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    miRNA-375靶向磷脂酰肌醇激酶-3催化亞單位α對宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移的影響*

    2018-11-29 05:42:26秦海霞李少平張全華王世進(jìn)吳向暉
    關(guān)鍵詞:共轉(zhuǎn)染基因組靶向

    秦海霞,李少平,張全華,王世進(jìn),吳向暉

    [1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 婦科,河南 衛(wèi)輝 453100;2.河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院(河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院) 婦科,河南 洛陽 471003]

    盡管根治性手術(shù)聯(lián)合同步放化療治療早期宮頸癌(ⅡA期及以下)的治愈率達(dá)80%~95%,但中晚期及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移宮頸癌的局部控制率和總生存期仍不盡如人意[1]。因此,探尋更安全、有效的宮頸癌治療方案具有十分重要的臨床意義。微小RNA(microRNA,miRNA)作為內(nèi)源性非編碼小分子RNA,可通過與下游一個或多個靶基因的3'-非翻譯區(qū)(untranslated region, UTR)相結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá),從而參與細(xì)胞分化、增殖及凋亡等病理生理過程[2]。miRNAs參與調(diào)控惡性腫瘤發(fā)生與發(fā)展的觀點得到普遍認(rèn)同,其已成為腫瘤生物靶向治療的重要靶點[3]。miRNA-375是新發(fā)現(xiàn)的miRNA成員。研究證實,miRNA-375在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮類似抑癌基因的作用,但其分子機(jī)制尚未完全明確[4]。磷脂酰肌醇激酶3催化亞單位α(PIK3CA)是公認(rèn)的促癌基因,其基因突變所致的過表達(dá)可導(dǎo)致磷脂酰肌醇3-羥激酶(phosphatidyl Inositol 3-kinase, PI3K)的催化活性增強(qiáng),從而誘導(dǎo)細(xì)胞癌變。既往研究證實,PIK3CA在宮頸癌組織中高表達(dá),提示PIK3CA參與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展,而調(diào)控PIK3CA表達(dá)可能是宮頸癌靶向治療的新思路[5]。本研究前期采用miRNA靶基因預(yù)測發(fā)現(xiàn),miRNA-375與PIK3CA存在靶向關(guān)系,miRNA-375是否可通過靶向PIK3CA調(diào)控宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為尚未可知。本研究旨在探討miRNA-375靶向PIK3CA對宮頸癌細(xì)胞增殖及遷移的影響,以期為宮頸癌的臨床診療提供實驗依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    人宮頸癌細(xì)胞系SiHa購于美國ATCC,DMEM培養(yǎng)基、PBS、胰蛋白酶、胎牛血清購于美國Hyclone公司,MTT購自美國Sigma公司,LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試購自美國Invitrogen公司,PIK3CA單克隆抗體購自大連TaKaRa公司,雙熒光素酶試劑盒購自美國Promega公司,miRNA-375模擬基因、miRNA-375抑制劑、對照模擬基因、對照抑制劑購于美國Ambion公司。

    1.2 細(xì)胞分組

    常規(guī)復(fù)蘇SiHa細(xì)胞,用含有1%雙抗+10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞,37℃、5% 二氧化碳CO2恒溫培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期的SiHa細(xì)胞并接種于6孔培養(yǎng)板中,2×105個/孔,后細(xì)胞繼續(xù)置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,細(xì)胞隨機(jī)分為4組,每組3孔,即對照模擬基因組、對照抑制劑組、miRNA-375模擬基因組、miRNA-375抑制劑組,各組分別轉(zhuǎn)染對照模擬基因、對照抑制劑、miRNA-375模擬基因、miRNA-375抑制劑,細(xì)胞繼續(xù)置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,轉(zhuǎn)染結(jié)束后進(jìn)行后續(xù)實驗。

    1.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測miRNA-375表達(dá)

