基于16S rRNA測序的海南坡鹿腸道菌群結構分析

王 悅蘇 力 陳興永陳 武 田秀華楊鍇斌

(1.慶元縣林業(yè)局，麗水，323800；2.廣州動物園，廣州，510070；3.東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040；4.浙江鳳陽山-百山祖國家級自然保護區(qū)百山祖管理處，麗水，323800)

腸道微生物(Gut microorganism)指的是動物腸道內復雜的、全部的動態(tài)變化的微生物群落，腸道微生態(tài)系統(tǒng)與宿主的營養(yǎng)、代謝和免疫等方面密切相關[1]。腸道菌群包括益生菌、有害菌、條件致病菌3種[2]，腸道細菌含條件性致病菌，表明胃腸道是病原體入侵的潛在途徑[3]。腸道菌群是一個復雜的生態(tài)系統(tǒng)，它與許多其他因素的相互作用共同影響宿主的健康和疾病[4]。動物腸道微生物群在出生后開始繁殖，宿主和腸道微生物群共同構成參與宿主免疫和消化系統(tǒng)正確功能的腸微生物群，一旦“宿主—腸道微生物群”系統(tǒng)不平衡，就會出現各種疾病[5]。由于宿主年齡，日糧組成，生活方式和環(huán)境以及其他因素都影響宿主腸道微生物群的組成，因此腸道微生物群的組成并不固定[6-8]。研究數據表明，飲食是影響腸道微生物群組成的重要因素[9-10]。

腸道菌群是宿主的一個組成部分。微生物群在宿主適應性中起關鍵作用，包括腸細胞的增殖，對病原體的防御，次生代謝物的產生和復合碳水化合物的消化[11]。此外，腸道微生物群的存在可以促進腸上皮細胞的分化并抵抗病原微生物的侵襲[12]。草食動物研究表明，腸道微生物群可分解纖維素并代謝降解食物和毒素[13]。對于反芻動物來說尤其如此，因為它們獨特的消化特性和微生物有助于適應高纖維含量的食物，同時也使它們易患多種疾病[14]。因此，與大多數其他動物相比，反芻動物的腸道菌群在物種生物學中發(fā)揮更突出的作用[15]。

海南坡鹿(Cervuseldiihainanus)是珍貴瀕危的熱帶鹿種，曾廣泛分布于海南島[16]。海南坡鹿是我國國家Ⅰ級保護動物，曾因人類活動等原因瀕臨滅絕，后通過建立保護區(qū)設圍欄使其種群恢復并擴大。時至今日，由于保護區(qū)內其天敵蟒蛇(Pythonmolurusbivittatus)數量的增加等原因，致使海南坡鹿種群數量一再減少，海南坡鹿種群再度面臨危機，目前對于該物種保護問題還有待解決。當前對于海南坡鹿的研究主要集中在行為習性、種群動態(tài)、生境選擇、食性等領域，而關于海南坡鹿腸道菌群相關的研究還未見報道?？紤]到哺乳動物腸道菌群多樣性對腸道的穩(wěn)態(tài)與健康的重要性，本研究從海南坡鹿的腸道菌群出發(fā)，致力于篩選益生性芽孢桿菌并通過高通量測序技術對海南坡鹿腸道菌群多樣性進行研究，探索其腸道菌群結構和多樣性以及不同性別間腸道菌群的差異，為將來篩選新的菌種以及在野生動物保護中的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

采用非損傷性的糞便取樣法，采集廣州動物園健康海南坡鹿的新鮮糞便，為減少空氣及土壤中的雜菌干擾，只取糞便的中間段并進行微生物DNA的提取及測序分析。糞便樣品對應的個體信息如表1。其中，雌性為A組，雄性為B組。

表1 樣品信息

Tab.1 Information of samples

1.2 實驗方法

使用QIAamp?Stool Mini Kit試劑盒，根據說明書提取海南坡鹿糞便樣品的總基因組DNA，對PCR產物進行切膠純化，采用生工SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收產物，將所得到的DNA溶液置于-20℃保存或用于后續(xù)試驗。采用特異引物(515F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′；806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)針對樣品中16 S rRNA的V4區(qū)進行擴增，進行聚合酶鏈式反應PCR擴增，PCR擴增反應條件94℃預變性5 min，94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)，最后72℃再延伸10 min。利用Illumina平臺測序后去除低質量reads。使用FLASH軟件進行序列拼接，將雙末端測序得到的成對reads用重疊關系組裝成一條序列，得到高變區(qū)的Tags[17]。去除無重疊部分關系的reads，依靠reads間的重疊部分拼成Tags。

