長鏈非編碼RNA H19基因多態(tài)性與高尿酸血癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

張曉春，胡巍娜，王琦

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院，沈陽 110032)

尿酸是嘌呤的代謝產(chǎn)物，尿酸產(chǎn)生增多或者尿酸排泄減少可引起血尿酸水平升高。持續(xù)的高尿酸血癥會對人類健康造成嚴(yán)重的危害。有研究表明，高尿酸血癥是心血管疾病、代謝綜合征、糖尿病、高血壓病、慢性腎病等一系列慢性疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]。尿酸的代謝不僅與飲食、生活方式等因素有關(guān)，而且與基因、遺傳等因素密切相關(guān)[2]。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是目前生命科學(xué)研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)。盡管LncRNA通常不直接參與編碼蛋白，但其卻可以在細(xì)胞生命活動(dòng)過程中發(fā)揮重要的調(diào)控功能[3]。H19基因長度約為2 300 bp，缺乏開放閱讀框架，不具有蛋白編碼功能，屬于LncRNA基因家族的重要成員之一[4]。有研究表明，H19廣泛參與各種病理生理過程的調(diào)控，例如H19在胃癌[5,6]、膀胱癌[7]、胰腺癌[8]等多種腫瘤中高表達(dá)，發(fā)揮癌基因功能，在前列腺癌[9]中低表達(dá)，發(fā)揮抑癌基因功能。特別值得注意的是，有研究者證實(shí)，H19基因的突變(rs217727和rs2067051)與冠心病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在密切關(guān)系[10]。然而，H19基因是否與高尿酸血癥發(fā)病有關(guān)目前還沒有被證實(shí)。本研究通過對高尿酸血癥患者和正常對照人群外周血中H19基因的基因型進(jìn)行檢測，探討H19基因多態(tài)性與高尿酸血癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系，為高尿酸血癥的早期診斷提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2011年4月～2012年6月，于中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院體檢中心進(jìn)行健康檢查的社區(qū)居民共187例，入選人群均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：各系統(tǒng)疾病的急性期，嚴(yán)重感染、急性創(chuàng)傷、有惡性腫瘤病史、嚴(yán)重肝腎功能不全、血液系統(tǒng)疾病、免疫性疾病等炎性疾病、有精神系統(tǒng)疾病等其他各臟器疾病史。187例入選人群中高尿酸血癥者35例(高尿酸血癥組)、尿酸正常者152例(尿酸正常組)。高尿酸血癥診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《高尿酸血癥和痛風(fēng)的治療的中國專家共識》[2]，即男性>420 μmoL/L(7 mg/dL)、女性>360 μmoL/L(6 mg/dL)。高尿酸血癥組男31例、女4例，年齡(54.97±6.60)歲，BMI 26.84±2.99，收縮壓(129.31±15.46)mmHg，舒張壓(81.13±10.95)mmHg，心率(76.49±11.15)次/min，TC(5.42±1.14)mmol/L，TG(2.74±1.58)mmol/L，LDL-C(3.14±0.86)mmol/L，HDL-C(1.18±0.30)mmol/L，肌酐(92.55±15.10)mmol/L，空腹血糖(5.65±1.24)mmol/L；尿酸正常組組男113例、女39例，年齡(55.59±5.93)歲，BMI 25.48±3.02，收縮壓(129.96±16.48)mmHg，舒張壓(77.87±10.19)mmHg，心率(77.87±11.56)次/min，TC(5.27±0.97)mmol/L，TG(2.17±1.66)mmol/L，LDL-C(3.20±0.80)mmol/L，HDL-C(1.32±0.31)mmol/L，肌酐(81.28±14.04)mmol/L，空腹血糖(5.80±1.57)mmol/L；兩組性別、HDL-C、肌酐比較P均<0.05，其他指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 LncRNA H19單核苷酸多態(tài)(SNP)位點(diǎn)基因型檢測 抽取所有入選人群空腹左肘前靜脈血3 mL，用EDTA抗凝管收集，用于提取DNA。利用HapMap數(shù)據(jù)庫對基因多態(tài)性進(jìn)行篩選。采用Haploview4.2選擇中國北京漢族人群(CHB)連鎖不平衡r2值大于0.8，且最小等位基因頻率(MAF)大于5%。采用F-SNP軟件(http://compbio.cs.queensu.ca/F-SNP/)對這些入選位點(diǎn)的可能功能進(jìn)行預(yù)測。最后所選的3個(gè)SNP分別為rs2735971A/G(突變位于H19內(nèi)含子區(qū)，MAF=0.133)、rs2839698C/T(突變位于H19內(nèi)含子區(qū)，MAF=0.2929)、rs3024270C/G(突變位于H19內(nèi)含子區(qū)和3′UTR 區(qū)，MAF=0.3654)。應(yīng)用QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒從200 μL外周血中提取基因組DNA。操作嚴(yán)格按照說明書步驟要求，DNA提取在中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。為將包有含待測SNP及其部分上游及下游側(cè)翼序列的DNA片段通過PCR方法擴(kuò)增出來。擴(kuò)增使用的PCR引物序列如下(5′-3′)：rs2735971為CATGTGTATTTC-TGGAGGCTTCCCCTTCAGTCTCACCGCCCGGATGGC-ACRGAATTGGTTGTAGTTGTGGAATCGGAGGTGGC-TGCGCGGCGGCAGTGCAG；rs2839698為CTCGAGG-CAGGGCTGGTGGGGCCTGAGGCCAGTGAGGAGTG-TGGAGTAGGYGCCCAGGCATCGTGCAGACAGGGC-GACATCAGCTGGGGACGATGGGCCTG；rs3024270為GGACGCGGCCCTGCCCAGACCGCCCCGCCGGGC-CACCATCTCACTGCCCCVACCTCTGTCTTCTACAGA-ACACCTTAGGCTGGTGGGGCTGCGGCAAGAAG。將提取的外周血DNA送至上海貝晶生物技術(shù)有限公司通過使用競爭性等位基因特異性PCR技術(shù)(KASP)進(jìn)行了基因型檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)?；蚨鄳B(tài)性位點(diǎn)與高尿酸血癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系分析采用多重回歸模型，計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比(OR)和95%可信區(qū)間(CI)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

