植物乳桿菌CICC 20270微膠囊的制備及其特性

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(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047)

在功能性食品或醫(yī)藥領域,益生菌作為一種新型功能性添加成分,發(fā)揮著越來越重要的作用[1]。它們可以通過保持健康的腸道菌群、抑制病原菌的生長、刺激免疫系統(tǒng)、合成維生素和抗菌物質(zhì),以及促進鈣吸收來保證機體健康[2-3]。但益生菌菌體難以抵抗人體胃酸、膽鹽的毒害,使得益生菌產(chǎn)品被服用后,很難有足夠數(shù)量的活菌到達腸道而被利用[4]。因此,如何保持益生菌在加工儲存及機體攝入后的活性問題亟待解決。近幾十年來,在許多發(fā)酵食品中鑒定了植物乳桿菌菌株,并報道了其應用于各種功能性食品的益生菌潛力[5]。植物乳桿菌對腸道微生物有著重要影響,在食品發(fā)酵、工業(yè)乳酸發(fā)酵以及醫(yī)療保健等領域都有著廣泛的應用[6]。在人體回腸中植物乳桿菌存活率在7%左右,其定植效果比唾液乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、格氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌效果好,因此植物乳桿菌是良好的潛在益生菌菌株[7]。并且,維持生殖道菌群平衡研究中還發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌的存在有利于維持生殖道微生態(tài)平衡[8]。

微膠囊技術作為 21世紀的高新技術之一,已廣泛應用于醫(yī)學、食品、農(nóng)藥、化妝品、涂料、油墨等諸多領域[9]。噴霧干燥法是食品工業(yè)中最常用的制備微膠囊的方法。它是將進料溶液霧化到熱空氣干燥室中,液滴中的水分經(jīng)去除從而形成干燥粉末[10]。這一技術具有干燥顆粒粒度可控,易擴大連續(xù)生產(chǎn)的優(yōu)點[11]。此外,經(jīng)干燥的益生菌微膠囊還能減少運輸成本[12]。已經(jīng)有廣泛的報道證明,經(jīng)包埋的細菌細胞比游離細胞更加穩(wěn)定[13]。而制備微膠囊的關鍵問題之一就是選擇合適的壁材,這也是目前及未來幾年益生菌微膠囊化主要面臨的問題[14-15]。微膠囊常用壁材主要包括3類:碳水化合物,如海藻酸鈉、淀粉;植物膠類,如阿拉伯膠、卡拉膠;蛋白類,如乳清蛋白、明膠[16-17]。研究表明,多糖雖無乳化作用,但具有良好的成膜性,可形成質(zhì)密的玻璃體,對芯材起到良好的包埋作用,有助于提高包埋率[18]。

因此本試驗主要采用不同DE值糖漿作為壁材,以主要含有中/長鏈脂肪酸的椰子油/玉米油及植物乳桿菌CICC 20270(Lactobacillusplantarum)為芯材制備乳狀液后通過噴霧干燥制備微膠囊,探究微膠囊水分含量、菌存活率、微觀結構、耐熱性、儲藏穩(wěn)定性以及體外消化性質(zhì)。將L.plantarumCICC 20270與油脂共同作為芯材進行微膠囊化，使其包埋在內(nèi)部不僅可以避免外部不利因素對其造成傷害,利用腸溶性壁材又可使L.plantarumCICC 20270能夠在腸道內(nèi)被釋放出來,提高L.plantarumCICC 20270到達腸道后的活菌數(shù)量,使其能夠充分發(fā)揮益生功效。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌CICC 20270(Lactobacillusplantarum) 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;糖漿(DE25、DE18)江西恒頂食品有限公司;玉米油 東莞魯花食用油有限公司;椰子油 杭州旺源科技有限公司;MRS肉湯培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;PBS緩沖液 上海雙螺旋生物科技有限公司;其他化學試劑 均為國產(chǎn)分析純。

BXM-30R高壓滅菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司;SW-CJ-1FD無菌工作臺 蘇凈集團安泰公司;MDR.P-5噴霧干燥塔 無錫市現(xiàn)代噴霧干燥設備有限公司;GYB 30-6S高壓均質(zhì)機 上海東華均質(zhì)機有限公司;UItra Turrax T25高速剪切分散機 德國IKA公司;FEI Quanta200F環(huán)境掃描電子顯微鏡 美國FEI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的活化與培養(yǎng) 將保存在甘油中的菌種接入到已滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中,于37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h,再以2.5% V/V轉接于新鮮已滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h,獲得處于穩(wěn)定期的L.plantarumCICC 20270;再將菌液以4000 r/min,4 ℃離心20 min,棄上清液,收集菌體,用 0.85%的無菌生理鹽水洗滌,以4000 r/min,4 ℃再次離心5 min,棄上清液,收集菌泥。最后用平板計數(shù)法對該濃縮菌泥進行精確計數(shù)。