    收集各組細(xì)胞,采用RT-PCR法檢測miRNA-375表達(dá)。依據(jù)Trizol試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄總RNA至cDNA,后行RT-PCR(SYBR Green法),以U6為內(nèi)參。miRNA-375逆轉(zhuǎn)錄引物序列:5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTG GATACGAC-3';miRNA-375正向 5'-TTTGTTCGTTCG GCTCGC-3',反向 5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3';U6正向5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3',反向5'-AACG CTTCACGAATTTGCGT-3'。

    1.4 Western blot檢測PIK3CA蛋白表達(dá)

    收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞,提取細(xì)胞蛋白,測定樣品蛋白濃度,取適量樣品行SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜,將膜置于5%封閉液4℃封閉4 h,后依次加入PIK3CA單克隆抗體(1∶2 000)、二抗(1∶500)孵育,按ECL試劑盒說明書操作行電化學(xué)發(fā)光檢測,增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯色系統(tǒng)顯色。利用Gene Tools軟件分析蛋白條帶的灰度值,以β-actin作為內(nèi)參照,以蛋白灰度值/β-actin的灰度值的比值表示PIK3CA蛋白的相對表達(dá)量來進(jìn)行量化。

    1.5 MTT檢測細(xì)胞增殖活性

    收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞,將細(xì)胞置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng),分別于培養(yǎng)24、36及72 h時,離心棄上清液每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20μl,繼續(xù)37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)4 h,離心棄上清液,加入DMSO(100μl/每孔),振蕩至結(jié)晶物充分溶液,采用全自動酶標(biāo)儀測450 nm處光密度值(OD值)。

    1.6 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力

    收集各轉(zhuǎn)染細(xì)胞,將細(xì)胞置于恒溫培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)中繼續(xù)培養(yǎng),待細(xì)胞融合率達(dá)到90%左右時,用200 μl槍頭垂直于6孔板底部做橫線劃痕,之后細(xì)胞繼續(xù)置于恒溫培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2)中培養(yǎng),培養(yǎng)后24 h,于倒置光學(xué)顯微鏡下拍照(×100)觀察,利用Image J軟件測量劃痕區(qū)域?qū)挾?,并計算?xì)胞劃痕愈合率。

    1.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/h3>

    運用生物學(xué)信息軟件預(yù)測miRNA375的靶基因為 PIK3CA(http://www.targetscan.org/)。以人宮頸癌細(xì)胞基因組DNA為模板,構(gòu)建野生型PIK3CA 3'-UTR(PIK3CA-WT)質(zhì)粒、突變型 PIK3CA 3'-UTR(PIK3CAMut)。收集對數(shù)生長期的SiHa細(xì)胞,用DMEM培養(yǎng)液(10%胎牛血清+1%雙抗)將調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至2×105個/孔,將PIK3CA-WT、PIK3CA-Mut與miRNA-375模擬基因或?qū)φ漳M基因共轉(zhuǎn)染至SiHa,將細(xì)胞37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)48 h;測定細(xì)胞熒光素酶活性,海腎質(zhì)粒熒光值作為內(nèi)參。

    1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件,計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組測量數(shù)據(jù)間采用方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 驗證miRNA-375對PIK3CA的靶向作用

    生物信息學(xué)工具網(wǎng)站http://www.microRNA.org檢測結(jié)果顯示,miRNA-375與PIK3CA 3'-UTR間存在結(jié)合位點(見圖1A)。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示,miRNA-375模擬基因、PIK3CA-WT共轉(zhuǎn)染與對照模擬基因、PIK3CA-WT共轉(zhuǎn)染組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.985,P=0.000),miRNA-375模擬基因與PIK3CA-WT共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光活性低于對照模擬基因與PIK3CA-WT共轉(zhuǎn)染組;miRNA-375模擬基因、PIK3CA-Mut共轉(zhuǎn)染與對照模擬基因、PIK3CAMut共轉(zhuǎn)染組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.658,P=0.256),miRNA-375模擬基因與PIK3CA-Mut共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光活性與對照模擬基因與PIK3CA-Mut共轉(zhuǎn)染無差異(見圖1B)。