2 結果與分析

海南坡鹿16個樣品共得到有效序列677468條，平均每個樣品42341條，平均長度為252 bp。拼接的Tags經過優(yōu)化后，在97%相似度下將其聚類為用于物種分類的OTU(Operational taxonomic units)，統(tǒng)計每個樣品在每個OTU中的豐度信息(表2)。圖1是展現兩組樣品共有和特有OTU數目的venn圖，其中重疊部分表示A、B兩組共有的OTU數目為1275個，A組特有的OTU為199個，B組單獨有的OTU個數為40。

表2 樣品OTU統(tǒng)計

Tab.2 OTU Statistics

續(xù)表2

Tags number：樣品中能和OTU代表序列比對上，并且OTU具有注釋結果的Tags的總數

圖1 OTU venn圖Fig.1 OTU venn chart

2.1 海南坡鹿腸道菌群整體結構分析

2.1.1 海南坡鹿腸道菌群在門水平上結構分析

從16個海南坡鹿糞便樣品中，根據已確定的OTU分類確定其腸道菌群中的18個菌門(圖2)。其中，厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)在海南坡鹿的腸道菌群中含量最高，所占比例分別為50.49%和36.52%。其次是變形菌門(Proteobacteria)所占比例為3.137%、螺旋體門(Spirochaetes)的比例為2.891%、疣微菌門(Verrucomicrobia)的比例為2.121%、軟壁菌門(Tenericutes)的比例為1.679%、廣古菌門(Euryarchaeota)的比例為1.410%、TM7的比例為0.488%、浮霉菌門(Planctomycetes)的比例為0.413%、藍菌門(Cyanobacteria)的比例為0.215%。海南坡鹿腸道菌群含量最高的10個門中，廣古菌門屬古菌界，其余鑒定出的菌門均屬于細菌界。從圖2中可以看出海南坡鹿A、B兩組的菌群結構在門的分類水平上差異不大，且主要的微生物為厚壁菌門與擬桿菌門，其余菌門的含量相對較少。這些含量較少的菌門并非存在所有的個體中，其中纖維桿菌門(Fibrobacteres)只在110503FM、110602FM、110604FM、110402M、110403M、110505M個體中檢測到；Elusimicrobia在110502FM中所占比例為0；LD1只存在于110401FM、110501FM 110503FM、110602FM、110604FM、110606FM、110403M、110603M、110605M中；互養(yǎng)菌門(Synergistetes)只存在于110501FM、110502FM、110601FM、110403M、110505M個體；WPS-2只在110501FM、110601FM、110604FM三個個體中檢測到。

2.1.2 海南坡鹿腸道菌群在屬水平上結構分析

對海南坡鹿腸道菌群中豐度最高的10個屬進行了統(tǒng)計(圖3)，結果表明：豐度最高的屬為5-7N15，豐度值為7.181%，豐度排名第二的屬是普雷沃菌屬(Prevotella)，豐度為3.159%，其次是密螺旋體屬(Treponema)，豐度為2.788%、琥珀酸弧菌屬(Succinivibrio)豐度為2.545 %，顫螺菌屬(Oscillospira)豐度為2.304%、CF231豐度值1.843%、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)豐度為1.652%、艾克曼菌屬(Akkermansia)豐度為1.439%、甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)豐度為1.340%、梭菌屬(Clostridium)豐度值為1.333%。

2.1.3 物種在屬水平上的系統(tǒng)進化樹分析

圖4是在屬水平構建的物種系統(tǒng)進化樹，反映了物種的進化關系。統(tǒng)計注釋到確定的已分類的屬，選取豐度最高的作為代表序列構建而成。在進化樹中距離越近，表明物種系統(tǒng)關系越近，圖中樹枝的不同長度代表了物種進化的差異。注釋到的屬中，有3個屬隸屬于古菌界下的廣古菌門，分別是甲烷短桿菌屬、甲烷球形菌屬(Methanosphaera)、vadinCA11，其余屬均屬于細菌界。進化樹中顏色相同的屬表示屬于同一菌門，屬于細菌界的屬分屬于12個菌門，其中占比例最高的是厚壁菌門有46個屬，32個隸屬于梭菌目(Clostridiales)；其次是擬桿菌門12個屬，均屬于擬桿菌科(Bacteroidaceae)。

