響應(yīng)曲面法優(yōu)化特色雙菌雙蛋白發(fā)酵乳的配方

姜 梅， 云 琳， 蔡方圓

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京 210095； 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)淮安研究院，江蘇淮安 223005； 3.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214000)

發(fā)酵乳因其獨(dú)特的風(fēng)味、順滑的口感以及較高的營養(yǎng)價(jià)值而備受消費(fèi)者青睞，它多以牛乳為原料、經(jīng)乳酸菌發(fā)酵而成。但牛乳中的飽和脂肪酸含量相對(duì)較高，對(duì)于有高血脂和超重肥胖傾向者不利。而大豆中蛋白質(zhì)含量豐富，氨基酸組成較全面，且其來源廣泛，價(jià)格低廉，因此在發(fā)酵乳中添加豆乳，不僅可以降低發(fā)酵乳脂肪含量，促進(jìn)人體對(duì)鈣和維生素D的吸收，同時(shí)可以體現(xiàn)大豆蛋白低飽和脂肪、無膽固醇的健康特性[1]，更為重要的是大豆蛋白含有人體所需的8種必需氨基酸[2]，可與牛乳中的氨基酸起到互補(bǔ)作用，提高其營養(yǎng)價(jià)值[3]，同時(shí)實(shí)現(xiàn)動(dòng)物蛋白和植物蛋白資源的開發(fā)利用。

大豆酸乳雖然在國外已形成產(chǎn)業(yè)化，但其顆粒感和豆腥味使其接受度低，并且色澤較深，嚴(yán)重影響產(chǎn)品的銷量[4]，因此改善產(chǎn)品品質(zhì)是開發(fā)大豆酸乳的關(guān)鍵。有研究發(fā)現(xiàn)，麥苗粉含有豐富的營養(yǎng)成分[5-6]，其礦物質(zhì)含量豐富，堿性度高達(dá) 66.4[7]，有益于人體健康；同時(shí)添加麥苗粉可掩蓋豆腥味并賦予發(fā)酵乳明亮的綠色。抹茶是一種天然超細(xì)微綠茶粉末，含有氨基酸、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分，具有較高的營養(yǎng)和食用價(jià)值，且與茶葉相比，抹茶更易于消化吸收[8]，并可賦予發(fā)酵乳清新的綠色。因此，本研究以牛乳和豆乳為雙蛋白發(fā)酵乳的原料，同時(shí)添加麥苗粉和抹茶粉，采用植物乳桿菌B1-6和瑞士乳桿菌MB2-1混合雙菌進(jìn)行發(fā)酵，獲得麥苗粉抹茶粉雙菌雙蛋白發(fā)酵乳，并對(duì)其進(jìn)行配方優(yōu)化[9]。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與試劑

大豆材料為黑農(nóng)48，麥苗粉購自江蘇味丹食品有限公司，抹茶粉購自亳州寶豐生物科技有限公司，衛(wèi)崗全脂巴氏殺菌乳購自南京衛(wèi)崗乳業(yè)有限公司，明膠購自河南鴻鑫食化有限公司，蔗糖購自南京創(chuàng)雅食品有限公司。

植物乳桿菌B1-6(LactobacillusplantarumB1-6，下文用B1-6表示)、瑞士乳桿菌MB2-1(LactobacillushelveticussMB2-1，下文用 MB2-1表示)均由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

MRS(Man-Rogosa-Sharpe’s)培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母膏5 g/L，無水乙酸鈉5 g/L，檸檬酸銨2 g/L，磷酸氫二鉀2.62 g/L，硫酸鎂0.58 g/L，硫酸錳0.198 g/L，吐溫-80 1 mL/L，瓊脂1.5%～2.0%，培養(yǎng)基所用試劑及NaOH、NaCl2、乙醇等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-IFD潔凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)·蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)；DJ300型電子天平(常熟衡器工業(yè)公司)；LRH-150型生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；SPT-P-A系列智能生化培養(yǎng)箱(合肥華徳利科學(xué)器材有限公司)；IS128實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)(上海儀邁儀器科技有限公司)；九陽電磁灶(IH智能烹飪?cè)?，杭州九陽生活電器有限公?；BCD-430W海爾冰箱(青島海爾股份有限公司)；數(shù)顯黏度計(jì)NDJ-8S(上海精天電子儀器有限公司)；色差儀CR-13[科尼卡美能達(dá)光學(xué)儀器(上海)有限公司]。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種的活化 將保存于甘油管中的1 mL B1-6接種于30 mL稀豆乳中，活化24 h，然后按4%(體積比)的接種量再次接種于稀豆乳中活化16 h備用。將保存于甘油管中的1 mL MB2-1接種于30 mL牛乳中，活化24 h，然后按4%(體積比)的接種量再次接種于牛乳中活化16 h備用。

