加壓毛細管電色譜法分離檢測薯片中丙烯酰胺的含量

馮 軍，肖曉茹，李利軍2,,*，程 昊2,，黃文藝2,，李彥青2,，孔紅星2,

（1.廣西科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣西 柳州 545005；2.廣西科技大學(xué) 廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西高校糖資源加工重點實驗室，廣西 柳州 545006；3.廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006）

2002年瑞典國家食品局報道了熱加工食品中產(chǎn)生比飲用水中含量高500多倍的丙烯酰胺，隨即引起了全球的廣泛關(guān)注[1]。含淀粉類食品在高溫加熱過程中易產(chǎn)生高含量的丙烯酰胺[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，丙烯酰胺具有遺傳毒性、神經(jīng)毒性，可誘發(fā)動物機體癌變，是一種具有潛在致癌性的物質(zhì)[4-5]。1994年國際癌癥機構(gòu)就將丙烯酰胺列為人類潛在致癌物[6]，因此對食品中丙烯酰胺的含量控制具有十分重要的意義。

目前用于食品中丙烯酰胺的檢測方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜-質(zhì)譜法、高效液相色譜法和毛細管電泳技術(shù)等[7-13]。氣相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜-質(zhì)譜法靈敏度和準(zhǔn)確度雖然較高，但一般需要衍生，操作繁瑣，對設(shè)備要求很高。而高效液相色譜法雖最為常用，但由于食品基體復(fù)雜，樣品預(yù)處理一般采用固相萃取法，以避免雜質(zhì)干擾。這使得樣品預(yù)處理步驟繁瑣、復(fù)雜，成本較高、分析周期長。Zhou Xun等[13]采用膠束毛細管電泳對薯片中的丙烯酰胺進行了分離測定。該方法雖然避免了固相萃取的樣品預(yù)處理，但由于在電泳緩沖溶液中加入了十二烷基硫酸鈉作為準(zhǔn)固定相以實現(xiàn)電泳分離，導(dǎo)致了其精密度不高、重現(xiàn)性略差。

與上述方法相比較，加壓毛細管電色譜（pressurized capillary electrochromatography，pCEC）法具有高效液相色譜與毛細管電泳的雙重分離機理，兼具兩者的優(yōu)勢，根據(jù)待測物質(zhì)分配系數(shù)不同以及電泳淌度的差異，對樣品進行快速高效分離，具有選擇性好、柱效高、分離快速等優(yōu)點[14]。因此，pCEC尤其適于基體復(fù)雜、難于分離的多組分樣品的分離測定。目前，pCEC已廣泛應(yīng)用于環(huán)境分析[15]、食品安全檢測[16-20]、生物檢測[21-22]、藥物分析及中藥分析[23-29]等研究領(lǐng)域。

本實驗以薯片中微量丙烯酰胺為研究對象，將pCEC技術(shù)應(yīng)用于油炸薯片中丙烯酰胺的含量測定，在流動相為乙腈-15 mmol/L NaH2PO4（pH 4.7）緩沖鹽溶液（15∶85，V/V）、流速0.04 mL/min、分離電壓-2 kV、紫外檢測波長202 nm的條件下，薯片中的丙烯酰胺與干擾物質(zhì)分離良好、結(jié)果準(zhǔn)確，克服了常規(guī)檢測方法存在的不足之處，同時拓展了pCEC法在食品安全檢驗中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丙烯酰胺對照品（純度≥98%） 上海阿拉丁生化科技有限公司；4 種不同品牌的薯片樣品 柳州市萬達商業(yè)廣場超市；磷酸二氫鈉（分析純） 廣東光華科技有限公司；正己烷、乙醇（均為分析純） 成都市科農(nóng)化工試劑廠；甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國Merck公司；實驗用水為二次蒸餾水。所用的試劑和溶液在進入pCEC儀之前用0.22 μm微孔濾膜過濾，超聲除氣。

