(RIN值)及28S∶18S。禁水組與對照組的RNA總量分別為24.12和54.00 μg，大于10 μg，RIN值分別為8.6和8.1，均大于7，28S∶18S均為1.5，可用于后續(xù)試驗(yàn)分析。

2.2 禁水組與對照組雙峰駝結(jié)腸組織RNA測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

通過Hiseq 2000測序平臺，本研究獲得對照組結(jié)腸組織總片段數(shù)(clean reads) 51 533 346條，Q30為91.28%，GC含量為48.32%；禁水組結(jié)腸組織總片段數(shù)(clean reads)為50 771 578條，Q30為91.02%，GC含量為53.62%(表1)，測得的數(shù)據(jù)總量和質(zhì)量合格。

表1對照組與試驗(yàn)組結(jié)腸RNA測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

Table1SequencingdatastatisticsofcolonRNAofbactriancamelinthecontrolandexperimentalgroups

樣本Sample name總片段數(shù)/條Clean reads測序錯誤率/%Error rate質(zhì)量值/%Q30GC含量/%GC content對照組colon1_3-1 25 766 6730.0392.1648.27對照組colon1_3-2 25 766 6730.0390.4148.38試驗(yàn)組colon3-1 25 385 7890.0392.6253.57試驗(yàn)組colon3-2 25 385 7890.0489.4353.68

2.3 禁水組與對照組雙峰駝結(jié)腸組織測得reads與參考基因組比對分析

將測得的reads與參考基因組進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，禁水組結(jié)腸與參考基因組的總比對率為90.58%，單一位點(diǎn)比對率為89.08%；對照組與參考基因組的總比對率為92.48%，單一位點(diǎn)比對率為91.62%(表2)。

表2樣品與參考基因組比對

Table2Samplealignmenttoreferencegenome

測序結(jié)果統(tǒng)計(jì)Sequencing results statistics對照組(占總reads比例/%)colon1_3(the proportion of total reads) 禁水組(占總reads比例/%)colon3(the proportion of total reads) 測序總片段數(shù) Total reads51 533 34650 771 578總比對數(shù)目Total mapped47 658 974 (92.48)45 987 211 (90.58)多位點(diǎn)比對數(shù) Multiple mapped443 387 (0.86)762 060 (1.50)單一位點(diǎn)比對Uniquely mapped47 215 587 (91.62)45 225 151 (89.08)

2.4 禁水組與對照組雙峰駝結(jié)腸組織基因表達(dá)定量及差異表達(dá)基因分析

本研究統(tǒng)計(jì)了各表達(dá)區(qū)間基因在禁水組與對照組中的分布情況，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)值RPKM大于1代表基因表達(dá)，本研究結(jié)果顯示，對照組與禁水組表達(dá)基因數(shù)量分別為總量的69.29%和66.35%(表3)。

本研究將|log2(Fold change)| > 1 且 q-value<0.005設(shè)定為差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)，禁水組與對照組經(jīng)過篩選后，發(fā)現(xiàn)顯著差異表達(dá)基因2 122個。其中禁水組上調(diào)表達(dá)基因?yàn)?13個，下調(diào)表達(dá)基因1 309個(圖1)。

表3不同表達(dá)區(qū)間基因數(shù)量統(tǒng)計(jì)

Table3Statisticsofthenumberofgenesindifferentexpressionintervals

表達(dá)值區(qū)間RPKM interval對照組(占總表達(dá)區(qū)間比例/%)colon1_3禁水組(占總表達(dá)區(qū)間比例/%)colon30～16 629(30.71)7 263(33.65)1～32 800(12.97)3 014(13.96)3～156 286(29.12)6 003(27.81)15～604 299(19.92)3 815(17.67)>601 571(7.28)1 490(6.90)

圖1 禁水組與對照組差異表達(dá)基因分布
Fig.1 Distribution of differentially expressed genes in no drinking water group and control group