1.3.2 發(fā)酵乳的制備

1.3.2.1 工藝流程與操作要點(diǎn) 發(fā)酵乳制備的工藝流程如圖1所示，操作要點(diǎn)為(1)大豆浸泡：選取飽滿、沒有蟲蛀、無霉變的優(yōu)質(zhì)大豆，用清水沖洗后按照大豆與水的比例為1 ∶3(質(zhì)量比)浸泡過夜。(2)磨漿：將浸泡好的大豆與麥苗粉和抹茶粉一同加入打漿機(jī)中，按照一定的水豆比(質(zhì)量比)加入40 ℃左右的溫水，進(jìn)行榨漿。(3)煮沸：將生豆乳和牛乳混合后進(jìn)行加熱，煮沸5 min。(4)蔗糖添加：雙蛋白混合乳在煮沸滅菌的過程中加入適量蔗糖。(5)明膠添加：明膠先用冷水浸泡20 min，然后放入75 ℃左右的恒溫水浴鍋中加熱溶解，待混合乳冷卻至40 ℃左右加入其中。(6)發(fā)酵：將 108CFU/mL 的B1-6發(fā)酵稀豆乳與108CFU/mL的MB2-1牛乳按1 ∶1(體積比)比例在40 ℃左右接入不同配方的雙蛋白混合乳中，在38 ℃條件下發(fā)酵。(7)后熟：將發(fā)酵好的雙菌雙蛋白發(fā)酵乳放入4 ℃冰箱后熟。

1.3.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.3.1 感官評(píng)定 邀請(qǐng)10位接受過專業(yè)感官分析培訓(xùn)的評(píng)定員對(duì)雙菌雙蛋白發(fā)酵乳的口感、色澤、組織狀態(tài)和風(fēng)味進(jìn)行打分，采用百分制，取平均分作為感官評(píng)定結(jié)果，評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 感官評(píng)定

1.3.3.2 黏度測(cè)定 取適量樣品置于100 mL燒杯中，用3號(hào)轉(zhuǎn)子以3 r/min的轉(zhuǎn)速測(cè)定黏度，記錄數(shù)據(jù)。

1.3.3.3 pH值測(cè)定 用pH計(jì)直接測(cè)定樣品pH值，記錄數(shù)據(jù)。

1.3.3.4 滴定酸度測(cè)定 準(zhǔn)確稱取5 g經(jīng)后熟的發(fā)酵乳，用勻漿器搗碎勻漿后加入40 mL蒸餾水，混合均勻后置于 100 mL 錐形瓶中，加入酚酞指示液，用0.1 mol/L的標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定至微紅色且30 s內(nèi)不褪色即為滴定終點(diǎn)。滴定過程中所用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積乘以20即為滴定酸度。

1.3.3.5 色值測(cè)定 用CR-13色差儀對(duì)樣品色值進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3.6 乳酸菌數(shù)的測(cè)定 乳酸菌數(shù)的測(cè)定參照GB/T 4789.35—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》，取5 g雙菌雙蛋白發(fā)酵乳樣品，用滅菌的勻漿器磨碎勻漿，將勻漿后的發(fā)酵乳倒入滅過菌的錐形瓶中，并用 45 mL 滅菌生理鹽水沖洗勻漿器并將沖洗液一并倒入錐形瓶中，搖勻后取1 mL混合液，用滅菌生理鹽水梯度稀釋，選取合適的稀釋度，采用MRS培養(yǎng)基，傾注平板法菌落計(jì)數(shù)，37 ℃倒置培養(yǎng)36～48 h，檢驗(yàn)乳酸菌的活菌數(shù)。

