非肝炎病毒相關(guān)性肝細(xì)胞癌組織中鳥苷酸交換因子ECT2的表達(dá)變化及其意義

夏念信，趙文超，馬鵬飛，王敬晗，祝建勇，邱寶安

(海軍總醫(yī)院，北京 100438)

肝細(xì)胞癌(以下簡(jiǎn)稱肝癌)是最常見的肝臟原發(fā)性惡性腫瘤，為世界范圍內(nèi)腫瘤所致男性第二位、女性第六位的死亡原因[1]。由于肝癌起病隱匿，大多數(shù)患者在確診時(shí)已失去手術(shù)機(jī)會(huì)[2]。由于肝癌血管侵犯、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、肝內(nèi)播散的生物學(xué)特點(diǎn)，導(dǎo)致其手術(shù)效果差，術(shù)后復(fù)發(fā)概率高。因此多學(xué)科綜合治療(MDT)策略逐步得到重視。其中靶向藥物的篩查和選擇逐步成為肝癌治療的重要一環(huán)。上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化序列癌基因(ECT2癌基因)，其編碼蛋白為鳥苷酸交換因子ECT2。既往的研究表明，ECT2能夠作用于RhoA GTP酶家族成員，通過催化鳥苷酸交換，起到調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂的作用[3]。ECT2在多種腫瘤組織中高表達(dá)，其產(chǎn)物能夠調(diào)控細(xì)胞增生與凋亡[4,5]。已有研究表明，ECT2在肝癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)病灶樣本中表達(dá)水平增加，并與預(yù)后相關(guān)[6]。但肝癌的致病因素較多，乙肝及丙肝病毒感染所致的慢性肝炎是肝癌發(fā)生及早期復(fù)發(fā)的重要因素。但非病毒相關(guān)性危險(xiǎn)因子，如乙醇攝入等也發(fā)揮了重要作用，且與肝炎病毒相關(guān)性是否具備相同的致癌機(jī)理尚不明確。本研究觀察了非肝炎病毒相關(guān)性肝癌組織中ECT2的表達(dá)變化，并探討其與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源及處理 收集2004年1月～2010年1月海軍總醫(yī)院肝膽外科的78例非肝炎病毒相關(guān)性肝癌手術(shù)切除標(biāo)本，同時(shí)每例患者另取距癌組織2～5 cm處的癌旁組織標(biāo)本作為對(duì)照。78例非肝炎病毒相關(guān)性肝癌患者中男56例、女22例，年齡24～69歲、中位年齡54歲，術(shù)后病理診斷均為肝癌，以上患者均未行術(shù)前新輔助化療或靶向藥物治療。患者隨訪60個(gè)月，中位生存時(shí)間43個(gè)月。將所有標(biāo)本分兩部分，其中一部分用4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片機(jī)切成4 μm厚的連續(xù)石蠟切片備用；另一部分液氮速凍后-80 ℃冰箱保存。

1.2 肝癌及其癌旁組織ECT2蛋白檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)染色法。常規(guī)固定，石蠟包埋，脫蠟、水化后采用三步免疫組化染色法(SP法，試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)檢測(cè)ECT2蛋白的表達(dá)。具體操作步驟如下：檸檬酸鹽緩沖液抗原修復(fù)，3% H2O2室溫孵育，磷酸鹽緩沖液沖洗，滴加1∶50稀釋的ECT2兔抗人多克隆抗體(Ahmar公司)，4 ℃冰箱孵育過夜，DAB(試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)顯色，蘇木素對(duì)比染色，逐級(jí)脫水、透明、封片，于顯微鏡下觀察、攝片并分析。以磷酸鹽緩沖液替代一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定：免疫組化染色陽性標(biāo)本的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜應(yīng)呈清晰黃褐色顆粒為陽性表達(dá)，高倍鏡(×400)下隨機(jī)觀察5個(gè)視野，根據(jù)陽性細(xì)胞百分率和染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析。染色強(qiáng)度：無染色計(jì)0分，輕度染色計(jì)1分，中度染色計(jì)2分，強(qiáng)染色計(jì)3分；陽性細(xì)胞數(shù)<10%計(jì)0分,10%～25%計(jì)1分,>25%～50%計(jì)2分，>50%計(jì)3分。將兩項(xiàng)指標(biāo)評(píng)分相乘，0～1為陰性，≥2為陽性。由兩位病理科醫(yī)師雙盲法計(jì)數(shù)，差異超過10%需重新計(jì)數(shù)。

