瑞舒伐他汀預(yù)處理對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌細(xì)胞自噬的影響

謝亞芹，李秀芬，趙娟，崔海鵬，李穎，劉凱

(1承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000；2承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

目前，急性心肌梗死等缺血性心臟疾病臨床上主要采用溶栓、介入以及搭橋手術(shù)等手段進(jìn)行治療，治療后患者心肌組織血液恢復(fù)供應(yīng)，心肌損傷減少，預(yù)后得以改善。然而，血流重建之后帶來的心肌缺血再灌注損傷(MIRI)使得治療效果大大降低，并且嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。心肌細(xì)胞的死亡是造成MIRI的重要原因之一[1]。以往認(rèn)為，壞死和凋亡是心肌缺血再灌注損傷所致細(xì)胞死亡的主要方式。但近年來隨著研究的深入，自噬作為新的程序性細(xì)胞死亡方式在MIRI中的作用備受關(guān)注[2]。以往研究[3,4]表明，瑞舒伐他汀可通過抗凋亡、抗氧化應(yīng)激、改善血管內(nèi)皮功能等機(jī)制保護(hù)心肌缺血再灌注帶來的損傷。2017年3～9月，本研究通過建立大鼠MIRI模型，觀察MIRI過程中大鼠缺血心肌細(xì)胞自噬相關(guān)因子LC3-Ⅱ、Beclin-1的變化，并選擇不同劑量瑞舒伐他汀作為保護(hù)劑，分析瑞舒伐他汀是否也可通過調(diào)節(jié)心肌自噬水平發(fā)揮保護(hù)作用，為臨床藥物應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

健康成年雄性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量(220±20)g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。瑞舒伐他汀(10 mg)購于阿斯利康制藥有限公司；蛋白檢測試劑盒購自北京泰格美科技有限公司；LC3-Ⅱ、Beclin-1兔抗多克隆抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 大鼠MIRI模型制備及瑞舒伐他汀用法 將40只大鼠隨機(jī)分為4組，即假手術(shù)組、模型組、瑞舒伐他汀低劑量組、瑞舒伐他汀高劑量組，每組10只。瑞舒伐他汀低劑量組、瑞舒伐他汀高劑量組分別給予瑞舒伐他汀(用生理鹽水溶解)5、20 mg/kg灌胃一次，劑量選擇參考文獻(xiàn)[5]。假手術(shù)組及模型組給予同體積生理鹽水。各組用藥均為模型建立前7天。模型組、瑞舒伐他汀低劑量組、瑞舒伐他汀高劑量組采用結(jié)扎冠狀動脈左前降支的方式制備大鼠MIRI模型。大鼠禁食6 h，2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射進(jìn)行麻醉，通過小動物呼吸機(jī)進(jìn)行機(jī)械通氣，連接心電圖記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。沿胸骨左緣0.5 cm處開胸，剪開心包膜后暴露心臟，在左心耳下2～3 mm處進(jìn)針穿線結(jié)扎冠狀動脈，并將半徑1 mm的聚乙烯管放置于結(jié)扎線與冠狀動脈之間，將聚乙烯管與冠狀動脈同時結(jié)扎，造成冠狀動脈閉塞。以心電圖出現(xiàn)ST段抬高作為缺血成功與否判斷標(biāo)準(zhǔn)。心肌缺血30 min后，將聚乙烯管取出進(jìn)行再灌注，再灌注120 min，再灌注中觀察心臟表面顏色由蒼白色轉(zhuǎn)紅，ST段下降≥1/2為再灌注成功。假手術(shù)組同樣方法開胸，只穿線不結(jié)扎冠狀動脈。

2.2 各組大鼠左心室血流動力學(xué)參數(shù)監(jiān)測 大鼠心肌缺血再灌注后，經(jīng)右側(cè)頸總動脈插管至左心室，經(jīng)壓力換能器連接多媒體生物信號記錄儀進(jìn)行血流動力學(xué)監(jiān)測，記錄大鼠左心室舒張末壓(LVEDP)、左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率(±dp/dtmax)等血流動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠血流動力學(xué)參數(shù)比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與瑞舒伐他汀低劑量組比較，▲P<0.05。

2.3 各組大鼠心肌組織病理學(xué)觀察 各組大鼠血流動力學(xué)檢測完成后，取下心肌組織，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察心肌組織病理學(xué)改變。假手術(shù)組心肌細(xì)胞排列整齊規(guī)則，細(xì)胞核完整，邊界清楚；模型組細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞邊界模糊不清，部分心肌纖維出現(xiàn)斷裂及細(xì)胞核消失現(xiàn)象；瑞舒伐他汀低劑量組、瑞舒伐他汀高劑量組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本完整，細(xì)胞核溶解減少，細(xì)胞損傷程度較模型組減輕。