    2.2 轉(zhuǎn)染 miRNA-375 模擬基因 /miRNA-375 抑制劑對miRNA-375表達(dá)的影響

    PCR結(jié)果顯示,4組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=46.849,P=0.000)。其中,miRNA-375模擬基因組和對照模擬基因組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),轉(zhuǎn)染miRNA-375模擬基因后SiHa細(xì)胞miRNA-375表達(dá)高于對照模擬基因組;miRNA-375抑制劑組和對照抑制劑組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),轉(zhuǎn)染miRNA-375抑制劑后SiHa細(xì)胞miRNA-375表達(dá)低于對照抑制劑組。見圖2。

    2.3 miRNA-375對PIK3CA表達(dá)的影響

    圖2 各組細(xì)胞miRNA-375相對表達(dá)量比較

    Western blot結(jié)果顯示,4組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=94.388,P=0.000)。其中,miRNA-375模擬基因組和對照模擬基因組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),轉(zhuǎn)染miRNA-375模擬基因后PIK3CA蛋白表達(dá)低于對照模擬基因組;miRNA-375抑制劑組和對照抑制劑組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),轉(zhuǎn)染miRNA-375抑制劑后PIK3CA蛋白表達(dá)高于對照抑制劑組。見圖3。

    圖3 miRNA-375對PIK3CA表達(dá)的影響(Western blot)

    附表 4組細(xì)胞的增殖活性 (±s)

    附表 4組細(xì)胞的增殖活性 (±s)

    組別 24 h 48 h 72 h對照模擬基因組 0.41±0.06 0.65±0.07 0.87±0.05對照抑制劑組 0.42±0.04 0.66±0.09 0.86±0.07 miRNA-375模擬基因組 0.33±0.05 0.51±0.06 0.65±0.08 miRNA-375抑制劑組 0.49±0.09 0.83±0.10 1.25±0.12

    2.4 miRNA-375對SiHa細(xì)胞增殖的影響

    分別于培養(yǎng)后0、24、48及72 h采用MTT法檢測細(xì)胞增殖活性,4組具體OD值見附表。miRNA-375模擬基因組與對照模擬基因組24、48及72 h的細(xì)胞增殖活性比較,結(jié)果:①不同時間點間的細(xì)胞增殖活性有差異(F=38.685,P=0.000);②miRNA-375模擬基因組與對照模擬基因組的細(xì)胞增殖活性有差異(F=72.356,P=0.000),miRNA-375模擬基因組與對照模擬基因組比較,細(xì)胞增殖活性比較低,對細(xì)胞增殖活性影響較大。③miRNA-375模擬基因組與對照模擬基因組的細(xì)胞增殖活性變化趨勢有差異(F=9.865,P=0.000)。

    miRNA-375抑制劑組與對照抑制劑組24、48及72 h的細(xì)胞增殖活性比較,結(jié)果:①不同時間點間的細(xì)胞增殖活性有差異(F=32.105,P=0.000);②miRNA-375抑制劑組與對照抑制劑組的細(xì)胞增殖活性有差異(F=91.283,P=0.000),miRNA-375抑制劑組與對照抑制劑組比較,細(xì)胞增殖活性比較高,可增加細(xì)胞增殖活性。③miRNA-375抑制劑組與對照抑制劑組的細(xì)胞增殖活性變化趨勢有差異(F=12.359,P=0.000)。見圖4。

    圖4 各組細(xì)胞增殖活性比較

    2.5 miRNA-375對SiHa細(xì)胞遷移的影響

    圖5 各組細(xì)胞遷移能力比較 (×200)

    劃痕實驗檢測結(jié)果顯示,4組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=41.459,P=0.000)。其中,miRNA-375模擬基因組和對照模擬基因組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),轉(zhuǎn)染miRNA-375模擬基因后SiHa細(xì)胞遷移能力低于對照模擬基因組;miRNA-375抑制劑組和對照抑制劑組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),轉(zhuǎn)染miRNA-75 抑制劑后SiHa細(xì)胞遷移能力高于對照抑制劑組。見圖5。