1.3 肝癌及其癌旁組織ECT2 mRNA檢測(cè) 采用RT-PCR技術(shù)。按照說明書利用TRIzol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)提取肝癌組織及癌旁組織的總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)其濃度，而后按照逆轉(zhuǎn)錄說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，取得cDNA。內(nèi)參及ECT2引物由Invitrogen公司合成。ECT2引物序列上游：5′-ATTTTATCCACTAGCAAATCTTGATTTAGT-3′；下游：5′-ACAAATCATGGCTGAAAATAGTGTATTAAC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為254 bp。GAPDH引物序列上游：5′-GGGTGTGAACCATGAGAAGTATO-3′；下游:5′-GATGGCATGGACTGTGGTCAT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為268 bp。PCR反應(yīng)體系共25 μL:2×Taq PCR Master Mix(北京天根生化科技有限公司)12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，模板cDNA 1 μL，無核酶水9.5 μL;反應(yīng)條件94 ℃預(yù)變性3 min，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)擴(kuò)增(94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃延伸反應(yīng)5 min)。2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外燈下觀察結(jié)果。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 非肝炎病毒相關(guān)性肝癌及其癌旁組織ECT2蛋白及其mRNA表達(dá)比較 非肝炎病毒相關(guān)性肝癌及其癌旁組織ECT2蛋白表達(dá)陽性率分別為71.8%(56/78)、38.5%(30/78)，ECT2 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.53±0.05、0.38±0.09，兩者比較P均<0.05。

2.2 ECT2蛋白表達(dá)與非肝炎病毒相關(guān)性肝癌臨床病理特征的關(guān)系 ECT2蛋白表達(dá)陽性、陰性患者年齡分別為(49.00±5.65)、(53.00±4.32)歲，兩者比較P>0.05。ECT2蛋白表達(dá)與非肝炎病毒相關(guān)性肝癌其他臨床病理特征的關(guān)系見表1。

3 討論

肝癌一直是治療的難題，外科切除仍然是最有效的手段。然而，由于肝癌起病較隱匿，大多數(shù)患者確診時(shí)已無法手術(shù)切除；另外，即便是接受了根治性手術(shù)，術(shù)后腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然是影響手術(shù)效果的首要原因。

表1 ECT2蛋白表達(dá)與非肝炎病毒相關(guān)性肝癌

基于上述現(xiàn)狀，MDT逐步成為腫瘤治療的基本理念。在此背景下，尋找肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的基因變化，作為藥物治療的靶點(diǎn)，有著重要的臨床意義。ECT2基因定位于人染色體3q26.31，具有高度的進(jìn)化保守性，由883個(gè)氨基酸編碼構(gòu)成的蛋白質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量約為104 000[7]。研究發(fā)現(xiàn)，其在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，因此也被視為癌基因[8]。ECT2通過作用于Rho GTP酶家族成員，催化鳥苷酸交換，從而起到調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂的作用[9]；同時(shí)，由于Rho GTP酶家族成員對(duì)細(xì)胞的骨架重構(gòu)及黏附性調(diào)節(jié)方面亦發(fā)揮重要作用，因此ECT2還與腫瘤的侵襲性顯著相關(guān)[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌及肺癌細(xì)胞中ECT2可以激活Rac1基因，輔助Rac1在細(xì)胞核中募集，促使細(xì)胞癌變及增殖。敲除ECT2基因則會(huì)抑制肺腺癌細(xì)胞的增生及侵襲性[11,12]。結(jié)合患者的臨床病理數(shù)據(jù)，ECT2高表達(dá)與肺鱗癌患者的總生存時(shí)間及無瘤生存時(shí)間均顯著相關(guān)[11]。在非小細(xì)胞性肺癌中也有發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果[13]。同時(shí)，ECT2也作為各種腫瘤調(diào)節(jié)因子的作用靶位發(fā)揮作用。在非小細(xì)胞肺癌及乳腺癌細(xì)胞系上發(fā)現(xiàn)野生型p53基因可以通過作用于蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制ECT2的表達(dá)。而泛素連接酶之一E6AP，也是通過ECT2依賴的機(jī)制，發(fā)揮調(diào)節(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移的作用[14]?；谏鲜鲆幌盗邪l(fā)現(xiàn)，ECT2已作為腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化、播散過程中的重要參與者，有著重要的應(yīng)用前景。

