甘薯TPS基因家族分析及IbTPS7a基因克隆與功能研究

邵歡歡， 鄭海燕， 廖若星， 徐 攀， 費(fèi)雪婷，雍 彬*， 馬沁沁， 袁向華， 王曉燕

（1.四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610101；2.四川師范大學(xué) 附屬中學(xué)，四川 成都 610101）

關(guān)鍵字：甘薯；海藻糖；抗逆；數(shù)字表達(dá)譜

農(nóng)作物在生長(zhǎng)過(guò)程中容易受到干旱、極端溫度、高鹽及病蟲(chóng)害等脅迫，使其生長(zhǎng)發(fā)育受到限制，進(jìn)而影響產(chǎn)量。為了應(yīng)對(duì)來(lái)自環(huán)境中的非生物或生物脅迫，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化，植物形成了復(fù)雜的響應(yīng)機(jī)制，例如植物可以改變其形態(tài)和生理生化狀態(tài)來(lái)適應(yīng)環(huán)境的變化[1]。海藻糖（Trehalose）是一種非還原性二糖，由兩分子葡萄糖通過(guò)半縮醛羥基縮合反應(yīng)形成的α，α-1，1糖苷鍵連接而成，在細(xì)菌、真菌、昆蟲(chóng)、無(wú)脊椎動(dòng)物和植物中廣泛存在[2]。海藻糖在酸、堿、高溫等條件下具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性和強(qiáng)吸水性，可以有效地保護(hù)細(xì)胞并使其具有抗脫水作用。海藻糖分子中具有較多的羥基可以與多種生物大分子結(jié)合形成氫鍵，對(duì)生物大分子能起到保護(hù)作用并降低失活風(fēng)險(xiǎn)，有助于維持細(xì)胞或生物體的正常生命過(guò)程，進(jìn)而提升生物體的抗逆能力[3]。自然界中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了5個(gè)海藻糖合成通路，分別是TPS-TPP途徑、TreP途徑、TreS途徑、TreY-TreZ途徑和TreT途徑，其中TPS-TPP途徑是高等植物唯一的海藻糖合成途徑[4-6]。TPS-TPP途徑是由兩個(gè)關(guān)鍵酶經(jīng)過(guò)兩步反應(yīng)形成，首先在TPS催化下尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）和 6-磷酸-葡萄糖（G6P）反應(yīng)生成 6-磷酸海藻糖（T6P），T6P在磷酸海藻糖磷酸酯酶（TPP）催化下最終形成海藻糖[7]。

甘 薯 （Ipomoea batatas （L.） Lam.）， 旋 花 科（Convolvulaceae）番薯屬（Ipomoea）一年生草本植物，淀粉含量高且營(yíng)養(yǎng)豐富，是一種重要的糧食作物。中國(guó)甘薯資源十分豐富，種植面積和產(chǎn)量均居世界第一[8]。甘薯多被種植在不發(fā)達(dá)地區(qū)的邊緣土地中，產(chǎn)量很高但并不占用良田，對(duì)環(huán)境要求較低，容易受到干旱、鹽堿、極端溫度等非生物脅迫，因此其抗脅迫能力也較強(qiáng)。

在高等植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了較多的TPS基因，有些植物中具有由一系列TPS基因組成的TPS基因家族，例如擬南芥基因組中具有11個(gè)TPS基因（AtTPS1-11）組成的AtTPS基因家族[9]，根據(jù)擬南芥TPS基因家族序列特點(diǎn)在楊樹(shù)和水稻等植物中也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的TPS基因家族，其中楊樹(shù)TPS基因家族有12個(gè)PtTPS基因，水稻TPS基因家族有11個(gè)OsTPS基因[10-11]。目前還沒(méi)有關(guān)于甘薯TPS基因家族及功能研究的報(bào)道，作者根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中擬南芥和楊樹(shù)的TPS基因家族序列，利用本地Blast（BlastN和BlastP）在甘薯轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)[12]中共發(fā)現(xiàn)了7個(gè)TPS基因，成功克隆得到了IbTPS7a基因，分析了IbTPS7a基因在甘薯不同組織中的表達(dá)量，在大腸桿菌和釀酒酵母對(duì)IbTPS7a基因的抗逆功能進(jìn)行了驗(yàn)證，有助于了解甘薯的TPS基因抗逆功能和作用機(jī)制，為未來(lái)甘薯的育種及基因工程改造研究打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 薯材、菌株、質(zhì)粒 甘薯品種為徐薯18，大腸桿菌克隆及表達(dá)菌株分別為Escherichia coli DH5α和 E.coli BL21 （DE3）， 酵 母 表 達(dá) 菌 株 為Saccharomyces cerevisiae INVSc1，大腸桿菌表達(dá)載體為 pET-32a（+），酵母表達(dá)載體為 pYES2。