1.3.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.4.1 麥苗粉添加量的優(yōu)化 選取水豆質(zhì)量比為9 ∶1，乳桿菌B1-6+MB2-1接種量為5%，B1-6 ∶MB2-1=1 ∶1(體積比)，發(fā)酵溫度為38 ℃，豆乳 ∶牛乳=4 ∶6(體積比)，考察麥苗粉添加量(6%、8%、9%、10%、11%、12%、14%)對(duì)雙菌雙蛋白發(fā)酵乳品質(zhì)的影響。

1.3.4.2 抹茶粉添加量的優(yōu)化 選取水豆比為9 ∶1(質(zhì)量比)，乳桿菌B1-6+MB2-1接種量為5%，B1-6 ∶MB2-1=1 ∶1(體積比)，發(fā)酵溫度為38 ℃，豆乳 ∶牛乳=4 ∶6(體積比)，麥苗粉添加量為10%，考察抹茶粉添加量(1%、2%、3%、4%、5%)對(duì)雙菌雙蛋白發(fā)酵乳品質(zhì)的影響。

1.3.4.3 明膠添加量的優(yōu)化 選取水豆比為9 ∶1(質(zhì)量比)，乳桿菌B1-6+MB2-1接種量為5%，B1-6 ∶MB2-1=1 ∶1(體積比)，發(fā)酵溫度為38 ℃，豆乳 ∶牛乳=4 ∶6(體積比)，麥苗粉添加量為10%，抹茶粉添加量為4%，考察明膠添加量(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、1.0%、2.0%)對(duì)雙菌雙蛋白發(fā)酵乳品質(zhì)的影響。

1.3.4.4 蔗糖添加量的優(yōu)化 選取水豆比為9 ∶1(質(zhì)量比)，乳桿菌B1-6+MB2-1接種量為5%，B1-6 ∶MB2-1=1 ∶1(體積比)，發(fā)酵溫度為38 ℃，豆乳 ∶牛乳=4 ∶6(體積比)，麥苗粉添加量為10%，抹茶粉添加量為4%，考察蔗糖添加量(1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%)對(duì)雙菌雙蛋白發(fā)酵乳品質(zhì)的影響。

1.3.4.5 水豆比的優(yōu)化 選取乳桿菌B1-6+MB2-1接種量為5%，B1-6 ∶MB2-1=1 ∶1(體積比)，發(fā)酵溫度為 38 ℃，豆乳 ∶牛乳=4 ∶6(體積比)，B1-6 ∶MB2-1=1 ∶1(體積比)，麥苗粉添加量為10%，抹茶粉添加量為4%，蔗糖添加量7%，考察水豆比[9 ∶1、10 ∶1、11 ∶1、12 ∶1(質(zhì)量比)]對(duì)雙菌雙蛋白發(fā)酵乳品質(zhì)的影響。

1.3.5 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇麥苗粉添加量(A)、抹茶粉添加量(B)、蔗糖添加量(C)、水豆比(D)作為自變量，以感官評(píng)分(Y)為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)。響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平[10]如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

1.3.6 數(shù)據(jù)處理方法 試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)試驗(yàn)所得的平均值，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行顯著性和相關(guān)性分析，采用Origin 8.0軟件作圖，用Design Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 麥苗粉對(duì)特色雙菌雙蛋白發(fā)酵乳品質(zhì)的影響 在雙菌雙蛋白乳固形物為18.1%的基礎(chǔ)上，添加6%～14%的麥苗粉，由圖2可知，在6%～10%區(qū)間內(nèi)，隨著麥苗粉添加量的增加，感官評(píng)分逐漸升高，這可能是由于隨著麥苗粉的增加，麥苗粉的清香味道掩蓋了原有發(fā)酵乳中因大豆發(fā)酵而帶來的豆腥味[11-12]，給人帶來愉悅的口感。但當(dāng)添加量超過10%時(shí)，感官評(píng)分卻開始下降，其原因可能是麥苗粉濃度過高給發(fā)酵乳帶來“青草味”，這與麥苗粉中含有的過氧化物酶(peroxidase，簡(jiǎn)稱POD)有直接關(guān)系[13]，以致感官評(píng)分有所降低。