2.2 不同性別海南坡鹿腸道菌群物種差異分析

2.2.1 不同性別海南坡鹿腸道菌群在門水平上的差異分析

海南坡鹿A組和B組的腸道菌群的相對豐度在門水平上的差異柱形圖如圖5，對比兩組間在門水平上的差異物種發(fā)現A組螺旋體門、疣微菌門略大于B組；B組擬桿菌門和厚壁菌門略大于A組。通過t檢驗計算出差異顯著性，在95%的置信區(qū)間內，統(tǒng)計差異顯著(P<0.05)的門只有一個綠彎菌門(Chloroflexi)(表3)。

表3 T-test組間門水平上差異統(tǒng)計

Tab.3 Statistics species differences at phylumlevel between groups based on T-test

2.2.2 不同性別海南坡鹿腸道菌群在屬水平上的差異分析

圖6為海南坡鹿A組和B組的腸道菌群的相對豐度在屬水平上的差異柱形圖，從柱形圖可以看出A、B兩組在5-7N15屬、密螺旋體屬和艾克曼菌屬顯示出較大差異。通過t檢驗，統(tǒng)計出差異顯著(P<0.05)的屬共17個(表4)，在A組中豐度較高的屬有：脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、瘤胃桿菌屬(Ruminobacter)、梭菌屬、p-75-a5、草酸桿菌屬(Oxalobacter)、02d06、埃希氏菌屬(Escherichia)、YRC22、BF311、SHD-231、毛螺菌屬(Lachnospira)；在B組中豐度較高的屬有：5-7N15、Butyricicoccus、考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)、Anaeroplasma、Dorea、Blautia。

表4 T-test組間屬水平上差異統(tǒng)計

Tab.4 Statistics species differences at generalevel between groups based on T-test

圖2 門水平上的物種相對豐度Fig.2 The relative abundance of species on the phylum level

圖3 屬水平上的物種相對豐度Fig.3 The relative abundance of species on the genes level

圖4 物種系統(tǒng)進化樹Fig.4 Genus species phylogeny tree

圖5 不同性別海南坡鹿在門水平上的物種相對豐度Fig.5 The relative abundance of different sex species on the phylum level

圖6 不同性別海南坡鹿在屬水平上的物種相對豐度Fig.6 The relative abundance of different sex species on the genera level

圖7 LDA值分布柱狀圖和進化分支圖Fig.7 Distribution histogram and evolutionary branch graph based on LDA value

2.2.3 基于LefSe(LDA Effect Size)分析海南坡鹿雌雄組間物種差異

用LefSe確定海南坡鹿雌雄組間具有顯著差異的物種(圖7)，LDA評分直方圖顯示各組間具有統(tǒng)計學差異的生物標志(Biomarker)，柱形圖的長度代表LDA評分。該圖顯示了A組(紅色)和B組(綠色)之間具有顯著差異的微生物類群(LDA Score> 2)。在A組中具有豐度差異的有：脫硫弧菌屬、SHD_231、Streptophyta、Chloroflexi、厭氧繩菌科(Anaerolinaceae)、厭氧繩菌目(Anaerolineales)、厭氧繩菌綱(Anaerolineae)、Succiniclasticum、腸球菌屬(Enterococcus)、腸球菌科(Enterococcaceae)、埃希大腸桿菌(Escherichiacoli)、埃希氏菌屬、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、腸桿菌目(Enterobacteriales)、瘤胃桿菌屬、Chloroplast、p_75_a5、Adlercreutzia、毛螺菌屬、BF311、Christensenellaceae、F16、CW040、TM7_3、TM7、密螺旋體屬、螺旋體科(Spirochaetaceae)、螺旋體目(Spirochaetales)、螺旋體門；在B組中具有豐度差異的有：5_7N15、擬桿菌科、理研菌科(Rikenellaceae)、p_2534_18B5、Barnesiellaceae、Coprobacillus、考拉桿菌屬、Ruminococcus_callidus、Clostridium_hungatei、Blautia、Butyricicoccus_pullicaecorum、Butyricicoccus、Epulopiscium、Anaeroplasma。