1.1.2 主要試劑、工具酶和分析軟件 RNA提取試劑 盒 MiniBEST Plant RNA Extraction Kit： 購(gòu) 自TaKaRa公司；PCR高保真酶PrimeSTAR?HS（Premix）:購(gòu)自TaKaRa公司；酵母基因組提取試劑盒:購(gòu)自北京天根生物科技有限公司；膠回收試劑盒E.Z.N.A.TMPlasmid Mini Kit I：購(gòu)自O(shè)mega Bio-tek 公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶： 購(gòu)自 Invitrogen；RNase inhibitor及各種常規(guī)限制內(nèi)切酶：購(gòu)自Thermo Scientific公司；引物合成及測(cè)序：成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 甘薯TPS基因家族分析及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 利用已知的單子葉植物水稻和雙子葉植物擬南芥中TPS基因家族核酸序列和蛋白序列，用BlastParser軟件對(duì)甘薯轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)分別進(jìn)行本地BlastN和BlastP（e-value為1e-10）比對(duì)，獲得相關(guān)同源序列，結(jié)合兩種比對(duì)結(jié)果分析甘薯轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中可能存在的TPS基因家族。將獲得的甘薯TPS基因家族序列與擬南芥的相關(guān)序列使用MEGA 5.0軟件采用Neighbor-joining法制作系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.2 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 根據(jù)TaKaRa公司植物總RNA提取試劑盒的推薦方法對(duì)分別對(duì)徐薯18的葉片、塊根和莖提取總RNA，將去除基因組DNA后無(wú)降解的總RNA使用Thermo公司的Nanodrop 2000進(jìn)行RNA濃度測(cè)定，并根據(jù)濃度按照比例將3個(gè)組織樣品的總RNA進(jìn)行等量混合，以M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一鏈，分裝后保存在-20℃冰箱中備用。

1.2.3 IbTPS7a基因克隆及表達(dá)載體構(gòu)建 以甘薯轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)及前期經(jīng)比對(duì)得到的甘薯TPS基因家族中的IbTPS7a序列為模板，使用SLIC（sequence and ligation independent cloning） 法設(shè)計(jì)引 物 ， 引 物 序 列 所 下 所 示 ：TPS-32sF：5’ -GAAAACCTGTACTTCCAGGGTATGATGTCCAAATC GTATACCAACTT-3’ ；TPS-32sR：5’-GTTTAGAGG CCCCAAGGGGTTATCAATCCGAGCTTCCGGTGG-3’ ；PET_TPS-F：5’-CCACCGGAAGCTCGGATTGA TAACCCCTTGGGGCCTCTAAAC-3’ ；PET_TPS-R：5’-ACCCTGGAAGTACAGGTTTTCACCAGAAGAAT GATGATGATGATGG-3’其中下劃線部分為pET32a（+）載體骨架部分。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA和pET32a（+）質(zhì)粒為模板，分別以 TPS-32sF和TPS-32sR以及PET_TPS-F和PET_TPS-R為引物，使用PrimeSTAR?HS（Premix）分別進(jìn)行 PCR擴(kuò)增IbTPS7a基因和線性 pET32a（+）載體，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后膠回收，回收產(chǎn)物經(jīng)T4 DNA Polymerase處理、退火，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pET32-IbTPS。把得到的pET32-IbTPS質(zhì)粒經(jīng)PCR驗(yàn)證后送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，以測(cè)序正確的質(zhì)粒為模板使用引物TPS-yF（5’-CGGGATCCCGATG ATGTCCAAATCGTATACCAACTT-3’） 和 TPS-yR（5’ -GCTCTAGAGCTCAATCCGAGCTTCCGGTGG-3’）進(jìn)行PCR，將純化后的PCR產(chǎn)物和pYES2載體使用BamH I和Xba I進(jìn)行雙酶切，膠回收使用T4 DNA ligase于18℃過(guò)夜連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得的陽(yáng)性克隆進(jìn)行培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒酶切和PCR驗(yàn)證后送至公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 根據(jù)測(cè)序得到IbTPS7a基因 序 列 ， 用 BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）和DNAMAN進(jìn)行基因及蛋白同源序列比對(duì)；使用 ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)IbTPS7a蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)；進(jìn)化樹(shù)使用MEGA 5.0軟件的Neighbor-Joining法構(gòu)建，蛋白質(zhì)氨基酸進(jìn)化距離計(jì)算采用Poisson correction模型，bootstrap自檢重復(fù)1 000次；信號(hào)肽使用Signal IP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進(jìn)行預(yù)測(cè)；跨膜結(jié)構(gòu)分析使用TMpred（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）； 亞細(xì)胞定位 使 用 Wolf psort （http：//www.genscript.com/wolfpsort.html）。