目前，針對(duì)ECT2在肝癌發(fā)生、發(fā)展領(lǐng)域的研究較少。一項(xiàng)來自新加坡國(guó)立癌癥中心的研究發(fā)現(xiàn)，ECT2在肝癌組織中表達(dá)顯著升高，并且與腫瘤早期復(fù)發(fā)顯著相關(guān)。進(jìn)一步的機(jī)制研究提示，ECT2在細(xì)胞增殖、癌基因轉(zhuǎn)化、腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中均發(fā)揮了重要角色，ETC2/Rho/ERK信號(hào)通路部分介導(dǎo)了ECT2的功能[6]。但在該研究中，并未根據(jù)病因?qū)⒏伟┓謩e進(jìn)行研究。大量研究證實(shí)，肝癌的發(fā)生與肝炎病毒感染所致慢性肝病顯著相關(guān)。然而，非肝炎病毒相關(guān)性肝癌亦占據(jù)一定比例。兩者在發(fā)生、發(fā)展過程中是否具備相同的機(jī)制仍無定論。既往大多數(shù)肝癌的研究并未根據(jù)肝癌的成因進(jìn)行分類，大多數(shù)納入標(biāo)本均為肝炎病毒相關(guān)性肝癌，缺乏對(duì)非肝炎病毒相關(guān)性肝癌相關(guān)機(jī)制的探索?；诖?，本研究在前述研究的基礎(chǔ)上，分析了ECT2在非肝炎病毒相關(guān)性肝癌組織中的表達(dá)并初步分析其臨床意義。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，非肝炎病毒相關(guān)性肝癌組織ECT2蛋白及mRNA表達(dá)高于癌旁組織。上述結(jié)果均提示，在非肝炎病毒相關(guān)性肝癌組織中，ECT2也呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。表明，在這類肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中，ECT2基因及其表達(dá)產(chǎn)物參與其中并發(fā)揮了重要作用。目前的研究表明，腫瘤的生物學(xué)特點(diǎn)，包括分化程度、侵襲性、血管生成、免疫原性等，是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)?；谏鲜龉沧R(shí)，我們選擇性收集了目前公認(rèn)的與腫瘤生物學(xué)特征直接相關(guān)的指標(biāo)，并評(píng)價(jià)其與ECT2表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果提示肝癌患者低腫瘤分化者、腫瘤直徑≥5 cm者、甲胎蛋白水平≥100 ng/mL者、有微血管癌栓者均較中高腫瘤分化者、腫瘤直徑<5 cm者、甲胎蛋白水平<100 ng/mL者、無微血管癌栓者ECT2蛋白表達(dá)陽性例數(shù)多。大量研究表明，甲胎蛋白水平與原發(fā)性肝癌的分化程度及預(yù)后顯著相關(guān)[12]，甲胎蛋白水平越高，預(yù)示著腫瘤分化程度低，無論是手術(shù)還是移植后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移概率顯著增加。經(jīng)過門靜脈系統(tǒng)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移是肝癌的主要轉(zhuǎn)移途徑，因此術(shù)后病理切片提示微血管癌栓的出現(xiàn)被認(rèn)為是術(shù)后復(fù)發(fā)的主要危險(xiǎn)因素之一[15]。同時(shí)微血管癌栓的發(fā)生也反映了腫瘤細(xì)胞黏附性的改變。本研究結(jié)果與既往ECT2調(diào)節(jié)細(xì)胞的骨架重構(gòu)及黏附性的研究發(fā)現(xiàn)一致。通過與上述臨床病理特征的比較，表明ECT2的表達(dá)與非肝炎病毒相關(guān)性肝癌的生物學(xué)特征顯著相關(guān)，直接參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，有著重要的臨床意義。

綜上可見，非肝炎病毒相關(guān)性肝癌組織中ECT2表達(dá)高，ECT2蛋白表達(dá)可能與肝癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移有關(guān)。表明通過抑制ECT2表達(dá)，有可能降低腫瘤的發(fā)生，這為原發(fā)性肝癌患者及其他腫瘤患者的預(yù)后判斷及靶向治療靶點(diǎn)的選擇提供重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及理論基礎(chǔ)，為以后的研究提供重要線索。