黏度[14-15]是反映發(fā)酵乳品質(zhì)優(yōu)劣的一個(gè)指標(biāo)，它可以反映發(fā)酵乳的組織狀態(tài)，且感官品質(zhì)也與黏度有較大的相關(guān)性，雙菌雙蛋白經(jīng)乳酸菌發(fā)酵獲得了含有酪蛋白(主要牛奶蛋白)和大豆蛋白的復(fù)合凝膠[16]，因此，優(yōu)良品質(zhì)發(fā)酵乳具有一定的強(qiáng)度，以半固體形式存在，組織狀態(tài)良好，質(zhì)地均勻[17]。從圖2可以看出，發(fā)酵乳的黏度隨著麥苗粉添加量的增加先增大后減小，當(dāng)添加量為12%時(shí)，黏度達(dá)到最大值，隨后有所下降；添加量在9%～12%范圍時(shí)，黏度變化較小。結(jié)合感官評(píng)分，雖然麥苗粉添加量為11%、12%時(shí)，發(fā)酵乳的黏度較大，但此時(shí)麥苗粉的青草味突出。

酸牛乳的發(fā)酵終點(diǎn)為pH值=4.5左右，過低或者過高都會(huì)對(duì)發(fā)酵乳產(chǎn)生不良影響，過低會(huì)使發(fā)酵乳產(chǎn)生不良風(fēng)味，增加酸澀味；過高會(huì)增加凝乳時(shí)間，不利于凝乳。從圖2可以看出，隨著麥苗粉添加量的增加，發(fā)酵乳的pH值先下降再升高又降低，在添加量為11%時(shí)達(dá)到最大值，添加量為9%和10%較合適。

Lab顏色模型是由明度(L)和有關(guān)色彩的a、b3個(gè)要素組成的。a和b的值域均為-128～127，a表示從綠色(-)到紅色(+)的范圍，b是從藍(lán)色(-)到黃色(+)的范圍；E為色差綜合指標(biāo)。由表2可知，發(fā)酵乳的亮度整體隨著麥苗粉添加量的增加而減弱；當(dāng)添加量為9%和10%時(shí)，發(fā)酵乳的綠色最明顯。以感官評(píng)分作為主要判斷依據(jù)，結(jié)合其他各項(xiàng)指標(biāo)綜合評(píng)述，確定麥苗粉的最佳添加量為10%左右。

表2 麥苗粉添加量對(duì)發(fā)酵乳色值的影響

表3至表6同。

2.1.2 抹茶粉對(duì)特色雙菌雙蛋白發(fā)酵乳品質(zhì)的影響 由圖3可以發(fā)現(xiàn)，隨著抹茶粉添加量的增加，感官評(píng)分值先增加后降低，當(dāng)添加量為4%時(shí)達(dá)到最大值。其原因可能是添加量較低時(shí)，不足以清新爽口，隨著添加量的增加，抹茶的清香味漸漸增強(qiáng)，加上發(fā)酵乳的奶香味，給人帶來愉悅的口感，但當(dāng)抹茶粉添加量超過4%時(shí)，感官評(píng)分卻有所下降，其原因可能是抹茶粉含有茶多酚、咖啡堿[18-19]等物質(zhì)，茶多酚具有抑菌作用，當(dāng)添加量較高時(shí)，會(huì)影響乳酸菌的代謝繁殖，導(dǎo)致產(chǎn)品出現(xiàn)無發(fā)酵香等問題，而咖啡堿具有苦味，所以添加量較高時(shí)，會(huì)有苦澀味。

添加抹茶粉后的雙菌雙蛋白發(fā)酵乳黏度的變化趨勢(shì)與添加麥苗粉的趨勢(shì)大致相同，即先增加后下降，當(dāng)添加量為3%～4%時(shí)，黏度較大，添加量為5%時(shí)黏度下降。其原因可能是抹茶粉顆粒較大，當(dāng)添加量較高時(shí)，會(huì)改變發(fā)酵乳的凝膠結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)硬度減小、組織狀態(tài)不均勻的現(xiàn)象。

發(fā)酵乳的pH值整體隨著抹茶粉添加量的增加而升高，當(dāng)添加量為2%時(shí)，pH值達(dá)到最大值，不利于凝乳，添加量為3%～5%時(shí)，pH值無明顯變化。

由表3可知，發(fā)酵乳的亮度整體隨著抹茶粉添加量的增加而減弱，在添加量為4%時(shí)，a值最大，表明色澤最綠，符合感官評(píng)定要求，因此，抹茶粉添加量在4%左右最佳。