1.2.2 微膠囊的制備 稱取一定量單甘酯(0.4%,w/w)、硬脂酰乳酸鈉(0.12%,w/w)加入到玉米油或椰子油(4.5%,w/w)中,加熱攪拌使之熔化溶解;再稱取酪蛋白酸鈉(0.6%,w/w)、磷酸氫二鉀(0.2%,w/w)加入到320 mL蒸餾水中,待完全溶解后加入DE25或DE18糖漿(13.6%,w/w),攪拌均勻。將上述油相物料與水相物料混合,磁力攪拌器攪拌30 min,加入1.2.1收集的菌泥,使得菌細胞濃度約為109CFU/mL,再通過高速剪切分散機10000 r/min分散1 min,最后經(jīng)40 MPa高壓均質(zhì)機處理制得菌懸液。使用實驗室規(guī)模噴霧干燥塔進行噴霧干燥實驗,設置進風溫度為135 ℃[19-20],出風溫度75 ℃,將噴霧干燥后收集的干粉樣品存放在密封的無菌瓶中,并置于4 ℃冰箱保存。

1.2.3 水分含量測定 將托盤放置在105 ℃烘箱中干燥至恒重,然后將其置于干燥器中冷卻至室溫,稱重記錄托盤質(zhì)量為m0。稱取5 g微膠囊樣品于托盤中,再次稱重記錄為m1。將裝有樣品的托盤置于105 ℃烘箱中,24 h后取出放于干燥器中冷卻至室溫,稱重記錄為m2。樣品水分含量為:

1.2.4L.plantarumCICC 20270的活菌計數(shù) 為了測定L.plantarumCICC 20270包埋前后的存活率,要對噴霧干燥前后的活菌細胞進行平板計數(shù)[7]。取1 g益生菌微膠囊溶解在9 mL PBS中,搖床振蕩30 min,使菌細胞得到完全釋放。噴霧干燥前取1 mL菌液溶解在9 mL PBS中并混合均勻。之后取一定量液體進行梯度稀釋后選擇合適的濃度,再取100 μL涂布到MRS瓊脂平板上,在37 ℃下培養(yǎng)48 h。對菌落為20～200的平板進行計數(shù),記錄為CFU/g,每個濃度取2個平板。

1.2.5 微膠囊掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)觀察 采用掃描電子顯微鏡對益生菌微膠囊形態(tài)進行觀察。將微膠囊粉末粘附在雙面碳帶上,隨后立即噴金在5 kV加速電壓下，觀察益生菌微膠囊表面結構。

1.2.6 微膠囊熱處理性質(zhì) 微膠囊熱處理參照Shah[21]等的實驗方法。稱取0.5 g益生菌微膠囊置于含4.5 mL無菌蒸餾水的試管中,并將試管置于55、65、75 ℃的水浴鍋中進行熱處理,在處理0、1、10 min時取1 mL樣品進行梯度稀釋,選取合適的稀釋度平板計數(shù)。未經(jīng)包埋的游離益生菌作為陰性對照。

1.2.7 微膠囊儲藏穩(wěn)定性分析 稱取5 g益生菌微膠囊置于稱量瓶中,將稱量瓶放置于4、25、37 ℃環(huán)境下。儲藏周期均為5周,每周稱取0.5 g樣品至4.5 mL PBS溶液中,選擇合適的稀釋梯度后進行平板計數(shù)。另稱取5 g益生菌微膠囊于敞口稱量瓶中,置于底部分別盛有適量飽和氯化鎂、飽和硝酸鎂和飽和氯化鈉的干燥器內(nèi),干燥器內(nèi)濕度控制為33%、52%、75%,并將干燥器置于25 ℃環(huán)境下。

1.2.8 體外消化性質(zhì)分析 模擬胃液的配制:取一定量的胃蛋白酶(0.32%,w/w)和NaCl(0.2%,w/w),加入50 mL無菌蒸餾水后用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0,過0.22 μm濾膜除菌備用。模擬腸液的配制:取胰酶(0.1%,w/w)和膽鹽(0.08%,w/w)至0.2 mol/L的PBS(pH7.4)中,過0.22 μm濾膜除菌備用。