1.2 儀器與設(shè)備

TriSepTM-2100 pCEC 上海通微分析技術(shù)有限公司；HW-2000色譜工作站 上海千譜軟件有限公司；SZ-93型自動雙重水蒸餾器 上海亞榮生化儀器廠；UV-2102PC型紫外-可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；DL-60D型80 W超聲波清洗器 上海之信儀器有限公司；Avanti J-HC型高速冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司；PHS-25CW型實驗室pH計 上海般特儀器有限公司；XW-80A型渦旋混合器 上海精科實業(yè)有限公司；0.22 μm尼龍66針式過濾器 天津市津騰實驗設(shè)備有限公司；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵 上海錦賦實驗儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 對照溶液配制

稱取0.008 0 g丙烯酰胺對照品于棕色容量瓶中，用二次蒸餾水溶解并稀釋至100 mL，配制成80 μg/mL的對照品儲備液，作為100%對照品工作液，用0.22 μm濾膜過濾，置于4 ℃冰箱中避光保存。

1.3.2 薯片樣品預(yù)處理

分別取市場上4 種不同品牌的薯片適量，研磨成粉。準(zhǔn)確稱取3.00 g（精確到0.01 g）已研磨的各種薯片樣品分別置于50 mL的具塞離心管中，加入20 mL水和少量正己烷除酯，超聲溶解30 min，置于高速冷凍離心機中，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，吸取下層水相5 mL，于離心機0 ℃、10 000 r/min離心10 min，收集上層清液3 mL，用0.22 μm濾膜過濾，放置冰箱中4 ℃避光保存。

1.3.3 pCEC條件的優(yōu)化

色譜柱選用C18毛細管填充柱，柱子總長為45 cm，有效長度為20 cm，內(nèi)徑為100 μm，ODS填料3 μm；流動相：比較有機溶劑種類（甲醇、乙腈）、有機溶劑體積分?jǐn)?shù)（10%、15%、20%）、NaH2PO4緩沖鹽溶液濃度（10、15、20 mmol/L）及pH值（4.0、4.7、6.0、7.0）、分離電壓（6、4、2、0、-2、-4 kV）各條件下對薯片樣品中丙烯酰胺保留時間和分離度的影響；檢測波長：對丙烯酰胺對照品溶液進行全波長掃描（190～400 nm），確定樣品的檢測波長；進樣量40 μL，分流閥壓力4.5 MPa；電壓施加在毛細管的出口端，進口端接地。

1.3.4 pCEC分析方法學(xué)驗證

1.3.4.1 線性關(guān)系與檢出限

取不同體積（0.25、0.5、1.0、2.0、2.5、4.0 mL）的1.3.1節(jié)對照溶液配制的丙烯酰胺100%對照品工作液，用超純水定容于10 mL容量瓶中，渦旋振蕩搖勻，配制成體積分?jǐn)?shù)分別為2.5%、5%、10%、20%、25%、40%系列對照品工作液，分別進行pCEC分析。計算丙烯酰胺的線性范圍、回歸方程及相關(guān)系數(shù)，并以3 倍信噪比對應(yīng)的質(zhì)量濃度確定丙烯酰胺的檢出限。

1.3.4.2 精密度

同一天內(nèi)連續(xù)6 次對同一丙烯酰胺標(biāo)樣進行pCEC分析，測定丙烯酰胺的保留時間和峰面積，計算精密度（以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示）。

1.3.4.3 樣品分析及含量測定

采用實驗建立的分析方法，對已處理好的4 種不同品牌薯片樣品溶液進行分析檢測，每個樣品平行測定3 次。

1.3.4.4 加標(biāo)回收率

取上述等體積的薯片樣品溶液3 份，分別添加體積分?jǐn)?shù)5%、10%、20%低、中、高3 個水平的對照品溶液，進行pCEC分析，計算丙烯酰胺的加標(biāo)回收率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用OriginLab軟件包中Originpro 8程序進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測條件的確定結(jié)果

2.1.1 檢測波長

用紫外分光光度計對丙烯酰胺在190～400 nm波長之間進行掃描，丙烯酰胺在202 nm波長處有最大吸收，因此選擇202 nm作為檢測波長。

2.1.2 流動相中有機溶劑的選擇及優(yōu)化結(jié)果

2.1.2.1 有機溶劑種類比較

圖1 甲醇（a）和乙腈（b）對樣品分離情況的影響Fig. 1 Effects of methanol (a) and acetonitrile (b) on separation of samples