2.1.3 明膠對(duì)特色雙菌雙蛋白發(fā)酵乳品質(zhì)的影響 明膠是一種來源于動(dòng)物的膠體，作為食品增稠劑時(shí)一般添加于肉制品、蛋糕、冰淇淋、啤酒、果汁等中。明膠在加熱時(shí)熔化，冷卻時(shí)凝固。明膠價(jià)格低且溶解性好，雖然具有類似脂肪的口感，但其卻是幾乎不含有脂肪、糖類、無機(jī)質(zhì)的純蛋白食品，對(duì)增強(qiáng)酸奶產(chǎn)品的香濃口感具有明顯作用[20-21]。從圖4可以看出，明膠添加量為0.3%時(shí)，感官評(píng)分最高，結(jié)合黏度來看，此時(shí)發(fā)酵乳的黏度適中，可以有效地減慢麥苗粉和抹茶粉顆粒的下沉；添加量在0.3%～0.5% 范圍內(nèi)時(shí)，黏度無明顯變化；而當(dāng)添加量低于0.3%時(shí)，出現(xiàn)乳清析出的現(xiàn)象；當(dāng)添加量高于0.5%時(shí)，發(fā)酵乳黏度雖有所增加，但出現(xiàn)明膠特有的骨膠原味道，口感不佳，進(jìn)而降低口感評(píng)分。當(dāng)明膠添加量為0.3%時(shí)，pH值最低，可以有效縮短凝乳時(shí)間；同時(shí)，為了減少生產(chǎn)成本，明膠添加量適宜控制在0.3%左右。

表3 抹茶粉添加量對(duì)發(fā)酵乳色值的影響

由表4可以看出，明膠添加量在0.3%時(shí)a值較高，綠色較明顯，符合感官評(píng)定要求。

表4 明膠添加量對(duì)發(fā)酵乳色值的影響

2.1.4 蔗糖對(duì)特色雙菌雙蛋白發(fā)酵乳品質(zhì)的影響 蔗糖添加量的多少會(huì)直接影響發(fā)酵乳的適口性。加糖是為了使發(fā)酵乳具有酸中有甜、甜中帶酸的口感。加糖量過少，發(fā)酵乳酸味過重，固形物含量少，組織結(jié)構(gòu)粗糙，發(fā)酵效果差：加糖量過多，發(fā)酵乳口味過甜，掩蓋了發(fā)酵乳獨(dú)特的乳香味，影響酸甜比[22]。由圖5可知，pH值整體隨著蔗糖添加量的增加先升高后下降，當(dāng)加糖量<6%時(shí)，發(fā)酵乳風(fēng)味較差，凝乳時(shí)間較長(zhǎng)，當(dāng)加糖量為6%～8%時(shí)，發(fā)酵乳凝固較好，風(fēng)味純正，酸甜可口，綠色均勻有光澤。由表5可知，發(fā)酵乳的亮度整體隨著添加量的增加而降低，當(dāng)蔗糖添加量為7%時(shí)，a值顯著高于其他添加量處理，色澤感官最佳。綜合而言，蔗糖的添加量應(yīng)控制在7%左右。

2.1.5 水豆比對(duì)特色雙菌雙蛋白發(fā)酵乳品質(zhì)的影響 水豆比的大小可直接影響雙蛋白乳的可溶性固形物含量及最終產(chǎn)品的組織狀態(tài)，可溶性固形物含量是影響乳酸菌產(chǎn)酸和雙蛋白發(fā)酵乳凝膠的重要因素[23]。從圖6可以看出，當(dāng)水豆質(zhì)量比為11 ∶1時(shí)，感官評(píng)分最高；當(dāng)水豆質(zhì)量比低于11 ∶1時(shí)，乳酸菌可利用的營養(yǎng)物質(zhì)豐富，同時(shí)B1-6產(chǎn)酸較多，導(dǎo)致發(fā)酵乳的酸度較高，口感偏酸，水豆質(zhì)量比9 ∶1的產(chǎn)品pH值為4.19，且黏度較高，煮漿時(shí)容易結(jié)焦給生產(chǎn)帶來不便，形成的凝膠組織強(qiáng)度大，粗糙不細(xì)膩，豆腥味較重；當(dāng)水豆比較高時(shí)，雙蛋白發(fā)酵乳中固形物含量降低[24]，B1-6生長(zhǎng)受到抑制，產(chǎn)酸能力下降，酸度較低，沒有發(fā)酵乳特有的香氣，并且會(huì)使發(fā)酵乳綠色減弱。由表6可知，隨著水豆比的增加，a值逐漸減小，綠色減弱，綜合感官評(píng)分，水豆質(zhì)量比控制在 11 ∶1 左右較合適。

