低溫脅迫對(duì)唐古特莨菪脯氨酸、丙二醛含量的影響研究

李生軍

以唐古特莨菪為研究對(duì)象，將唐古特莨菪植株置于4℃下培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間分別為24、48、72小時(shí)，研究低溫脅迫下唐古特莨菪脯氨酸（Pro）、丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性的變化。結(jié)果表明，唐古特莨菪脯氨酸含量隨著低溫脅迫時(shí)間的增加而逐漸增加；丙二醛含量隨著低溫脅迫時(shí)間的增加而呈現(xiàn)先上升再下降再上升的趨勢(shì)。

1 材料和方法

1.1 材料

材料取自通過(guò)無(wú)菌培育的唐古特莨菪（Anisodus Tanguticus）。

1.2 材料處理

將上述培養(yǎng)好的唐古特莨菪植株置于4℃條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間分別為24 48 72小時(shí)。處理后的材料分別進(jìn)行脯氨酸含量測(cè)定、丙二醛含量測(cè)定、超氧化物歧化酶活性測(cè)定測(cè)定，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。同時(shí)進(jìn)行對(duì)照處理，測(cè)出室溫（25℃）下唐古特莨菪體內(nèi)的脯氨酸含量、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性。

1.3 生理指標(biāo)的測(cè)定

1.3.1 脯氨酸含量的測(cè)定

稱取0.20g鮮葉，剪碎置于具塞試管中，加3%的磺基水楊酸溶液5mL，沸水浴中浸提10min，冷卻至室溫，取上清液2mL，加2mL冰乙酸和2.5%酸性茚三酮顯色液3mL，沸水浴中顯色40min，冷卻，用5mL甲苯萃取，測(cè)定520nm波長(zhǎng)下的的消光值。

根據(jù)回歸方程計(jì)算出2mL測(cè)定液中脯氨酸含量（ug/mL），然后計(jì)算出樣品中脯氨酸含量的百分?jǐn)?shù)，計(jì)算公式：?jiǎn)挝货r重樣品的脯氨酸含量=（x×2/5）/（樣重×106）×100%。

1.3.2 丙二醛含量的測(cè)定

丙二醛的提?。悍Q2g葉片，加入5mL磷酸緩沖液（50mmol，pH值為7.8）及少量石英砂，于冰浴中研磨提取，勻漿液以12000r離心力作用下（4度）離心10min，其上清液即為丙二醛提取液。

丙二醛的測(cè)定：取1mL丙二醛提取液，加3mL 27%三氯乙酸和1mL2%TBA?；旌鸵涸?5度水浴中保溫30min后，立即置于冰浴中冷卻，然后離心10min，于波長(zhǎng)532nm和600nm下測(cè)定OD值。

以測(cè)得的OD532減去OD600的非特異吸收值，按155mmoL-1cm-1消光系數(shù)計(jì)算丙二醛含量。分別計(jì)算衰老和對(duì)照組的值。丙二醛濃度（μmol/L）=6.45（D532-D600）-0.56D450

丙二醛含量（μmoL/g FW）

=

其中D450=0，D450、D532、D600分別代表450nm、532nm和600nm波長(zhǎng)下的光密度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對(duì)唐古特莨菪游離脯氨酸含量的影響

唐古特莨菪中脯氨酸含量隨低溫處理變化：唐古特莨菪葉片脯氨酸的含量是隨著低溫脅迫時(shí)間的增加而增加的。在低溫脅迫下，游離脯氨酸含量逐漸積累，并隨低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，游離脯氨酸含量逐漸增加，與對(duì)照相比，其含量始終高于對(duì)照。從對(duì)照可以看出，唐古特莨菪脯氨酸含量在室溫（25℃）變化不大，求的平均數(shù)為97.87ug/g。隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其脯氨酸含量在72小時(shí)時(shí)最大，24小時(shí)的脯氨酸含量為375ug/g，48小時(shí)的脯氨酸含量為1166.18 ug/g，增幅為210.98%，72小時(shí)的脯氨酸含量為1964.95ug/g，從48小時(shí)到72小時(shí)脯氨酸含量的增幅為68.49%。從以上的數(shù)據(jù)可以看出，24小時(shí)到48小時(shí)的脯氨酸含量顯著增加，48小時(shí)到72小時(shí)的脯氨酸含量增加趨勢(shì)變緩，說(shuō)明唐古特莨菪對(duì)低溫有一定的適應(yīng)性。