1.2.5 原核表達(dá)及非生物脅迫耐受性分析 將成功構(gòu)建的pET32-IbTPS質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）菌株，使用含有氨芐青霉素（Ampicillin，50 μg/mL）抗性平板篩選，挑取單菌落至2 mL的液體LB中過(guò)夜培養(yǎng)，取500 μL菌液加入50 mL液體LB中，37℃ 培養(yǎng)至 A600nm為 0.4～0.6時(shí)加入 IPTG（Isopropyl β-D-Thiogalactoside，終濃度為 1 mmol/L），將50 mL菌液放置于18℃培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)表達(dá)16 h，SDS-PAGE電泳檢測(cè)IbTPS7a蛋白表達(dá)效果。

挑取含有pET32-IbTPS質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆菌落于含50 μg/mL Amp的 2 μL LB液體培養(yǎng)基中 37℃震蕩過(guò)夜培養(yǎng)，取100 μL將其接入10 mL液體LB（含 50 μg/mL Amp）中當(dāng) A600nm為 0.6 時(shí)，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，18℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。按1%比例，取500 μL此培養(yǎng)物分別移入50 mL含0.6 mol/L NaCl、0.8 mol/L NaCl、 質(zhì) 量 分 數(shù) 20%PEG6000和30%PEG6000的液體LB培養(yǎng)基（IPTG終濃度為1 mmol/L）中，在37℃培養(yǎng)箱中持續(xù)震蕩培養(yǎng)3 d，每間隔4 h取樣并測(cè)定其A600nm值，繪制生長(zhǎng)曲線，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，含空載體的對(duì)照菌株按照相同的方法繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.6 釀酒酵母轉(zhuǎn)化及非生物脅迫耐受性分析利用醋酸鋰法將pYES2-IbTPS和pYES2質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化S.cerevisiae INVSc1，將兩種菌落接種至液體培養(yǎng)基中，使用酵母基因組提取試劑盒提取含有質(zhì)粒的釀酒酵母總DNA，用引物TPS-yF和TPS-yR以提取得到的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)成功轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的菌株，鑒定正確的菌液劃線固體平板保存至4℃冰箱中短暫保存。

分別挑取含有pYES2空載體和pYES2-IbTPS的單菌落接種于10 mL SD-URA液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)24 h，測(cè)定A600nm值，將菌液轉(zhuǎn)接至含有半乳糖（20 g/L）的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，使初始A600nm值均為0.4，30℃誘導(dǎo)表達(dá)30 h，將最終菌液A600nm值調(diào)為一致。取1 mL誘導(dǎo)的酵母菌液，離心后去上清液，菌體分別懸浮于1 mL的5 mol/L NaCl、4 mol/L山梨醇和PBS溶液（pH 7.4），置于4℃脅迫處理24 h，稀釋1 000倍，取50 μL涂布于不含半乳糖的SD-URA固體平板上，放至30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，通過(guò)平板計(jì)數(shù)計(jì)算釀酒酵母細(xì)胞的生存率。

1.2.7 數(shù)字表達(dá)譜分析 利用Illumina Pipeline軟件獲取甘薯的嫩葉、成熟葉片、莖、須根、初始?jí)K根、膨大塊根和收獲塊根等7個(gè)不同組織原始的21 bp的DGE標(biāo)簽，Bowtie定位有關(guān)IbTPS7a基因完整CDS的clean tag（僅允許一個(gè)堿基錯(cuò)配）。使用edgeR package程序?qū)NA的組成和不同的測(cè)序庫(kù)規(guī)模進(jìn)行誤差評(píng)估，對(duì)獲得的基因的表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，從而獲得準(zhǔn)確的IbTPS7a基因的表達(dá)量[13]。