2.5 禁水組與對照組雙峰駝結(jié)腸組織差異表達(dá)基因的GO分析

將差異表達(dá)基因按照GO條目進(jìn)行分類，根據(jù)校正P-value<0.05篩選顯著富集GO條目，其值越小說明統(tǒng)計(jì)結(jié)果越顯著。結(jié)果顯示，禁水組下調(diào)表達(dá)基因富集到的GO條目共2 274條，其中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義的為 30條，包括細(xì)胞組分富集條目8條(胞內(nèi)部分、大分子復(fù)合物、細(xì)胞器、細(xì)胞質(zhì)、胞內(nèi)、胞內(nèi)細(xì)胞器、層粘連蛋白-1復(fù)合物、層粘連蛋白復(fù)合物)，生物過程4條(細(xì)胞遷移、細(xì)胞黏附調(diào)節(jié)、細(xì)胞遷移調(diào)節(jié)、胚胎發(fā)育調(diào)節(jié))，分子功能18條(核苷酸結(jié)合、核苷磷酸結(jié)合、水解酶活性(作用于酸酐)、焦磷酸酶活性 、陰離子結(jié)合、嘌呤核糖核苷三磷酸結(jié)合、核苷-三磷酸酶活性、嘌呤核苷結(jié)合、核糖核苷結(jié)合、嘌呤核糖核苷結(jié)合、含磷酸酐中的水解酶活性(作用于酸酐) 、嘌呤核糖核苷酸結(jié)合、核糖核苷酸結(jié)合、有機(jī)環(huán)狀化合物結(jié)合、嘌呤核苷酸結(jié)合、小分子結(jié)合、核苷結(jié)合、雜環(huán)化合物結(jié)合)(圖2)。禁水組上調(diào)表達(dá)基因富集到的GO 條目共1 958 條，未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的GO條目。

圖2 禁水組下調(diào)表達(dá)基因GO分類
Fig.2 GO classification of down-regulated expression genes in no drinking water group

2.6 禁水組與對照組雙峰駝結(jié)腸組織差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

將校正后的P-value (q值)< 0.05作為顯著pathway的篩選標(biāo)準(zhǔn)，KEGG分析獲得禁水組下調(diào)表達(dá)基因富集的代謝通路20個(圖3)，顯著富集的包括剪接體(spliceosome)、蛋白輸出(protein export)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的蛋白質(zhì)過程(protein processing in endoplasmic reticulum)、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)(RNA transport)、核糖體生物合成(ribosome biogenesis in eukaryotes)、mRNA監(jiān)控(mRNA surveillance)(圖3、表4)。

禁水組上調(diào)表達(dá)基因富集到了20個通路，沒有發(fā)現(xiàn)有顯著富集的通路，結(jié)果顯示局部黏連(focal adhesion)通路有較高的富集程度(圖4)。

富集因子為該pathway中富集到的差異表達(dá)基因個數(shù)與注釋基因個數(shù)的比值，該值越大，表示富集的程度越高。q值是做過多重假設(shè)檢驗(yàn)校正之后的P-value，此值越接近于零，表示該富集通路越顯著。下圖同
Enrich factor is the ratio of the number of differentially expressed genes enriched in the pathway to the number of annotated genes, the larger the value, the greater the degree of enrichment. The q-value is the corrected P-value, the q-value is closer to zero, the pathway is more significant enriched. The same as the following figure
圖3 禁水組下調(diào)表達(dá)基因KEGG通路分析
Fig.3 Statistics of pathway enriched by down-regulated expression genes in no drinking water group

2.7 禁水組與對照組雙峰駝結(jié)腸組織缺水適應(yīng)基因篩選

根據(jù)禁水組與對照基因表達(dá)分析，本研究篩選出駱駝結(jié)腸組織在缺水條件下與缺水適應(yīng)相關(guān)的基因。其中剪接體途徑中的20個基因、蛋白質(zhì)排出途徑中的11個基因、蛋白質(zhì)加工途徑中5個基因和RNA轉(zhuǎn)運(yùn)途徑中的4個基因在禁水條件下，在駱駝結(jié)腸顯示出顯著的下調(diào)(表5)。

3 討 論

3.1 樣品測序與參考基因組比對

雙峰駝結(jié)腸組織禁水組與對照組參考基因組比對的總比對率分別為90.58%、92.48%，其中多位點(diǎn)比對率為1.5%、0.86%，唯一位點(diǎn)比對率分別為89.08%、91.62%。其中唯一位點(diǎn)比對率反映了測序建庫過程的規(guī)范性。本研究中，唯一位點(diǎn)比對率高于85%，說明研究中使用的測序質(zhì)量良好，參考基因組選擇合適，并且參考基因組完整，未出現(xiàn)因參考基因組不完整或選擇版本不準(zhǔn)確導(dǎo)致比對目標(biāo)的缺失和總比對率的下降；RNA提取質(zhì)量優(yōu)異，建庫過程合乎規(guī)范，獲得了合乎測序要求的RNA 片段，在建庫或RNA 提取過程中未出現(xiàn)RNA降解，避免了多位點(diǎn)比對的比例增加和基因表達(dá)定量準(zhǔn)確性差的現(xiàn)象。測序結(jié)果符合后續(xù)研究需求。

