三種巨大口蘑菌株貯藏期間褐變及相關(guān)酶活性

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(華南農(nóng)業(yè)大學食品學院,廣東廣州 510642)

巨大口蘑(Tricholomagiganteum)是屬于口蘑科(Tricholomataceae)口蘑屬(Tricholoma)的一種珍稀食藥用菌,主要分布在熱帶及亞熱帶地區(qū)[1]。該菌子實體營養(yǎng)豐富,所含必需氨基酸與非必需氨基酸比值(E/N)達到了WHO提出的理想蛋白質(zhì)要求[2-3],營養(yǎng)價值優(yōu)于杏鮑菇[4],且具有降血壓、抑制病毒、抗腫瘤等功效[5-8]。

褐變是食用菌商品價值降低的關(guān)鍵因素,會使食用菌子實體色澤變深、軟化腐爛和營養(yǎng)流失等[9-10]。酶促褐變是食用菌褐變的主要原因,由多酚氧化酶(PPO)催化酚類物質(zhì)氧化而引起[11]。根據(jù)多酚氧化酶催化的底物不同,將其分為單酚氧化酶[酪氨酸酶(TYR)]、雙酚氧化酶(兒茶酚氧化酶)和漆酶,而食用菌中的酶促褐變與PPO、TYR、漆酶活性和總酚含量密切相關(guān)[12],且酶活性因品種不同有所差異[13]。巨大口蘑作為一種高溫型食用菌在我國南方已廣泛栽培,其子實體具有一定的抗褐變能力[14]。但目前國內(nèi)外對巨大口蘑的研究多集中在野生菌種分離馴化、覆土栽培、營養(yǎng)成分測定、與其他食用菌貯藏品質(zhì)比較等領(lǐng)域,而對巨大口蘑不同菌株間的貯藏品質(zhì)研究較少[15-17]。

本研究以巨大口蘑SCAU1、新3和新4三種菌株的子實體為試材,測定貯藏期間褐變度、PPO、TYR、漆酶和總酚含量等,分析褐變及生理指標間的相關(guān)性,為巨大口蘑的菌種選育及褐變內(nèi)在機理的揭示提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

巨大口蘑SCAU1、新3和新4菌株 由華南農(nóng)業(yè)大學食品學院應用真菌實驗室提供;鄰苯二酚 分析純,天津市福晨化學試劑廠;鄰聯(lián)甲苯胺 分析純,上海晶體試劑有限公司;L-多巴 化學純,上海源葉生物科技有限公司。

PHSJ-4A型實驗室pH計 上海精密儀器儀表有限公司;752型紫外可見分光光度計 上海精密儀器儀表有限公司;CR-410全自動色差計 日本Konica Minolta公司;GL21低溫冷凍離心機 德國Eppendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 挑選新鮮采摘、無損傷、大小一致的三種巨大口蘑菌株子實體第一潮菇,用PE氣調(diào)保鮮袋封口包裝,置于12 ℃、相對濕度95%的生化培養(yǎng)箱中貯藏,定期取三種菌株子實體菌蓋組織切片,測定各項生理指標,每組處理設(shè)3個重復。

1.2.2 測定指標及方法

1.2.2.1 褐變度 參照魏要武等[18]的方法,用標準陶瓷板(X=80.00,Y=83.00,Z=90.00)作為工作指標,測量蘑菇子實體菌蓋組織切面的褐變度,用ΔL表示。ΔL值越小,表示顏色越白,褐變程度越輕。計算公式為:

褐變度(%)=(貯藏前L值-貯藏后L值)/貯藏前L值×100

1.2.2.2 PPO活性 參照王治江等[19]的方法,以每分鐘OD420減少0.1為一個酶活力單位,結(jié)果以U/g FW表示。

1.2.2.3 TYR活性 參照楊春敏等[12]的方法。酶活力單位(U)定義為:20 ℃下每分鐘引起OD值變化0.1為1個酶活力單位。

1.2.2.4 漆酶活性 參考潘迎捷等[20]的方法,并加以修改。取1 g子實體菌蓋組織切片于研缽,加入5 mL預冷的0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH6.8),冰浴研磨,然后在4 ℃,4000 r/min下離心10 min,上清液即為漆酶粗提液。漆酶活性測定體系為:0.5 mL 3.36 mmol/L鄰聯(lián)甲苯胺,3.0 mL 0.1 mol/L醋酸緩沖液(pH4.6)和0.5 mL酶液,25 ℃反應10 min。酶活力以600 nm處吸光率的增值表示。一個酶活單位(U)定義為在上述條件下,每分鐘引起OD值改變0.01所需的酶量。