表1 甘薯的TPS基因家族Table 1 TPS family genes in Ipomoea batatas

2 結(jié) 果

2.1 甘薯TPS基因家族挖掘及分析

為了挖掘甘薯的TPS基因家族，作者根據(jù)擬南芥和水稻的TPS家族核酸及蛋白序列對(duì)甘薯轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)分別進(jìn)行BlastN和BlastP，將比對(duì)得到的contig序列翻譯得到的TPS蛋白進(jìn)行序列和功能單元分析，共篩選得到7個(gè)全長(zhǎng)IbTPS基因（如表1所示），其中有兩個(gè)IbTPS蛋白序列經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)其同源性達(dá)到75%，且這兩個(gè)IbTPS蛋白與其它物種的TPS7蛋白序列同源性最高，因此分別被命名為IbTPS7a和IbTPS7b。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)甘薯TPS蛋白都具有TPS蛋白所含有的N端GT1_TPS保守區(qū)域及C端Trehalose_PPase保守區(qū)域。信號(hào)肽分析結(jié)果表明7個(gè)甘薯TPS蛋白都沒(méi)有信號(hào)肽，亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)IbTPS1和IbTPS7a最有可能位于葉綠體 中 ，IbTPS5、IbTPS6、IbTPS7b 和 IbTPS11 可能位于細(xì)胞質(zhì)中，而IbTPS9可能位于細(xì)胞核中，這表明甘薯不同的IbTPS蛋白在胞內(nèi)分布區(qū)域及功能可能有所不同。利用已知的擬南芥11個(gè)TPS蛋白與甘薯7個(gè)TPS蛋白進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與擬南芥TPS蛋白家族類(lèi)似，甘薯的TPS蛋白也可以分為兩個(gè)亞家族，其中IbTPS1屬于I類(lèi)家族，其余IbTPS蛋白屬于II類(lèi)家族（如圖1所示）。

圖1 甘薯和擬南芥中TPS蛋白家族進(jìn)化樹(shù)分析Fig.1 Phylogeneticanalysisofthe TPS family in Arabidopsis and Ipomoea batatas

2.2 IbTPS7a基因克隆及表達(dá)載體構(gòu)建

以提取得到的徐薯18總RNA為模板，使用通用引物oligo（dT）15進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再以cDNA為模板使用TPS-32sF和TPS-32sR進(jìn)行PCR，以 pET32a（+）質(zhì)粒為模板使用 PET_TPS-F和PET_TPS-R進(jìn)行擴(kuò)增，電泳檢測(cè)在約2 600 bp左右和5 900 bp左右各有一明亮條帶（圖2），與之前預(yù)期的擴(kuò)增的IbTPS7a基因大小和pET32a（+）質(zhì)粒大小一致；使用SLIC法構(gòu)建pET32-TPS質(zhì)粒，以測(cè)序正確的pET32-TPS質(zhì)粒為模板，使用TPS-yF和TPS-yR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在2 600 bp左右有一明亮條帶，將PCR片段與pYES2載體分別雙酶切后連接轉(zhuǎn)化，得到pYES2-IbTPS質(zhì)粒。

圖2 IbTPS7a基因PCR產(chǎn)物及載體構(gòu)建Fig.2 Agarose electrophoresis analysis and expression vector construction of IbTPS7a

2.3 IbTPS7a生物信息學(xué)分析

生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，IbTPS7a基因長(zhǎng)度為2 568 bp，其翻譯的蛋白長(zhǎng)度為855 aa，IbTPS7a蛋白分子式為C4310H6710N1158O1277S40，蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為 94.46×103，理論等電點(diǎn) 5.58，脂肪系數(shù)為87.22，親水性值為-0.230，因此IbTPS7a是一個(gè)親水性蛋白；信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)IbTPS7a沒(méi)有明顯的信號(hào)肽，可見(jiàn)IbTPS7a是一個(gè)胞內(nèi)蛋白，主要在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生作用，跨膜結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)IbTPS7a具有兩個(gè)明顯的由外到內(nèi)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域：474-491和790-812；通過(guò)亞細(xì)胞定位軟件Wolf psort對(duì)IbTPS7a蛋白在甘薯細(xì)胞內(nèi)的位置進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)K最近鄰（k-Nearest Neighbor，KNN）值為 14，其中 7 個(gè)位于葉綠體中，5個(gè)位于細(xì)胞核中，2個(gè)位于液泡中，即IbTPS7a定位可能性為：葉綠體＞細(xì)胞核＞液泡。