將模擬胃液與模擬腸液在37 ℃下預熱,取0.1 g益生菌微膠囊或0.1 mL益生菌懸浮液于9.9 mL模擬胃液中,37 ℃不斷振蕩,于0、1、2 h取1 mL樣品至9 mL PBS中,37 ℃攪拌振蕩30 min,使益生菌微膠囊完全崩解,選擇合適的稀釋梯度接種到MRS培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后進行平板計數(shù)。經(jīng)過2 h模擬胃液后,用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4,然后加入10 mL模擬腸液,37 ℃不斷攪拌,在連續(xù)模擬胃腸液消化培養(yǎng)3、4、5、6 h時，取1 mL樣品梯度稀釋后進行平板計數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有實驗均為三組重復,運用Origin 9.1作圖,使用SPSS 16.0對數(shù)據(jù)進行差異性顯著分析。

2 結果與分析

2.1 微膠囊水分含量及L. plantarum CICC 20270的活菌計數(shù)

低水分含量對于益生菌微膠囊的穩(wěn)定性非常重要。較少的游離水不利于微生物生化反應的進行,因此可以提高益生菌微膠囊的保質(zhì)期[22]。與Ortega等[23]研究結果低水分含量利于微膠囊中微生物的存活并且可以降低粉末粘性、減少結塊現(xiàn)象相一致。水分含量的不同取決于噴霧干燥過程中進出口溫度、液滴形成機理以及進料溶液的組成和濃度[24-25]。相關報道還指出噴霧干燥出口空氣溫度的降低使其相對濕度增加,從而會導致粉末含水量的增加[26]。表1所示的各微膠囊樣品的水分含量在3.61%～3.71%,4種微膠囊樣品的含水量沒有顯著性差異(p>0.5),且本文微膠囊水分含量均低于參考文獻中水分含量4%～7%[27],說明具有較低的吸濕性利于其儲藏穩(wěn)定性。

噴霧干燥前后L.plantarumCICC 20270菌活數(shù)的變化情況如表1所示。微膠囊中活菌細胞數(shù)量下降都小于1 lg CFU/g,存活率均在90%以上。消費產(chǎn)品中益生菌濃度要達到106CFU/mL或推薦每天攝入108～109益生菌，才能為機體提供健康益處[28]。本文研究的噴霧干燥后微膠囊中的菌活細胞濃度均達到建議攝入量。因此采用噴霧干燥制備L.plantarumCICC 20270 微膠囊時,DE25、DE18糖漿都能作為良好壁材,分別包埋玉米油或椰子油后對L.plantarumCICC 20270能起到一定的保護效果。

表1 噴霧干燥前后L. plantarum CICC 20270活菌數(shù)及微膠囊水分含量Table 1 Cell number of L. plantarum 20270 and moisture content of spray dried microcapsules before and after drying

2.2 微膠囊掃描電鏡觀察

圖1為微膠囊樣品表面形態(tài)的掃描電鏡圖。由于微膠囊水分含量均較低,因此樣品沒有出現(xiàn)明顯粘連狀態(tài)。在500倍電鏡下(圖1A～D)可以觀察到,DE18微膠囊顆粒皺縮程度明顯大于DE25微膠囊,且后者形態(tài)結構基本呈完整球狀。在1000倍電鏡下(圖1a～d)可以看出，以DE25糖漿為壁材的微膠囊顆粒表面較DE18的更平滑、完整性更好,并且顆粒表面由于失水出現(xiàn)的微孔也較少。出現(xiàn)這一現(xiàn)象是由于DE值越低的糖漿隨著外界溫度的升高,粘性更容易降低,進而導致微膠囊表面結構不穩(wěn)固。同樣的,以DE18糖漿為壁材的微膠囊顆粒表面褶皺程度更大也是由于其表面結構不穩(wěn)固,在噴霧干燥中因溫度過高迅速失水而造成。有研究報道指出,微膠囊顆粒表面的光滑度會影響其性質(zhì)(例如溶解度,水分活度),同時影響活菌細胞的數(shù)量[29]。因此以DE25糖漿為壁材的微膠囊利于活菌數(shù)的提高,并且由于其緊密結構也將有助于緩慢釋放包埋的益生菌,提供較高的抗胃酸消化的功能。

2.3 微膠囊熱處理性質(zhì)

