流感丸棒嘎藥材中烏頭堿限量檢查方法學(xué)研究

仇朝紅 馬元龍

【摘要】目的 增訂流感丸中烏頭堿限量檢查方法。方法 采用薄層色譜法，高效液相色譜法，Sunfire-ODS C18柱（250 mm，4.6 mm）；柱溫：30℃室溫；流動(dòng)相：以甲醇-0.1%三乙胺（65：35）為流動(dòng)相；檢測波長240 nm。理論板數(shù)按烏頭堿峰計(jì)算均高于2000。結(jié)果 供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無干擾。流感丸中不含烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿，含有異葉烏頭堿、苯甲酰異葉烏頭堿、阿替新等生物堿，這三種生物堿毒性較小，如異葉烏頭堿對(duì)小鼠LD50（靜注）為180～190 mg/kg，為烏頭類生物堿中毒性較低的種類。結(jié)論 通過對(duì)薄色譜鑒別項(xiàng)方法學(xué)驗(yàn)證，所增訂的薄層色譜法方法可行，重現(xiàn)性良好，陰性無干擾；高效液相定性方法可行，重現(xiàn)性良好，分離度好，陰性無干擾，該方法可作為流感丸中烏頭堿的定量控制。

【關(guān)鍵詞】流感丸；烏頭堿；薄層色譜；高效液相色譜

【中圖分類號(hào)】R259 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B 【文章編號(hào)】ISSN.2095-6681.2018.28..02

流感丸用于清熱解毒，用于流行性感冒，流清鼻涕，頭痛咳嗽，周身酸癰，炎癥發(fā)燒等。本實(shí)驗(yàn)建立了流感丸中烏頭堿的薄層色譜鑒別和效液相色譜定性測定方法

1 薄層色譜法

1.1 檢測方法

取本品粉末15 g，置具塞錐形瓶中，加乙醇50 mL，加熱回流2 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)?%鹽酸溶液20 mL溶解，用三氯甲烷20 mL振搖提取，棄去三氯甲烷液，水液用碳酸氫鈉試液調(diào)節(jié)PH值至8～9，用三氯甲烷振搖提取2次，15 mL/次，合并三氯甲烷液，用無水硫酸鈉脫水，蒸干，殘?jiān)眉状既芙馐钩? mL，作為供試品溶液。另取烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1.0 mg的溶液，作為混合對(duì)照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取供試品溶液10 μL、混合對(duì)照品溶液5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-環(huán)己烷-乙酸乙酯-二乙胺（8：4：4：1）為展開劑，置氨蒸汽飽和20 min的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液。

1.2 方法學(xué)考察

供試品溶液制備方法同上。

陰性樣品溶液制備：按處方比例去除草烏、榜嘎藥材，并按上述供試品溶液方法方法制備。

供試品提取方法及色譜條件的考察：方法中對(duì)不同極性提取溶劑進(jìn)行了考察（乙醇、甲醇、異丙醇-乙酸乙酯），對(duì)不同提取方法進(jìn)行了考察（冷浸、超聲、回流），對(duì)不同提取時(shí)間進(jìn)行了考察（1 h、2 h、3 h），考察了不同展開劑：三氯甲烷-環(huán)己烷-乙酸乙酯-二乙胺（8：4：4：1）、正己烷-乙酸乙酯-甲醇（6.4：3.6：1）。

1.3 結(jié)果

最后試驗(yàn)結(jié)果表明，采用加乙醇50 mL，加熱回流2 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)?%鹽酸溶液20 mL溶解，用三氯甲烷20 mL振搖提取，棄去三氯甲烷液，水液用碳酸氫鈉試液調(diào)節(jié)PH值至8～9，用三氯甲烷振搖提取2次，15 ml/次，合并三氯甲烷液，用無水硫酸鈉脫水，蒸干，殘?jiān)眉状既芙馐钩? mL，展開劑用正己烷-乙酸乙酯（9：1），薄層板用硅膠G板，噴以稀碘化鉍鉀試液后在日光下檢視的方法斑點(diǎn)分離良好，特征明顯，陰性溶液無干擾。