    3 討論

    miRNA廣泛參與基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控,而其失衡表達(dá)所致的基因轉(zhuǎn)錄異常是介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移的重要因素,也是促使惡性惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[6]。隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入,以miRNA靶向治療為主的新型治療方案為包括宮頸癌在內(nèi)的惡性腫瘤臨床治療提供了新的思路[7-8]。

    miRNA-375已被證實參與多種惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展,并在其中發(fā)揮促癌或抑癌基因作用。SZCZYRBA等[9]研究表明,前列腺癌組織中miRNA-375表達(dá)高于正常前列腺組織(P<0.05),且miRNA-375表達(dá)高表達(dá)與患者臨床病理特征存在相關(guān)性,提示miRNA-375可能在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮促癌作用。XU等[10]研究發(fā)現(xiàn),胃癌組織中miRNA-375表達(dá)低于正常胃組織(P<0.05),而過表達(dá)miRNA-375可有效抑制胃癌細(xì)胞侵襲和遷移,其機(jī)制與靶向Janus激酶2(JAK2)有關(guān),提示miRNA-375可通過靶向調(diào)控下游靶基因抑制胃癌進(jìn)展。MAO等[11]研究顯示,與正常組織相比較,結(jié)直腸癌組織中miRNA-375呈現(xiàn)低表達(dá)(P<0.05),轉(zhuǎn)染miRNA-375模擬基因可使直腸癌細(xì)胞中miRNA-375過表達(dá),并可通過靶向調(diào)控KLF4抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖,提示miRNA-375可能在結(jié)直腸癌中發(fā)揮抑癌作用。而本研究結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miRNA-375模擬基因可使宮頸癌細(xì)胞SiHa中miRNA-375表達(dá)增加,同時使細(xì)胞增殖及遷移能力降低,反之亦然,提示miRNA-375在宮頸癌中發(fā)揮著抑癌作用,與YU等[12]研究結(jié)論一致。

    PIK3CA定位于3號染色體長臂(3q26.3),大小為34 kb,包括20個外顯子,其可通過編碼PI3K的p110催化亞單位,促使AKT磷酸化,介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo),破壞正常細(xì)胞分化、增殖及凋亡等過程,從而促使正常細(xì)胞癌變[13-14]。BERTELSEN等[15]通過檢測宮頸癌組織中磷酸化AKT和PIK3CA表達(dá)發(fā)現(xiàn),磷酸化AKT陽性表達(dá)與PIK3CA復(fù)制數(shù)增加呈正相關(guān),提示PIK3CA可能通過促進(jìn)AKT磷酸化,激活PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而促進(jìn)宮頸癌發(fā)生與發(fā)展。上述研究提示,PIK3CA可能是宮頸癌基因治療中的一個重要靶點。本研究結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miRNA-375 模擬基因可使SiHa細(xì)胞中PIK3CA表達(dá)得到抑制,而轉(zhuǎn)染miRNA-375抑制劑則可使PIK3CA表達(dá)提高。故推測,在宮頸癌中miRNA-375對PIK3CA具有負(fù)向調(diào)控作用。進(jìn)一步利用基因軟件預(yù)測和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實,miRNA-375可通過作用于PIK3CA 3'-UTR,實現(xiàn)對PIK3CA的靶向作用。此外,本研究還觀察到,轉(zhuǎn)染miRNA-375模擬基因可抑制PIK3CA表達(dá),且隨著PIK3CA表達(dá)的降低與SiHa細(xì)胞增殖及遷移能力降低,提示過表達(dá)miRNA-375可通過靶向抑制PIK3CA抑制宮頸癌細(xì)胞增殖及遷移,反之亦然。故推測,miRNA-375靶向調(diào)控其下游靶基因PIK3CA是其參與宮頸癌增殖及遷移的重要作用機(jī)制。

    綜上所述,miRNA-375可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖及遷移,其機(jī)制可能與靶向調(diào)控PIK3CA有關(guān)。

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