2.4 各組大鼠心肌組織LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。稱取各組心肌組織，采用BCA蛋白試劑盒測定蛋白濃度。取100 μg蛋白樣品進(jìn)行電泳、分離、轉(zhuǎn)膜。用5%脫脂奶粉封閉，4 ℃過夜，加入兔抗鼠LC3-Ⅱ(1∶200)、Beclin-1(1∶200)、β-actin(1∶1 000)多克隆抗體及相應(yīng)二抗進(jìn)行雜交，洗膜后加入免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑，最后進(jìn)行放射自顯影。采用Quantity One-v 4.6.2軟件進(jìn)行圖像分析，計算各組心肌組織LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相對表達(dá)量。結(jié)果見表2。

3 討論

自噬是細(xì)胞通過溶酶體降解受損變形的蛋白質(zhì)及損傷的細(xì)胞器，從而實現(xiàn)本身代謝平衡及自我更新的過程，這是細(xì)胞用來維持自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和存活的重要機(jī)制[6,7]，并且參與新陳代謝、氧化應(yīng)激及缺血再灌注等多種過程[8,9]。

表2 各組大鼠心肌組織LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與瑞舒伐他汀低劑量組比較，▲P<0.05。

目前研究[10]已發(fā)現(xiàn)，在心血管病、動脈粥樣硬化、細(xì)胞衰老以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中存在自噬現(xiàn)象。心肌細(xì)胞自噬在MIRI過程中的作用一直存在爭議。大多數(shù)研究認(rèn)為，自噬在MIRI不同時期發(fā)揮的作用并不一致，在缺血期，較低水平的自噬可保護(hù)心肌細(xì)胞免于死亡；而在再灌注期，心肌細(xì)胞自噬過度增強(qiáng)加重心肌細(xì)胞的損傷，甚至出現(xiàn)細(xì)胞壞死[11]。細(xì)胞自噬是一個受相關(guān)基因調(diào)控的過程，其中LC3被認(rèn)為是自噬表達(dá)中的標(biāo)志蛋白[12]。LC3通過Atg4的同源體hATGB在胞質(zhì)中加工形成LC3-Ⅰ。LC3-Ⅰ的PE修飾形式LC3-Ⅱ，位于自噬泡膜的內(nèi)膜上。當(dāng)自噬體被降解，哺乳動物發(fā)生自噬時，細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ的含量明顯增加，且其含量與自噬泡的數(shù)量呈正比[13]。此外，Beclin-1作為自噬發(fā)生的始動因子，其通過Ⅲ型PI3K復(fù)合物調(diào)節(jié)自噬體的生成，其水平可直接體現(xiàn)自噬的程度[14]。本研究通過檢測MIRI前后心肌細(xì)胞自噬兩個關(guān)鍵因子LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)模型組LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)增高，證實了心肌細(xì)胞自噬在MIRI中發(fā)揮了重要作用。過度的心肌細(xì)胞自噬可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，使得心功能進(jìn)一步惡化，最終造成心律失常、心力衰竭的發(fā)生。

他汀類藥物作為目前預(yù)防和治療心血管疾病的主要藥物，除了具有調(diào)節(jié)血脂作用外，還具有抗血管炎癥、抗血小板聚集、調(diào)節(jié)免疫等多種作用，而且這些非調(diào)脂作用已成為近年來研究的熱點[15]。瑞舒伐他汀作為新一代他汀類藥物的代表，目前應(yīng)用比較廣泛，因此本研究采用瑞舒伐他汀作為MIRI的保護(hù)劑在臨床上具有一定的適用性和代表性。本研究血流動力學(xué)檢測及心肌病理學(xué)改變結(jié)果表明，應(yīng)用瑞舒伐他汀預(yù)處理可以明顯改善MIRI大鼠的心室功能，增強(qiáng)心肌收縮能力，減輕心肌損傷的程度。瑞舒伐他汀低劑量組、瑞舒伐他汀高劑量組心肌組織LC3-Ⅱ、Beclin-1的蛋白表達(dá)明顯降低，且后組降低程度高于前組，推測瑞舒伐他汀對于MIRI大鼠心肌保護(hù)作用與抑制心肌細(xì)胞自噬有關(guān)，并且與應(yīng)用劑量具有相關(guān)性，大劑量的瑞舒伐他汀能夠更為有效地抑制自噬的發(fā)生，保護(hù)心室功能。

綜上可見，瑞舒伐他汀預(yù)處理可減輕大鼠MIRI引起的心肌組織損傷，這可能與抑制心肌細(xì)胞自噬有關(guān)，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。