1.4 檢驗(yàn)結(jié)果

供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，3批樣品均未顯相同顏色的斑點(diǎn)，斑點(diǎn)分離良好，特征明顯，陰性溶液無干擾，可作為流感丸中烏頭堿限量檢查的方法。

2 高效液相色譜法

流感丸原藥材棒嘎藥材中烏頭堿定性測定研究

2.1 儀器與試藥

2.1.1 儀器

Waters 2695型高效液相色譜儀，Waters 2487 DAD檢測器，Empower Pro化學(xué)工作站；電子天平，德國賽多利斯股份公司）；電子天平；超聲波清洗器。

2.1.2 試藥

烏頭堿對(duì)照品、次烏頭堿對(duì)照品、新烏頭堿對(duì)照品，購自中國藥品生物制品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純，水為超純水。

2.2 方法與結(jié)果

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

參照《中國藥典》[1]2010年版一部川烏、草烏中的烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿的含量測定方法及隨志剛等對(duì)草烏中烏頭類生物堿提取方法比較研究，選擇以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-0.1%三乙胺（65：35）為流動(dòng)相；檢測波長240 nm。理論板數(shù)按烏頭堿峰計(jì)算均高于2000。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取烏頭堿對(duì)照品12.97 mg、次烏頭堿對(duì)照品9.96 mg、新烏頭堿對(duì)照品11.88 mg，分別置100 mL量瓶中，加異丙醇一三氯甲烷（1：1）混合溶液溶解，定容至刻度，即得烏頭堿濃度為0.1281 mg/mL、次烏頭堿濃度為0.0991 mg/mL和新烏頭堿濃度為0.1170 mg/mL的溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

2.2.3.1 提取方法的考察

（1）方法一：取草烏藥材粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加氨試液3 mL，精密加入異丙醇一乙酸乙酯（1：1）混合溶液50 mL，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz；水溫在25℃以下）30 min，放冷，再稱定重量，用異丙醇-乙酸乙酯（1：1）混合溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25 mL，40℃以下減壓回收溶劑至干，殘?jiān)芗尤氘惐?三氯甲烷（1：1）混合溶液3ml溶解，濾過，取續(xù)濾液，即得。

（2）方法二：酸提法，取草烏藥材粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入0.05 mol/L鹽酸溶液50 mL，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz；水溫在25℃以下）30 min，放冷，再稱定重量，用0.05 mol/L鹽酸溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，于12000 r/min離心5 min，上清液濾過，取續(xù)濾液，即得。

（3）方法三：酸超聲提乙醚萃取法，取草烏藥材粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入0.05 mol/L鹽酸溶液50 mL，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz；水溫在25℃以下）30 min，放冷，再稱定重量，用0.05 mol/L鹽酸溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，于12000 r/min離心5 min，取上清液，用10%氨水調(diào)pH值為10，加入15，5，5 mL乙醚萃取三次，合并乙醚層，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，定容?5 mL，即得。

（4）方法四：氨水乙醚冷浸法，取草烏藥材粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入40 mL10%氨水，加乙醚30 mL，振蕩5 min，冷浸6 h，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，3000 r/min離心5 min，取乙醚層，沉淀用乙醚洗滌2次，10 mL/次，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，定容?5 mL，即得。

3 討 論

檢測結(jié)果與所查文獻(xiàn)結(jié)論一致，草烏中不含烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿，含有異葉烏頭堿、苯甲酰異葉烏頭堿、阿替新等生物堿[2]，這三種生物堿毒性較小，如異葉烏頭堿對(duì)小鼠LD50（靜注）為180～190 mg/kg[3]，為烏頭類生物堿中毒性較低的種類。又加這三種生物堿對(duì)照品屬于冷僻品種，我們多方求購，至今沒有買到，故未能對(duì)這三種生物堿進(jìn)行定量研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 劉高宏，魏立莉.流感丸中烏頭堿的限量檢查及HPLC含量測定方法的建立[J].西部中醫(yī)藥，2016，29（11）：24-26.

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[3] 戴衛(wèi)平，李 耿，申小花，等.眾生丸對(duì) H1N1流感小鼠的保護(hù)及免疫調(diào)節(jié)作用研究[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2015，16（4）：395-399.

本文編輯：劉欣悅