3.2 雙峰駝結(jié)腸組織禁水組與對照組差異表達(dá)基因的GO富集分析

本研究針對禁水組上調(diào)和下調(diào)表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析，對所有差異基因進(jìn)行細(xì)胞組分、分子功能和生物過程分類識別。其中下調(diào)表達(dá)基因顯著富集到核苷酸結(jié)合、核苷磷酸結(jié)合、嘌呤核糖核苷三磷酸結(jié)合、核苷三磷酸酶活性、核糖核苷結(jié)合等分子功能，這些功能多與細(xì)胞的基礎(chǔ)代謝功能相關(guān)，例如核苷酸結(jié)合直接涉及細(xì)胞自身所有的功能，包括細(xì)胞分裂、增殖、分化等。說明在缺水環(huán)境下，駱駝結(jié)腸RNA合成功能受到影響，處于下調(diào)趨勢。這表明，在缺水環(huán)境下，駱駝結(jié)腸從RNA相關(guān)功能階段降低細(xì)胞代謝，從而使得結(jié)腸組織適應(yīng)此環(huán)境。

圖4 禁水組上調(diào)表達(dá)基因KEGG通路分析
Fig.4 Statistics of pathway enriched by up-regulated expression genes in no drinking water group

表4禁水組下調(diào)表達(dá)基因顯富集通路

Table4Significantlyenrichedpathwaysbydown-regulatedexpressiongenesinnodrinkingwatergroup

顯著富集通路Pathway參與基因數(shù)Sample genes number背景基因數(shù)Background genes number校正后的P值CorrectedP-value參與基因Gene剪接體Spliceosome391272.590 7×10-9HNRNPM、LSM8、SNRPG、AQR、PRPF38B、TRA2B、MAGOHB、HNRNPA1、CDC40、SNRPB2、SF3B1、THOC2、LSM3、TRA2A、PLRG1、PLRG1、DDX46、RBM25、SYF2、LSM6、SNRPD1、SRSF1、TCERG1、PRPF40A、HNRNPA3、SRSF7、SNRNP27、HSPA8、SRSF5、HNRNPU、SMNDC1、SMNDC1、RBM8A、SRSF3、LOC102519550、U2SURP、SNRPE

(續(xù)表4 Continued)

表5雙峰駝缺水適應(yīng)基因

Table5Waterdeficiencyadaptivegenesscreenedinbactriancamel

蛋白名稱Protein name組織表達(dá)類型Up- or down-regulation in colon3log2(差異倍數(shù))log2(FC)參與通路PathwayPrp5下調(diào)-1.63SpliceosomePrp17下調(diào)-1.47SpliceosomeHSP73下調(diào)-1.13SpliceosomeAQR下調(diào)-1.21SpliceosomeSyf下調(diào)-1.63SpliceosomeTHOC下調(diào)-1.67SpliceosomeMagoh下調(diào)-2.88SpliceosomeY14下調(diào)-1.22SpliceosomeSR下調(diào)-1.79SpliceosomeHnRNPs下調(diào)-2.36SpliceosomePrp28下調(diào)-1.12SpliceosomeSR140下調(diào)-1.42SpliceosomeSnRNP27下調(diào)-1.36SpliceosomeCA150下調(diào)-1.26SpliceosomeP68下調(diào)-1.94SpliceosomeS164下調(diào)-1.42SpliceosomeSPF30下調(diào)-1.19SpliceosomeFBP11下調(diào)-1.73SpliceosomeSF3下調(diào)-1.21SpliceosomeSm下調(diào)-2.06SpliceosomeSEC62下調(diào)-1.86Protein exportSEC63下調(diào)-1.95Protein exportSEC61下調(diào)-1.33Protein exportBiP下調(diào)-1.39Protein exportSRP9下調(diào)-1.68Protein exportSRP72下調(diào)-1.03Protein exportSRP19下調(diào)-2.92Protein exportSRP54下調(diào)-1.89Protein exportSRPRB下調(diào)-1.20Protein exportSPCS3下調(diào)-1.30Protein exportSEC11下調(diào)-1.88Protein exportSAR1下調(diào)-1.35Protein processing in endoplasmic reticulumSec23下調(diào)-2.13Protein processing in endoplasmic reticulumERP57下調(diào)-1.08Protein processing in endoplasmic reticulumOSTs下調(diào)-1.03Protein processing in endoplasmic reticulumGRP94下調(diào)-1.77Protein processing in endoplasmic reticulumCRM1下調(diào)-2.15RNA transportNMD3下調(diào)-1.33RNA transportPHAX下調(diào)-1.99RNA transportExpt下調(diào)-1.43RNA transport