2.4 IbTPS7a蛋白進(jìn)化樹(shù)分析

使用DNAMAN軟件將10種其它植物的TPS蛋白與甘薯IbTPS7a蛋白進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它們同源性都在82%以上，其中IbTPS7a與Nicotiana sylvestris和Solanum tuberosum蛋白同源性最高為86.7%，與Eucalyptus grandis的TPS7蛋白同源性最低為82%（如圖3所示）。將這11條蛋白序列首先進(jìn)行MEGA 5.0軟件進(jìn)行Clustal W比對(duì)，然后將比對(duì)后的蛋白序列采用Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap自檢1 000次，甘薯IbTPS7a蛋白與Nicotiana sylvestris和Solanum tuberosum的TPS7蛋白親緣關(guān)系最近，該結(jié)果與同源比對(duì)結(jié)果一致。

圖3 IbTPS7a蛋白進(jìn)化樹(shù)分析Fig.3 Phylogenetic tree of IbTPS7a protein

2.5 含IbTPS7a基因的大腸桿菌BL21重組子抗逆境脅迫分析

為了驗(yàn)證IbTPS7a基因在原核細(xì)胞中的功能，將 pET32-IbTPS質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 E.coli BL21（DE3）并使用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分別使用0.6、0.8 mol/L NaCl、質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%PEG6000和30%PEG6000對(duì)IbTPS7a基因過(guò)表達(dá)菌株進(jìn)行高鹽及干旱模擬脅迫，并對(duì)生長(zhǎng)曲線進(jìn)行測(cè)定。如圖4顯示，在無(wú)脅迫的LB培養(yǎng)基中含有空載體的對(duì)照菌株和轉(zhuǎn)IbTPS7a基因菌株的生長(zhǎng)曲線幾乎沒(méi)有差異（圖4）；在0.6 mol/L NaCl脅迫處理下，轉(zhuǎn)IbTPS7a基因菌株（0 h）相比對(duì)照菌株（4 h）更早進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，但是兩者進(jìn)入穩(wěn)定期的時(shí)間差異不大，轉(zhuǎn)基因菌株生長(zhǎng)效果較好于對(duì)照菌株；在0.8 mol/L NaCl脅迫處理下，兩種菌株的生長(zhǎng)都受到抑制，但轉(zhuǎn)基因菌株的生長(zhǎng)明顯優(yōu)于對(duì)照菌株；在20%PEG6000脅迫處理下，兩種菌株的生長(zhǎng)效果差異并不明顯；在30%PEG6000脅迫處理下，對(duì)照菌株生長(zhǎng)困難，轉(zhuǎn)基因菌株明顯優(yōu)于對(duì)照菌株，但是相比20%PEG6000脅迫轉(zhuǎn)基因菌株進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間也明顯延長(zhǎng)。

圖4 重組大腸桿菌BL21/IbTPS7a在鹽脅迫及干旱脅迫培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curves of IbTPS7a in E.coli BL21 under salt and drought stress

2.6 轉(zhuǎn)基因酵母抗逆境脅迫分析

如圖5所示，在無(wú)脅迫壓力下，含有pYES2空載體的酵母菌株和轉(zhuǎn)IbTPS7a的菌株涂平板后的菌落數(shù)基本一致，這表明IbTPS7a基因的過(guò)表達(dá)對(duì)釀酒酵母的正常生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的影響；兩種菌株分別在5 mol/L NaCl和4 mol/L山梨醇進(jìn)行脅迫處理后，轉(zhuǎn)IbTPS7a基因的釀酒酵母菌株的存活率明顯高于對(duì)照菌株，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明IbTPS7a基因的過(guò)表達(dá)可以有效提升釀酒酵母的生存率，降低外界環(huán)境改變對(duì)細(xì)胞的傷害。

2.7 IbTPS7a基因數(shù)字表達(dá)譜分析

利用數(shù)字表達(dá)譜對(duì)甘薯IbTPS7a基因的組織特異性表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果（如圖6所示）發(fā)現(xiàn)，甘薯在多個(gè)組織中的表達(dá)量相對(duì)較低，其中在莖（ST）中的表達(dá)量最高為15.35 TPM，其次是嫩葉 （YL）為12.23 TPM，在根部組織的表達(dá)量都比較低，其中在須根（FR）中的表達(dá)量最低為0.84 TPM。