1.2.2.5 總酚含量 參照劉麗丹[21]的方法,以焦性沒食子酸為標準品,繪制標準曲線,曲線方程為Y=2.5271X-0.0019,R2=0.9983,根據(jù)標準曲線計算樣品中總酚的含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用DPS v9.5軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù),方差分析采用ANOVA,多重比較的顯著性檢驗采用Duncan新復極差法;應用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行偏相關(guān)分析和逐步回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同巨大口蘑菌株的褐變度變化分析

褐變度是淺色食用菌在貯藏期間品質(zhì)劣變最明顯的指標之一,與其衰老程度和經(jīng)濟價值密切相關(guān)。如圖1所示,三種菌株口蘑子實體的褐變度均隨貯藏時間的延長而呈上升趨勢。其中在前15 d內(nèi),三者間褐變度并無顯著差異(p>0.05),隨后,新3和新4兩菌株口蘑褐變度上升的速率逐漸加快,且顯著高于SCAU1菌株的褐變度(p<0.05)。貯藏30 d時,SCAU1、新3和新4三種菌株褐變度分別上升至0.68%、1.23%、1.09%,表明SCAU1菌株在貯藏期間相對不易褐變。隨貯藏時間的延長,三種菌株的褐變度均呈不同速率的上升,這可能與貯藏期間酶促反應生成的類黑色素物質(zhì)在子實體內(nèi)逐漸積累有關(guān)[22]。

圖1 不同巨大口蘑菌株的褐變度變化Fig.1 Changes in browning degree of different Tricholoma giganteum strains

2.2 不同巨大口蘑菌株的PPO、TYR和漆酶活性變化分析

PPO可將食用菌子實體中酚類物質(zhì)氧化成醌,醌類物質(zhì)聚合形成褐色物質(zhì)導致子實體組織變色[23]。如圖2所示,采摘時巨大口蘑SCAU1菌株的PPO活性顯著低于另外兩菌株(p<0.05)。在貯藏期內(nèi),三種菌株口蘑PPO活性整體呈下降趨勢,可能是由于貯藏期間口蘑子實體自身的代謝作用和品質(zhì)的劣變影響了酶的活性[24],李南羿等[25]對貯藏期間雙孢蘑菇多酚氧化酶活性的研究具有相同趨勢。在貯藏期間,新3和新4兩菌株間PPO活性差異不顯著(p>0.05),且二者PPO活性均顯著高于SCAU1菌株(p<0.05)，這與王澤生等[26]研究發(fā)現(xiàn)雙孢蘑菇易褐變菌株的多酚氧化酶活性較高的結(jié)果相一致。

圖2 不同巨大口蘑菌株的PPO活性變化Fig.2 Changes in PPO activity of different Tricholoma giganteum strains

TYR主要通過催化酪氨酸生成多巴,多巴進一步反應生成多巴醌,從而調(diào)控黑色素在食用菌子實體中的合成[27]。如圖3所示,整個貯藏期內(nèi),巨大口蘑SCAU1菌株的TYR活性均低于另外兩菌株,且與新3菌株TYR活性存在顯著差異(p<0.05)。在貯藏期前18 d內(nèi),三菌株口蘑TYR活性波動較大,此后均呈不同速率下降;貯藏30 d時,SCAU1、新3和新4三種菌株TYR活性分別降至采收時的54.8%、74.4%和74.1%,表明SCAU1菌株的TYR活性偏低且降幅最大。三種菌株在貯藏期間酪氨酸酶均有先升后降的趨勢,可能是采摘和貯藏期間誘導了酪氨酸酶的激活,使其酶活上升,貯藏后期由于子實體自身代謝作用品質(zhì)劣變,酶活性逐漸下降[28]。在貯藏期間三種菌株的酪氨酸酶活有所差異,這與Moore等[29]對雙孢蘑菇不同菌株酪氨酸酶活的研究結(jié)果一致。