3.3 雙峰駝結(jié)腸組織禁水組與對照組差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

KEGG分析通過超幾何檢驗(yàn)，確定差異表達(dá)基因參與的主要代謝通路和信號通路。本研究中，通過對差異表達(dá)基因的信號通路分析，顯著富集通路包括剪接體(spliceosome)、蛋白輸出(protein export)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的蛋白質(zhì)加工(protein processing in endoplasmic reticulum)、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)(RNA transport)、核糖體生物合成(ribosome biogenesis in eukaryotes)。

3.3.1 剪接體途徑 剪接體途徑是真核生物中轉(zhuǎn)錄后mRNA前體經(jīng)過剪接體的加工，將內(nèi)含子去掉的過程[5]。該過程是真核生物的一種特有現(xiàn)象，在真核生物，細(xì)胞剪接體本身是一個蛋白復(fù)合體[6]。本研究鑒定到該復(fù)合體家族中多個基因的低表達(dá)，這表明結(jié)腸組織顯著降低了轉(zhuǎn)錄到翻譯過程的活性，由于剪接體功能的降低直接導(dǎo)致可用成熟mRNA 的減少，成熟的mRNA是蛋白質(zhì)合成所必須的，這意味著可用于下游翻譯的模板減少，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成活動的減少。

3.3.2 蛋白質(zhì)輸出 蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成后，經(jīng)過蛋白質(zhì)輸出功能將蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外部，是一種細(xì)胞內(nèi)的主動轉(zhuǎn)運(yùn)[7]。Sec蛋白依賴性的蛋白質(zhì)輸出系統(tǒng)將協(xié)助新合成的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)穿過細(xì)胞膜[8]。本研究中，蛋白質(zhì)輸出途徑低表達(dá)基因的顯著富集說明結(jié)腸細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)輸功能下降，意味著結(jié)腸在缺水條件下降低了蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，這可能與蛋白質(zhì)合成減少相關(guān)。

3.3.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的蛋白質(zhì)加工 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為一種亞細(xì)胞器，主要負(fù)責(zé)蛋白的正確折疊，將折疊后的蛋白包裝成運(yùn)輸囊泡，轉(zhuǎn)運(yùn)給高爾基體[8-10]。本研究中，下調(diào)表達(dá)基因顯著富集于該通路表明在缺水的環(huán)境下，結(jié)腸蛋白質(zhì)合成作用降低，可能是在缺水條件下組織為了減少不必要的物質(zhì)消耗。

3.3.4 RNA轉(zhuǎn)運(yùn) RNA轉(zhuǎn)運(yùn)過程是從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)RNA轉(zhuǎn)運(yùn)的基礎(chǔ)，在細(xì)胞核中產(chǎn)生的RNA不能直接穿過核孔而需要通過移動輸出受體穿過核孔復(fù)合物，細(xì)胞內(nèi)多數(shù)RNA都是由特定的輸出受體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)[11-12]。本研究中，RNA轉(zhuǎn)運(yùn)過程被低表達(dá)基因的顯著富集表明，結(jié)腸在缺水環(huán)境下，該功能的降低將直接導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)合成的RNA 不能轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，這也將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)可用于蛋白質(zhì)合成的RNA 減少。

3.3.5 核糖體生物合成 核糖體作為制造蛋白質(zhì)的工廠，其運(yùn)行正常與否直接影響后續(xù)蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)，該過程中基因的顯著下調(diào)表達(dá)說明，結(jié)腸為適應(yīng)缺水環(huán)境，從核糖體合成的根本上降低了生物合成。

3.3.6 mRNA監(jiān)控 mRNA監(jiān)控途徑是檢測和降解異常mRNA的質(zhì)量控制機(jī)制[13]。當(dāng)細(xì)胞RNA合成過程中，因外部環(huán)境造成新合成RNA的損傷時，該功能發(fā)揮作用[14-15]。例如，該途徑能夠消除過早的翻譯終止密碼子作用[16-17]。本研究中,該途徑得到顯著富集,表明試驗(yàn)條件下水脅迫導(dǎo)致了該途徑的低表達(dá)，這與之前RNA轉(zhuǎn)運(yùn)和剪接體功能下降直接相關(guān)。表明水脅迫下，不僅RNA的成熟過程和轉(zhuǎn)運(yùn)過程被抑制，與RNA相關(guān)的質(zhì)量監(jiān)控也受到限制。