進化分支圖顯示A組和B組之間在5個層次上分類群相對豐度差異的分類圖。由內至外輻射的圓圈代表了由門至屬(或種)的分類級別，每個不同分類的小圓圈代表一個分類單元，圓的直徑與相對豐度成正比。紅色和綠色圓圈表示A組和B組顯示相對豐度的差異，黃色圓圈表示無顯著差異的物種，進化分支圖與LDA值分布柱狀圖的結果是一致的。

3 討論

動物糞便中存在的微生物反映了腸道微生物群落的總體組成[18]。本實驗中糞便取樣是非損傷性的，因此可減少對瀕?；螂[蔽物種造成的傷害或影響。本研究采用16S rRNA高通量測序來分析海南坡鹿腸道菌群結構，糞便DNA的高通量測序可以很好地解釋細菌群落，因為它能有效地處理混合DNA模板，一些近期的研究也采用這項技術來探索不同物種的微生物，如人類[19]、梅花鹿(Cervusnippon)[20]、林麝(Moschusberezovskii)[21]、牛[22]、川金絲猴(Rhinopithecusroxellana)[23]等。腸道微生態(tài)系統(tǒng)是一個不斷發(fā)展的系統(tǒng)，其物種多樣性和豐富度對于維持宿主的正常生理狀態(tài)具有重要的功能作用。然而，腸道微生物群也受到宿主的影響[24]。根據研究的數據顯示，食性是影響哺乳動物腸道微生物群的主要因素[25-26]。在本次研究中，海南坡鹿的飼料主要由象草、燕麥草、黃豆、番薯、顆粒料、蘋果和胡蘿卜組成。

通過對雌性、雄性海南坡鹿腸道菌群的比較發(fā)現，不同性別海南坡鹿的腸道菌群多樣性無明顯差異，但腸道菌群結構有顯著差異。對海南坡鹿腸道菌群結構及多樣性分析發(fā)現，海南坡鹿糞便菌群分屬于18個菌門，其中核心菌門是厚壁菌門和擬桿菌門，這與其他學者在反芻動物中的觀察結果一致[27-30]，而在一些關于肉食性動物如豺(Cuonalpinus)的研究中，厚壁菌門并不總是最主要的菌門，也可能排在擬桿菌門之后[31]。這些菌門主宰著許多陸生脊椎動物的細菌群落，表明這個群體在腸道內具有生態(tài)和功能重要性[32-33]。厚壁菌是主要的纖維素分解細菌，并將纖維降解為揮發(fā)性脂肪酸以供宿主利用，擬桿菌的主要功能是幫助宿主降解碳水化合物(尤其是多糖)、蛋白質和其他物質，以提高宿主的營養(yǎng)利用率，維持腸道微生物生態(tài)平衡，還可促進免疫系統(tǒng)發(fā)育以增強宿主免疫[34-36]。擬桿菌也是機會性病原體，當正常的微生物生態(tài)平衡被破壞時，這些細菌會引起內源性感染[21]。有研究結果顯示，胃腸道疾病動物和健康個體的腸道微生物群存在顯著差異：一些擬桿菌菌種增加，而乳酸菌種減少[37]。乳酸菌的作用是可以抑制多種病原菌，如沙門氏菌、肺炎球菌、致病性腸桿菌和葡萄球菌等。因此圈養(yǎng)海南坡鹿的腸胃疾病高發(fā)可能是由這種情況引起的。變形菌門是繼厚壁菌門和擬桿菌門之后豐度最高的門，是大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)中最主要的菌門，它可以幫助其降解主要食物中的木質素[38]，變形菌門還能夠分解牛動物飼料的各種組分[39]，因此變形菌門的相對豐度較高可能是由于人工飼喂的顆粒料等。

普雷沃菌屬是海南坡鹿腸道菌群的核心菌屬，可能與纖維生物量或單寧的降解有關，普雷沃菌屬于氫消耗菌，可通過二羧酸途徑或丙烯酸途徑產生丙酸，反過來可能導致甲烷產量下降，因為二羧酸或丙烯酸途徑可以與甲烷菌競爭氫氣[40]。琥珀酸弧菌屬可以利用糖分解產生的有機酸，使前胃中產生的有機酸不會積聚。