由圖1可知，甲醇作有機流動相時，待測物質(zhì)峰存在雜質(zhì)峰干擾，分析周期較長；而乙腈作有機流動相時，待測物質(zhì)樣品峰形尖銳，與相鄰雜質(zhì)峰之間能夠得到完全分離，而且分析周期較短，因此選擇乙腈作為流動相的有機相。

2.1.2.2 有機溶劑體積分?jǐn)?shù)優(yōu)化

由圖2可知，隨著乙腈體積分?jǐn)?shù)的增大，樣品中各組分保留時間縮短，這是因為乙腈比例增加，流動相黏度下降，電滲流增大，同時由于有機溶劑比例增加，洗脫能力增大，樣品組分更容易被洗脫，因而保留時間縮短。當(dāng)乙腈體積分?jǐn)?shù)為10%時，樣品中丙烯酰胺峰與雜質(zhì)峰未完全分離；20%乙腈時，分析時間明顯縮短，但丙烯酰胺峰與雜質(zhì)峰基本重疊；15%乙腈時，雜質(zhì)峰和丙烯酰胺峰分離良好，分析時間適中，所以選擇15%乙腈作為最優(yōu)體積分?jǐn)?shù)。

圖2 流動相中乙腈體積分?jǐn)?shù)對分離效果的影響Fig. 2 Effect of mobile phases containing different percentages of acetonitrile on separation efficiency

2.1.3 緩沖鹽

pCEC系統(tǒng)中，為了能夠形成穩(wěn)定的電場和電滲流，需要在流動相中加入可以電離的酸堿或者緩沖鹽溶液[15]，緩沖鹽溶液濃度決定了Zeta電位、雙電層厚度和毛細管內(nèi)壁表面電荷超量等。由圖3可知，NaH2PO4緩沖鹽溶液濃度為10 mmol/L時，丙烯酰胺峰柱效較低，雜質(zhì)峰對丙烯酰胺峰存在一定的干擾，15 mmol/L時，丙烯酰胺峰與雜質(zhì)峰之間的分離度良好，可達到基線分離。濃度為20 mmol/L時，由于電泳中高焦耳熱的影響，待測丙烯酰胺峰增寬嚴(yán)重，柱效下降，以致于與相鄰雜質(zhì)峰重疊，無法得到很好地分離。實驗選擇15 mmol/L緩沖鹽溶液為最優(yōu)離子強度。

圖3 緩沖鹽濃度對分離效果的影響Fig. 3 Effect of buffer salt concentration on separation ef fi ciency

2.1.4 緩沖溶液pH值

從圖4可以看出，隨pH值升高，丙烯酰胺保留時間稍有縮短，但影響并不十分明顯。而pH值對分離度的影響卻非常關(guān)鍵，如圖4所示，pH 4.0與pH 4.7時，樣品電泳譜圖未見明顯變化，隨著pH值升高，樣品中丙烯酰胺與相鄰雜質(zhì)峰分離度逐步降低，當(dāng)pH 7.0時，丙烯酰胺與雜質(zhì)峰完全重疊，無法分離，所以選擇不調(diào)節(jié)pH值（pH 4.7）為緩沖體系的最佳pH值。

圖4 緩沖溶液pH值對分離效果的影響Fig. 4 Effect of buffer salt pH values on separation

2.1.5 分離電壓

圖5 分離電壓對樣品中丙烯酰胺分離效果的影響Fig. 5 Effect of separation voltage on separation efficiency

在實驗中，毛細管入口是接地極的，正負極都施加在毛細管出口端。由圖5a～c可知，正電壓（6、4、2 kV）時，隨著電壓增大，丙烯酰胺出峰時間稍有延后，但未見明顯變化，這是因為當(dāng)在毛細管出口端施加正電壓時，電滲流方向則朝著毛細管入口端，電滲流方向與壓力流方向相反，隨著分離電壓的增大，電滲流也隨之變大，丙烯酰胺受到的電場力也增大，電滲流作用力與壓力流和電場力相互作用，使得丙烯酰胺的電泳表觀淌度減小，出峰時間稍有延長。0 kV情況下，丙烯酰胺與雜質(zhì)峰重疊（圖5d）。