3 討論

TPS基因可通過(guò)多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與植物的代謝、生長(zhǎng)發(fā)育及抗逆作用，不同物種的TPS基因?qū)γ{迫條件的反應(yīng)機(jī)制存在差異，TPS基因在不同的組織中的表達(dá)量也不盡相同[14-15]。甘薯是一種重要的糧食作物，其栽培品種是六倍體，基因組龐大且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，由于甘薯基因組測(cè)序尚未完成，現(xiàn)在對(duì)于甘薯遺傳資源的挖掘多通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)實(shí)現(xiàn)[16-17]。在已完成基因組測(cè)序的高等植物中都發(fā)現(xiàn)有TPS基因家族，而目前尚沒(méi)有對(duì)甘薯TPS基因家族研究的報(bào)道。

圖5 重組釀酒酵母菌在鹽脅迫及干旱脅迫條件下的生長(zhǎng)Fig.5 Growth of IbTPS7a in yeast under salt and drought stresses

圖6 IbTPS7a基因在甘薯不同組織樣品中的表達(dá)量Fig.6 Expression level of IbTPS7a in different tissues of Ipomoea batatas by digital gene expression profiling（TPM means the transcript per million）

4 結(jié)語(yǔ)

作者使用生物信息學(xué)方法對(duì)甘薯轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，首次鑒定得到7個(gè)具有完整ORF結(jié)構(gòu)的甘薯TPS基因家族成員，其中有兩個(gè)TPS基因經(jīng)鑒定為T(mén)PS7基因的兩個(gè)亞型即IbTPS7a和IbTPS7b，本研究對(duì)于TPS基因家族的挖掘基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，沒(méi)有找到全部的甘薯TPS基因，顯示了數(shù)據(jù)不足的缺憾，但是也為未來(lái)甘薯TPS基因的研究提供了重要的數(shù)據(jù)。將甘薯的TPS基因家族與其擬南芥的TPS基因進(jìn)行了進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與擬南芥類(lèi)似，甘薯TPS基因家族也可以被分為兩個(gè)亞家族，其中IbTPS1歸屬于class I，其余的IbTPS基因?qū)儆赾lass II。擬南芥的TPS1被證明具有TPS活力，但class II的TPS尚未被證明具有活力[18]，為了研究甘薯class II中TPS基因的功能，作者利用RT-PCR方法成功克隆得到class II的IbTPS7a基因，并對(duì)其在大腸桿菌和釀酒酵母中的抗逆作用進(jìn)行的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)IbTPS7a基因后誘導(dǎo)過(guò)表達(dá)的大腸桿菌菌株相比對(duì)照菌株在高鹽和干旱脅迫下生長(zhǎng)能力明顯提升，在釀酒酵母中過(guò)表達(dá)IbTPS7a基因也可以有效增強(qiáng)真核細(xì)胞在高鹽和干旱脅迫下生存率也顯著提高，這說(shuō)明過(guò)表達(dá)甘薯IbTPS7a有助于提升細(xì)胞的耐鹽和耐干旱作用，增強(qiáng)細(xì)胞適應(yīng)外界環(huán)境變化及抵御脅迫的能力。細(xì)菌中海藻糖合成除了TreS和TreY/Z途徑外還可以通過(guò)TPP/TPS途徑，酵母中也具有TPP/TPS途徑，研究發(fā)現(xiàn)外源TPS基因的導(dǎo)入可以很好的修復(fù)相關(guān)缺陷菌株的海藻糖合成能力，因此甘薯TPS基因的過(guò)表達(dá)可能有助于促進(jìn)大腸桿菌和酵母胞內(nèi)海藻糖的合成，從而保護(hù)細(xì)胞免受環(huán)境脅迫造成的傷害[19-20]。大豆和擬南芥的TPS基因在根和根瘤等組織中的表達(dá)量較高[21]，而作者發(fā)現(xiàn)IbTPS7a基因在莖和嫩葉中的表達(dá)量較高，但是在多個(gè)根部組織中的表達(dá)量較低，這可能是因?yàn)楦适鞩bTPS7a基因與其它植物中的TPS基因在功能上有所不同。由于海藻糖對(duì)生物體優(yōu)良的保護(hù)性能，其在食品、保健、醫(yī)療等行業(yè)應(yīng)用越來(lái)越普遍[22]，因此本研究不僅為進(jìn)一步研究甘薯TPS基因家族及IbTPS7a的功能打下了基礎(chǔ)，也為拓展甘薯海藻糖合成酶在未來(lái)的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。