H19基因3個(gè)SNP位點(diǎn)均符合哈德-溫伯格平衡。兩組H19基因不同基因型分布見表1。H19基因3個(gè)SNP位點(diǎn)等位基因頻率分布見表2。多重回歸模型結(jié)果顯示，與rs2735971 GG基因型相比，GA基因型高尿酸血癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高(P=0.034，OR=1.959，95%CI：1.051～3.652)；與rs2735971 G等位基因相比，A等位基因高尿酸血癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)低(P=0.001，OR=0.033，95%CI：0.005～0.241)；與rs2839698 TT基因型相比，CC基因型高尿酸血癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高(P=0.012，OR=3.639， 95%CI：1.329～9.959)；與rs2839698 T等位基因相比，C等位基因高尿酸血癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)低(P=0.000，OR=0.268，95%CI：0.161～0.447)。

表1 兩組H19基因不同基因型分布(例)

表2 兩組H19基因3個(gè)SNP位點(diǎn)等位基因頻率分布(%)

3 討論

近年來，高尿酸血癥的患病率呈逐年上升態(tài)勢，在某些沿?；蛘甙l(fā)達(dá)地區(qū)，高尿酸血癥患病率為5%～23.5%[2]。目前認(rèn)為環(huán)境、生活方式遺傳等多種因素可以影響血尿酸水平，其中遺傳相關(guān)的因素在高尿酸血癥發(fā)病中的作用越來越被研究者關(guān)注。以家族為基礎(chǔ)的一系列研究表明，尿酸水平的高低大概25%～75%歸咎于基因[11,12]。在中國男性人群中的研究發(fā)現(xiàn)，P2RX7基因位點(diǎn)rs2230911可以顯著增加罹患高尿酸血癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，其中等位基因G與等位基因C比較增加了罹患高尿酸血癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的1.755倍[13]。一項(xiàng)在歐洲人群中進(jìn)行的GWAS研究檢測SLC2A9基因相關(guān)的3個(gè)SNP位點(diǎn)(rs6832439、rs13131257、rs737267)，發(fā)現(xiàn)SLC2A9基因多態(tài)性與高尿酸血癥的發(fā)病可能相關(guān)[14]。然而，LncRNA基因是否影響高尿酸血癥目前鮮見文獻(xiàn)報(bào)道。