由圖5e～f可知，負電壓（-2、-4 kV）時，隨著電壓絕對值增大，丙烯酰胺出峰時間明顯縮短，靈敏度提高，分離度有所降低，-2 kV時，丙烯酰胺與相鄰雜質(zhì)峰之間可得到基線分離。這是因為當(dāng)在毛細管出口端施加負電壓，電滲流方向朝向毛細管出口端，隨著分離電壓的不斷增大，電滲流方向與壓力流方向一致且逐步增大，丙烯酰胺在泵壓力、電滲流和方向相反電場力的相互作用下，整體分析速度提高。綜合考慮出峰時間，分離度和靈敏度，選擇-2 kV作為樣品的最優(yōu)分離電壓。

2.2 線性關(guān)系與檢出限結(jié)果

將不同質(zhì)量濃度的丙烯酰胺對照品溶液分別進樣，采用pCEC進行分析，同一質(zhì)量濃度重復(fù)進樣3 次。取3 次平均峰面積（Y），對標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（X，μg/mL）進行線性回歸。丙烯酰胺在2～32 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為Y=758.44X-130.84（r=0.999 4）。以3 倍信噪比為標(biāo)準(zhǔn)計算丙烯酰胺的檢出限為0.30 μg/mL。

2.3 精密度實驗結(jié)果

取上述配制好的體積分?jǐn)?shù)為40%丙烯酰胺對照品溶液，在最優(yōu)色譜條件下進樣，重復(fù)進樣6 次。丙烯酰胺峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.84%，表明該方法具有良好的精密度。

2.4 樣品分析及含量的測定結(jié)果

經(jīng)過條件優(yōu)化后獲得了最優(yōu)pCEC分析條件：以C18色譜柱（柱長為45 cm，有效長度為20 cm，內(nèi)徑為100 μm）進行分離，流動相：乙腈-15 mmol/L NaH2PO4緩沖鹽溶液（pH 4.7）（15∶85，V/V）；流動相流速為0.04 mL/min；分離電壓為-2 kV；檢測波長為202 nm。

采用優(yōu)化后的分析方法獲得的市場上4 種不同品牌的薯片樣品以及丙烯酰胺標(biāo)樣的分析結(jié)果見圖6和表1。薯片中丙烯酰胺的平均含量范圍為1.867～4.232 μg/g。不同品牌薯片中丙烯酰胺含量略有差異，結(jié)果與文獻[30]報道一致。

圖6 丙烯酰胺樣品的pCEC譜圖Fig. 6 pCEC chromatograms of acrylamide standard, spiked potato chips, and commercial potato chips samples

表1 薯片中丙烯酰胺的含量（n=3）Table 1 Content of acrylamide in potato chips (n= 3)

2.5 加標(biāo)回收率結(jié)果

按1.3.4.4節(jié)進行加標(biāo)回收實驗。丙烯酰胺在低、中、高的回收率分別為104.0%、95.3%、108.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.93%、1.48%、1.36%，說明該方法準(zhǔn)確度較高。

3 結(jié) 論

本實驗建立了pCEC法檢測食品中丙烯酰胺含量的新方法，通過對薯片樣品中丙烯酰胺含量的檢測，驗證了該方法的可行性，為丙烯酰胺的分離測定提供了新的方法。丙烯酰胺實現(xiàn)了快速高效地分離，樣品加標(biāo)回收率為95.3%～108.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于1.48%，檢測限達到0.30 μg/mL。與高效液相色譜法相比，該方法簡便易行，省略了固相萃取，簡化樣品預(yù)處理操作步驟；與膠束毛細管電泳方法[13]相比，低于膠束毛細管電泳相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.61%～9.65%，精密度較好；這說明方法操作簡單、快速高效、精密度高、檢測限低，能夠很好地對薯片中的微量丙烯酰胺進行分離測定，可對食品薯片的安全檢測具有一定的借鑒和啟發(fā)作用。