未經(jīng)包埋的L.plantarumCICC 20270及噴霧干燥后的微膠囊樣品經(jīng)熱處理后其菌活情況如圖2所示。未經(jīng)包埋的益生菌隨著熱處理溫度升高以及時間的延長,菌活數(shù)均顯著(p<0.05)下降。經(jīng)55 ℃熱處理1 min后各微膠囊樣品之間菌活下降沒有顯著性差異(p>0.05),10 min熱處理后椰子油微膠囊菌活量下降程度比玉米油微膠囊更大;而相同油脂與不同DE值糖漿制備的益生菌微膠囊樣品之間菌活下降沒有顯著差異(p>0.05)。65 ℃熱處理1 min后,DE25/椰子油微膠囊菌存活率為75.66%,為四個樣品中最低;10 min后,菌細胞數(shù)最低的是DE18/椰子油微膠囊,存活率為49.82%。在65 ℃整個熱處理過程中,DE25/玉米油微膠囊的菌活存活率最高。75 ℃熱處理1 min及10 min后,DE18/椰子油微膠囊的益生菌存活率均最低,分別為38.40%、15.08%;而DE25/玉米油微膠囊的存活率仍然是最高,分別為46.10%、25.73%。綜述所述,玉米油微膠囊表現(xiàn)出比椰子油微膠囊更好的耐熱性。

圖2 微膠囊熱處理后L. plantarum CICC 20270的活菌數(shù)Fig.2 The cell number of L. plantarum CICC 20270 after heat treatment of microcapsules

2.4 儲藏穩(wěn)定性

不同益生菌微膠囊及未經(jīng)包埋的益生菌分別在4、25、37 ℃條件下儲藏5周的益生菌存活情況如圖3所示。在4 ℃條件下(圖3a),4種微膠囊樣品菌活均未出現(xiàn)顯著性下降,說明在低溫條件下益生菌微膠囊的性質(zhì)都較穩(wěn)定。圖3b中觀察到,25 ℃環(huán)境下4種益生菌微膠囊活菌數(shù)出現(xiàn)了不同程度的下降。其中DE25/椰子油包埋的益生菌活菌數(shù)下降最大(3.52 lg CFU/g),其次是DE18/椰子油微膠囊,DE25/玉米油包埋的益生菌下降最少(2.32 lg CFU/g)。在37 ℃條件下(圖3c),同樣可以觀察到椰子油微膠囊活菌數(shù)下降數(shù)均比玉米油微膠囊下降得更多。這可能是與椰子油和玉米油的熔點分別約為28、-11 ℃,在37 ℃儲存過程中,椰子油會發(fā)生物理狀態(tài)改變導致微膠囊結構發(fā)生破壞,從而致使益生菌裸露在外界環(huán)境中有關。因此,玉米油更利于微膠囊在較高溫度環(huán)境中的儲存。

圖3 微膠囊在不同溫度條件下儲藏5周的活菌數(shù)變化Fig.3 Changes in viable cell concentration of the microcapsules stored for 5 weeks under different temperature注a:4 ℃;b:25 ℃;c:37 ℃。

圖4為益生菌微膠囊及未經(jīng)包埋的益生菌在25 ℃不同濕度條件下儲藏5周的菌活情況。Poddar 等[30]報道在存儲過程中,儲藏環(huán)境中的水分含量對益生菌的存活率有較大的影響,隨著水分含量的增加,益生菌的存活率將不斷降低。由圖4看出隨著環(huán)境中濕度的不斷增大,益生菌菌活下降程度越大,與Poddar等的報道相一致。在33%的環(huán)境濕度條件下(圖4a),益生菌微膠囊在長時間下可以保持相對較高的活菌數(shù)。從圖4b中觀察到在同一芯材情況下,以DE18糖漿為壁材的微膠囊比DE25活菌數(shù)下降程度更大,這一趨勢與圖4a相同。而在75%環(huán)境濕度條件(圖4c)條件下,各微膠囊樣品活菌數(shù)下降趨勢有所不同。但DE25微膠囊活菌數(shù)下降數(shù)量仍低于DE18微膠囊。由圖4三種不同環(huán)境濕度條件下呈現(xiàn)的整體趨勢來看,相對于芯材的不同產(chǎn)生的差異,糖漿的DE值不同對儲存過程中活菌數(shù)的影響更大,且DE25糖漿給益生菌提供了更好的保護效果。有研究報道指出碳水化合物尤其是多糖,可以作為細菌的選擇性營養(yǎng)素[31]。因此在儲存過程中,L.plantarumCICC 20270可以通過利用糖漿來維持基本生命活動。在之前的研究中(未發(fā)表),以不同DE值糖漿作為碳源對L.plantarumCICC 20270進行液體培養(yǎng),顯示在DE25糖漿情況下培養(yǎng)液pH更低,菌濃度更大。因此,相對于DE18糖漿,L.plantarumCICC 20270將優(yōu)先選擇DE25糖漿作為營養(yǎng)素維持自身基本生命活動,從而利于其在儲存過程中的存活。