H19基因位于人染色體11p15.5區(qū)域，是典型的母系等位基因表達(dá)、父系印跡的基因[15]，在人類和嚙齒目動(dòng)物進(jìn)化過程中呈現(xiàn)高度保守狀態(tài)。它包含有5個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，具有多個(gè)C/EBP轉(zhuǎn)錄因子家族的結(jié)合位點(diǎn)[16]。H19基因上游有包含有一個(gè)差異甲基化區(qū)(MDR)，也稱印跡控制區(qū)。該控制區(qū)可以通過對其CpG位點(diǎn)甲基化來實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的控制。通常情況下，H19基因上父系的基因拷貝被甲基化而被沉默，而母系的基因拷貝不被甲基化而選擇性表達(dá)。H19基因雖然不能直接編碼蛋白質(zhì)，但其可以作為調(diào)節(jié)性的RNA發(fā)揮作用[17]，也可以參與編碼微小RNA[18]，參與調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生[5～9]、細(xì)胞生殖[19]等病理生理過程。此外，部分研究發(fā)現(xiàn)，H19基因的突變與冠心病[10]及多種惡性腫瘤[20～22]的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。我們的研究探討了H19基因的3個(gè)主要SNP位點(diǎn)(rs2735971、rs2839698、rs3024270)與高尿酸血癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系。

rs2735971是H19基因上游MDR區(qū)核苷酸A/G的變異，該SNP位點(diǎn)在中國漢族和朝鮮族人群中具有較高的檢出率,是比較可靠的遺傳標(biāo)記[23，24]。Li等[20]對該位點(diǎn)與中國漢族結(jié)腸癌患者發(fā)病情況進(jìn)行了分析，但未發(fā)現(xiàn)該SNP位點(diǎn)與結(jié)腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)，rs2735971多態(tài)的GA雜合型增加了患高尿酸血癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，這說明GA雜合型可能是高尿酸血癥的患病風(fēng)險(xiǎn)；A等位基因降低了患高尿酸血癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，這說明A等位基因模型可能是高尿酸血癥的保護(hù)因素。rs2839698是H19基因外顯子區(qū)域核苷酸C/T的變異，rs2839698與多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。Li等[20]發(fā)現(xiàn)，rs2839698顯著增加中國漢族人結(jié)腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，并且與結(jié)腸癌的惡性程度顯著相關(guān)。Yang等[21]發(fā)現(xiàn)，rs2839698多態(tài)增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，并且CT和TT基因型攜帶者外周血中H19的表達(dá)水平較CC基因型呈現(xiàn)顯著的升高。然而，Verhaegh等[22]卻發(fā)現(xiàn)rs2839698多態(tài)CT基因型能降低膀胱癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。本研究發(fā)現(xiàn),rs2839698位點(diǎn)C等位基因顯著降低了罹患高尿酸血癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，提示C等位基因是高尿酸血癥的保護(hù)因素，但是基因型分析卻發(fā)現(xiàn)CC基因型較TT基因型增加了罹患高尿酸血癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，提示CC基因型是高尿酸血癥的風(fēng)險(xiǎn)因子。我們推測rs2839698影響高尿酸血癥的發(fā)病可能是由于該位點(diǎn)突變改變了H19基因的二級結(jié)構(gòu)有關(guān)[25]。rs3024270是內(nèi)含子區(qū)域核苷酸C/G的變異，在本研究中未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)多態(tài)性與高尿酸血癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在相關(guān)性。

本研究仍存在有一定的不足之處：其一，本研究納入研究的樣本量較小，所得結(jié)果有待多中心大樣本的研究來進(jìn)一步證實(shí)；其二，本研究兩組人群存在性別比例的差異，這可能會對研究結(jié)果造成一定程度的影響。

綜上所述，LncRNA H19基因rs2735971、rs2839698位點(diǎn)多態(tài)性可能與高尿酸血癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在相關(guān)性，這兩個(gè)位點(diǎn)可能是高尿酸血癥潛在的分子生物學(xué)標(biāo)志物。