3.4 雙峰駝結(jié)腸組織參與缺水環(huán)境適應(yīng)的基因

P68蛋白是RNA解旋酶DEAD盒家族的成員[18]，作為連接分子參與多種細(xì)胞過程，促進(jìn)與許多其他因子的相互作用[19]。 該蛋白質(zhì)參與包括RNA結(jié)構(gòu)改變的途徑，作為轉(zhuǎn)錄的共調(diào)節(jié)因子，在剪接調(diào)節(jié)劑以及小的非編碼RNA的加工中起作用[20]。該家族成員含有9個保守基序，包括保守的Asp-Glu-Ala-Asp(DEAD)基序，對ATP結(jié)合和水解以及RNA結(jié)合和解旋活性有很重要的作用[18]。

HSP73蛋白為熱休克蛋白70(HSP70)家族成員，屬熱休克同源蛋白[21]，作為分子伴侶發(fā)揮作用[22]。同時，在細(xì)胞膜組分通過細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)中，該蛋白在囊泡的分解中起ATP酶的作用[23]。HnRNPs為異質(zhì)核糖核蛋白， 作為RNA結(jié)合蛋白，它們與異源核RNA(hnRNA)復(fù)合[24-25]。這些蛋白質(zhì)與細(xì)胞核中的前mRNA相關(guān)，并且似乎影響前mRNA加工和mRNA代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)[26]。hnRNP蛋白質(zhì)具有不同的核酸結(jié)合特性。這種蛋白質(zhì)也被認(rèn)為在細(xì)胞周期進(jìn)程中起作用。

BiP蛋白是熱休克蛋白70(HSP70)家族的成員，它位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)的內(nèi)腔中，并參與ER中蛋白質(zhì)的折疊和裝配[27-28]。由于這種蛋白質(zhì)與許多ER蛋白質(zhì)相互作用，它可能在監(jiān)測細(xì)胞的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)中起關(guān)鍵作用[29]。

ERP57基因編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)，其與凝集素伴侶鈣網(wǎng)蛋白和鈣聯(lián)蛋白相互作用以調(diào)節(jié)新合成的糖蛋白的折疊[30]。 這種蛋白質(zhì)曾被認(rèn)為是一種磷脂酶; 然而，已經(jīng)證明該蛋白質(zhì)實(shí)際上具有蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶活性。 據(jù)認(rèn)為，凝集素和這種蛋白質(zhì)的復(fù)合物通過促進(jìn)其糖蛋白底物中二硫鍵的形成來介導(dǎo)蛋白質(zhì)折疊。 該蛋白質(zhì)還起分子伴侶的作用，可防止蛋白質(zhì)聚集體的形成[31]。CRM1 作為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，是一種介導(dǎo)富含亮氨酸核輸出信號轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)[32]，該蛋白特異性抑制Rev和U snRNA的核輸出[33]。通過控制細(xì)胞周期蛋白MPAK和MAPKAP激酶2的定位參與細(xì)胞過程的控制，該蛋白還調(diào)節(jié)NFAT和AP-1[34]。Expt屬于RAN-GTPase輸出蛋白家族，其介導(dǎo)tRNA從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的輸出[35]。一旦輸出蛋白結(jié)合tRNA和GTP結(jié)合的RNA，就會發(fā)生tRNA向細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)[36]。Bms1可能編碼核糖體裝配蛋白，在酵母中存在的相似蛋白質(zhì)在35S-rRNA加工中起作用，其包括一系列對于形成40S核糖體至關(guān)重要的切割步驟[37]。

上述基因作為下調(diào)表達(dá)基因，涉及到了蛋白質(zhì)合成整個過程、核糖體轉(zhuǎn)運(yùn)、RNA運(yùn)出細(xì)胞核、蛋白質(zhì)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成、蛋白質(zhì)的定位、前體RNA的剪切與成熟、蛋白質(zhì)信號識別等。這些相關(guān)功能基因的低表達(dá)直接影響了下游基因從RNA到最終蛋白質(zhì)的翻譯過程。

4 結(jié) 論

本研究利用HiSeq 2000 高通量測序平臺對雙峰駝在正常飲水與極度缺水環(huán)境下的結(jié)腸組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，獲得高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄譜。研究發(fā)現(xiàn)，禁水環(huán)境下，結(jié)腸組織下調(diào)表達(dá)基因多于上調(diào)表達(dá)基因，下調(diào)表達(dá)基因多參與RNA加工和蛋白質(zhì)合成，這些功能有利于駱駝在缺水環(huán)境下，減少RNA的合成，降低結(jié)腸組織的代謝速率。