2.2 低溫脅迫對(duì)唐古特莨菪丙二醛含量的影響

為了了解唐古特莨菪葉片在不同溫度處理下的細(xì)胞膜完整性，測(cè)定了不同時(shí)間處理階段葉片丙二醛含量。結(jié)果表明：在低溫脅迫下，丙二醛含量逐漸積累，并隨低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，丙二醛含量逐漸增加-減少-增加，與對(duì)照相比，其含量始終高于對(duì)照。從對(duì)照可以看出，唐古特莨菪丙二醛含量在室溫（25℃）變化不大，根據(jù)求平均數(shù)知：0.0081mmol·g·FW-1。隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其丙二醛含量在24小時(shí)時(shí)最大，24小時(shí)的丙二醛含量為0.4193mmol·g·FW-1，48小時(shí)的丙二醛含量為0.0451mmol·g·FW-1，增幅為-89.24%，72小時(shí)的丙二醛含量為0.2903mmol·g·FW-1，從48小時(shí)到72小時(shí)丙二醛含量的增幅為543.68%。從以上的數(shù)據(jù)可以看出，24小時(shí)到48小時(shí)的丙二醛含量顯著降低，48小時(shí)到72小時(shí)的丙二醛含量增加趨勢(shì)變緩，說(shuō)明唐古特莨菪在24小時(shí)到48小時(shí)對(duì)低溫的適應(yīng)性有所降低，在48小時(shí)到72小時(shí)對(duì)低溫有一定的適應(yīng)性。

3 討論

3.1 低溫脅迫與脯氨酸的關(guān)系

脯氨酸也被認(rèn)為是植物在逆境脅迫下的產(chǎn)物。它是一種水合能力較強(qiáng)的氨基酸，其含量的增加有助于細(xì)胞持水和生物大分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。大量的測(cè)試結(jié)果表明，脯氨酸的積累與細(xì)胞的脫水有關(guān)，由于脅迫引起脫水，因此發(fā)生脯氨酸的積累。它的積累除可起到滲透調(diào)節(jié)外，更重要的是對(duì)膜脂和蛋白起到保護(hù)作用，防止活性氧對(duì)膜脂和蛋白的過(guò)氧化作用。植物的抗性與脯氨酸的含量存在相關(guān)性。由此可以認(rèn)為低溫脅迫下唐古特莨菪葉片內(nèi)脯氨酸的升高也有助于提高它的抗性，因此可以認(rèn)為葉片內(nèi)脯氨酸含量的高低可作為衡量唐古特莨菪的抗性指標(biāo)。本研究中，隨著低溫脅迫程度的加深，唐古特莨菪中脯氨酸含量隨時(shí)間變化升高的變化趨勢(shì)，在低溫培養(yǎng)時(shí)間段內(nèi)72小時(shí)時(shí)唐古特莨菪葉片內(nèi)脯氨酸含量達(dá)到最大。

3.2 低溫脅迫與丙二醛含量的關(guān)系

由于低溫脅迫，細(xì)胞內(nèi)活性氧代謝的平衡被破壞，從而導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生，活性氧的毒害之一是引發(fā)或加劇膜脂過(guò)氧化作用，造成細(xì)胞系統(tǒng)的損傷，因而作為膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物；丙二醛含量的變化是質(zhì)膜損傷程度的重要標(biāo)志之一。電解質(zhì)滲透率也是反映植物組織受脅迫后細(xì)胞原生質(zhì)膜透性大小的重要指標(biāo)。細(xì)胞質(zhì)膜透性變化是鑒定植物抗寒性較常用的方法，已被廣泛應(yīng)用。葉片質(zhì)膜透性的變化可以反映逆境對(duì)細(xì)胞膜的傷害程度，相對(duì)質(zhì)膜透性與植物細(xì)胞膜受傷害的程度成正相關(guān)。本研究中，隨著低溫脅迫程度的加深，唐古特莨菪葉片中丙二醛含量逐漸升高，表明膜脂過(guò)氧化程度加劇，質(zhì)膜受傷害程度不斷加深。

（作者單位：810023青海省海北州草原工作站）