圖3 不同巨大口蘑菌株的TYR活性變化Fig.3 Changes in TYR activity of different Tricholoma giganteum strains

漆酶可催化多種酚類和非酚類物質(zhì)發(fā)生氧化或分解,影響食用菌貯藏期間的營養(yǎng)價值和品質(zhì)[30]。如圖4所示,SCAU1和新3兩菌株漆酶活性在貯藏前期12 d內(nèi)有較大波動,此后呈不同速率下降,在貯藏30 d時,分別下降31.2%、34.8%;整個貯藏期間,新4菌株的漆酶活性下降速率緩慢,且在24～30 d范圍內(nèi),漆酶活性高于SCAU1和新3兩菌株,貯藏30 d后,降幅僅為14.7%。這表明貯藏期間SCAU1和新3菌株漆酶活性降幅較大,新4菌株漆酶活性最為穩(wěn)定。三種菌株在貯藏期間的漆酶活性并不一致,可能是由于不同菌株中的漆酶同工酶不同,催化氧化分解反應的作用存在差異,在白腐菌漆酶的研究中也出現(xiàn)同樣的結(jié)果[31-32]。

圖4 不同巨大口蘑菌株的漆酶活性變化Fig.4 Changes in laccase activity of different Tricholoma giganteum strains

2.3 不同巨大口蘑菌株的總酚含量變化分析

總酚是酶促褐變反應的重要底物,具有很強的抗氧化能力,其含量與果蔬的褐變程度有密切關(guān)系[33]。如圖5所示,在整個貯藏期間,三種菌株的總酚含量均呈鋸齒“M”型下降趨勢,并出現(xiàn)兩個峰值,剛采摘時,巨大口蘑三種菌株的總酚含量均迅速上升,并在3～6 d內(nèi)達貯藏期最大值,隨后在15～24 d內(nèi)均出現(xiàn)第二個峰值。在整個貯藏期內(nèi),新3菌株的總酚含量相對偏低,三種菌株的總酚含量并未出現(xiàn)顯著差異(p>0.05)。貯藏初期,三種菌株的總酚含量逐漸上升,這可能是由于采后低溫貯藏時受到逆境脅迫,口蘑子實體細胞產(chǎn)生更多酚類物質(zhì),增加的酚類物質(zhì)可參與組織的傷愈過程[34]。隨貯藏時間延長,膜脂過氧化作用加劇,細胞膜逐漸破壞,使原本被隔離的酚類底物與酶類接觸發(fā)生反應,總酚含量逐漸減少,這與猴頭菇和香菇在采后貯藏期間總酚的變化趨勢一致[35-36]。

圖5 不同巨大口蘑菌株的總酚含量變化Fig.5 Changes in total phenol content of different Tricholoma giganteum strains

2.4 不同巨大口蘑菌株褐變度與各生理指標的相關(guān)性研究

偏相關(guān)分析是在控制其他變量的線性影響下,分析兩變量間的線性關(guān)系[37]。如表1所示,將巨大口蘑三個菌株貯藏期間的褐變度,分別與褐變相關(guān)酶及總酚含量進行偏相關(guān)分析,結(jié)果表明,新3菌株褐變度與PPO(p<0.01)和TYR(p<0.05)的活性有不同程度的顯著負相關(guān)性,新4菌株褐變度與PPO活性呈極顯著的負相關(guān)(p<0.01),SCAU1菌株褐變度與PPO活性顯著負相關(guān)(p<0.05),三個菌株的褐變度與漆酶活性和反應底物總酚含量均無顯著相關(guān)性(p>0.05)。

表1 不同巨大口蘑菌株褐變度與各生理指標的偏相關(guān)分析Table 1 Correlation analysis between browning degree and various factors in different strains of Tricholoma giganteum