圖4 微膠囊在不同濕度條件下儲藏5周的活菌數(shù)變化Fig.4 Changes in viable cell concentration of the microcapsules stored for 5 weeks under different humidity注:a:33%;b:52%;c:75%。

2.5 益生菌微膠囊體外消化性質(zhì)

益生菌微膠囊的體外模擬消化性質(zhì)如圖5所示。包埋與未經(jīng)包埋的益生菌在連續(xù)模擬胃腸液中菌活差異較大。未經(jīng)包埋的游離益生菌在模擬胃液0～2 h后菌活數(shù)急劇下降,2 h后菌活數(shù)趨于0。而經(jīng)包埋的益生菌在2 h的模擬胃液消化后活菌數(shù)顯著(p<0.05)得到提高。在低pH環(huán)境下,糖漿和油脂對益生菌起到了很好的緩沖作用,使得益生菌不會快速暴露于外界環(huán)境中。連續(xù)6 h模擬胃腸液消化后,DE25/椰子油微膠囊在整個過程中活菌數(shù)只下降了3.88 lg CFU/g,存活率最高。以相同油脂為芯材的微膠囊,DE25糖漿相比DE18糖漿使得益生菌得到緩慢釋放,并提供了更好的抗胃酸消化功能。其中,玉米油微膠囊活菌數(shù)下降程度均比椰子油微膠囊大,這可能是因為椰子油中主要含有中鏈脂肪酸,而玉米油中主要含有長鏈脂肪酸的原因。在機體腸道中,中鏈脂肪酸由于其特殊的吸收、轉運及氧化途徑,與長鏈脂肪酸相比,能夠被快速吸收、轉運和氧化,并產(chǎn)生能量[32]。并且中鏈脂肪酸被認為是抗生素替代品,它們對革蘭氏陽性菌和大腸桿菌都具有很強的抗菌活性[33]。在模擬腸液中,中鏈脂肪酸可以被益生菌吸收利用產(chǎn)生短鏈脂肪酸降低環(huán)境pH起到抗菌作用,使得益生菌存活率得到提高。近年來越來越多的研究表明，中鏈脂肪酸發(fā)揮著積極的生理作用,尤其在結腸中[34]。腸道中的短鏈脂肪酸能夠通過抑制巨噬細胞的分化和成熟來抑制巨噬細胞的吞噬能力,且降低活性氧的產(chǎn)生,并且能夠改善腸道菌群,增加厭氧菌的產(chǎn)生[18]。并且,中鏈脂肪酸的缺乏與炎癥性腸病(結腸炎、腹瀉)有關,特別是丁酸,在抑制結腸癌發(fā)生過程中起著重要的作用[35-36];Tedelind等[37]也報道了中鏈脂肪酸可以作為結腸癌的免疫調(diào)節(jié)劑。相關研究表明，中鏈脂肪酸除了這種抗菌活性,同樣也可以改善斷奶仔豬的腸道發(fā)育[38],這進一步說明了中鏈脂肪酸可以被益生菌直接利用，并促進機體腸道環(huán)境中活菌數(shù)的提高。

圖5 不同益生微膠囊的體外消化性質(zhì)Fig.5 In vitro digestibility of different probiotic microcapsules

3 結論

本試驗主要采用DE25、DE18兩種DE值糖漿為壁材,玉米油/椰子油作為芯材,添加入L.plantarumCICC 20270，并通過噴霧干燥法制備益生菌微膠囊,結果顯示制得的微膠囊包埋率均在90%以上。SEM觀察到DE25微膠囊形態(tài)更加圓整光滑,皺縮程度明顯小于DE18微膠囊。在不同溫度熱處理條件下,與椰子油微膠囊相比,玉米油微膠囊中L.plantarumCICC 20270存活率更高。選取DE25糖漿和玉米油制備微膠囊更有助于益生菌在儲藏環(huán)境中存活率的提高。但在體外模擬消化中,椰子油與DE25糖漿共同作用最有力提高了L.plantarumCICC 20270在模擬胃腸液中的存活率。因此可以得出結論,DE25糖漿更適合作為噴霧干燥法制備益生菌微膠囊的壁材,以玉米油為芯材利于其在儲存過程中的穩(wěn)定性,而椰子油更有助于益生菌在模擬胃腸液中的存活率的提高。