逐步回歸分析通過剔除與褐變不相關(guān)的因素,對相關(guān)因素做量化分析[38],進一步探討各因素對不同菌株貯藏期間褐變度的影響。如表2所示,分別作出各因素與三個菌株褐變度之間的逐步回歸分析,并建立逐步回歸方程,對方程進行顯著性檢驗,均達0.05顯著水平,表明方程成立;調(diào)整決定系數(shù)R2均在0.8以上,表明方程的擬合性較好。逐步回歸結(jié)果表明,三個菌株的褐變度均與PPO活性呈負相關(guān),按照相關(guān)性大小排列依次為新3菌株>新4菌株>SCAU1菌株;除此之外,新3菌株褐變度還與其TYR活性呈負相關(guān)。

表2 不同巨大口蘑菌株褐變度與各因素的逐步回歸分析Table 2 Stepwise regression analysis between browning degree and all factors in different strains of Tricholoma giganteum

3 討論

巨大口蘑采后品質(zhì)的劣變主要表現(xiàn)為色澤的加深,其原因與子實體褐變相關(guān)酶活性及反應底物密切相關(guān)[12]。貯藏期間三種菌株的褐變度均呈上升趨勢,PPO和TYR活性總體呈下降趨勢,且SCAU1菌株的相應指標均低于另外兩菌株,說明低活性的PPO和TYR能降低SCAU1菌株的褐變度,這與王澤生等[26]對雙孢菇的研究結(jié)果相一致。貯藏期間三種菌株的漆酶活性和總酚含量整體呈下降趨勢但菌株間并未出現(xiàn)顯著差異,說明漆酶和總酚并不是引起巨大口蘑三種菌株間褐變差異的主要原因,這與王樂芬等[39]研究雙孢蘑菇褐變的結(jié)果相似。

偏相關(guān)性分析和逐步回歸分析進一步表明三種菌株的褐變度均與PPO活性呈顯著負相關(guān),與貯藏期間雙孢蘑菇、紫甘薯和茄子等研究中PPO的表現(xiàn)[26,40-41]基本一致。分析其原因,可能是因為在采前及貯藏初期三種菌株口蘑子實體的組織完好,未受損傷,子實體中PPO及其底物正常存在,由于多酚氧化酶及其底物定位的區(qū)域化使得酶促褐變相對不易發(fā)生[42],隨著時間的延長,酶和底物有機會接觸,酶促褐變反應程度逐漸增加,使得褐變度逐漸上升[43];但是,如果進一步延長貯藏時間,采后子實體自身的呼吸作用和能量的消耗以及細胞生理狀態(tài)的劣變,可能導致PPO的蛋白結(jié)構(gòu)受損或和酶的工作環(huán)境不適,進而引起酶活性逐漸下降[25],與褐變負相關(guān),其中的具體機理復雜,還有待進一步的探索和研究。相關(guān)性分析中TYR活性僅與新3菌株的褐變度相關(guān)性顯著,綜合實驗誤差等因素,有待進一步增加試驗樣本的數(shù)量，以明確三種菌株中TYR活性與褐變度的關(guān)系。

4 結(jié)論

三種巨大口蘑菌株在采后貯藏期間,SCAU1菌株子實體褐變最為緩慢,新4菌株次之,新3菌株子實體褐變速度最快。相關(guān)性分析表明,新3、新4菌株的褐變度均與PPO活性呈極顯著負相關(guān)(p<0.01),SCAU1菌株褐變度與PPO活性呈顯著負相關(guān)(p<0.05),新3菌株的褐變度還與其TYR活性相關(guān)性顯著,但各菌株與漆酶和總酚的相關(guān)性并不顯著。在本研究中,巨大口蘑SCAU1、新3、新4三種菌株子實體在采后貯藏期間表現(xiàn)出不同的貯藏性能,綜合各測定指標分析得出SCAU1菌株的貯藏品質(zhì)最佳,新4菌株次之,新3菌株的貯藏品質(zhì)最不理想。此研究結(jié)果可以為巨大口蘑在推廣種植時,菌株品種的選育提供一定的指導。