綜上，以感官為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，綜合黏度、pH值、色值等指標(biāo)考察各因素對(duì)特色雙菌雙蛋白發(fā)酵乳品質(zhì)的影響，麥苗粉的適宜添加量為9%～11%，抹茶粉適宜添加量為3.5%～4.5%，明膠的適宜添加量為0.3%～0.5%，蔗糖添加量為6%～8%，水豆比應(yīng)選取10 ∶1～12 ∶1。

2.2 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)

響應(yīng)面優(yōu)化法是一種尋找最優(yōu)試驗(yàn)條件的方法，通過對(duì)過程的回歸擬合和響應(yīng)曲面、等高線的繪制可方便地求出相應(yīng)于各因素水平的響應(yīng)值。在單因素的基礎(chǔ)上，初步確定雙菌雙蛋白發(fā)酵乳中各種成分的適宜添加量范圍，并以此為基礎(chǔ)，利用Box-Behnken Design(BBD)[25]設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案。將表7結(jié)果錄入軟件，應(yīng)用BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別以麥苗粉添加量(A)、抹茶粉添加量(B)、蔗糖添加量(C)以及水豆比(D)為自變量，以感官分值(Y)為因變量，初步得到以下模型：Y=91.80+3.00A+1.83B+0.25C+1.42D+0.75AB+0.50AC+2.25AD-0.25BC-3.50BD-9.77A2-5.77B2-2.40C2-3.40D2。

表5 蔗糖添加量對(duì)發(fā)酵乳色值的影響

表6 水豆比對(duì)發(fā)酵乳色值的影響

由表8可以看出，F(xiàn)(模型)=18.99，P<0.000 1，表明模型方程間的差異極顯著，說明該模型與實(shí)際情況擬合良好。失擬項(xiàng)F=2.620.05，不顯著，說明試驗(yàn)數(shù)據(jù)與所采用的模型相吻合。此外，4個(gè)因素的平方項(xiàng)對(duì)雙菌雙蛋白酸乳的感官評(píng)分有極顯著影響(P<0.01)；除A、B、D、AD、BD外，一次項(xiàng)及其他交互項(xiàng)對(duì)感官評(píng)分無顯著影響，因此可在α=0.05顯著水平對(duì)模型進(jìn)行進(jìn)一步的分析，剔除其中的不顯著項(xiàng)，得到簡(jiǎn)化后的回歸模型，即

Y=91.80+3.00A+1.83B+1.42D+2.25AD-3.50BD-9.77A2-5.77B2-2.40C2-3.40D2。

4個(gè)單因素對(duì)特色雙菌雙蛋白酸乳感官評(píng)分的影響程度為A>B>D>C，即麥苗粉添加量對(duì)感官評(píng)分影響最大，其次是抹茶粉添加量， 然后是水豆比，最后是蔗糖添加量。固定2個(gè)因素零水平，研究另外2個(gè)因素間的交互作用，利用Design-Expert制作相應(yīng)曲面圖(圖7)。等高線的形狀可反映出交互作用的強(qiáng)弱，橢圓形表示2因素交互作用顯著，而圓形則不顯著。

表7 Box-Behnken Design試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由圖7可知，隨著各交互因子編碼值的升高，雙菌雙蛋白酸乳感官分值呈上升趨勢(shì)，但當(dāng)編碼值達(dá)到一定的組合后，感官分值呈下降趨勢(shì)。由圖7-a可知，保持蔗糖添加量、水豆比以及抹茶粉添加量不變，感官評(píng)分隨麥苗粉添加量的增加先升高后降低，主要是由于隨著麥苗粉含量的增加，雙菌雙蛋白發(fā)酵乳口感變得清新爽口，但當(dāng)添加量過高時(shí)，麥苗粉青草味過重，影響口感。同樣，當(dāng)蔗糖添加量、水豆比以及麥苗粉添加量不變時(shí)，感官評(píng)分也會(huì)隨著抹茶粉添加量的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。從圖7-b可以看出，確定抹茶粉添加量、麥苗粉添加量以及蔗糖添加量不變時(shí)，感官評(píng)分會(huì)隨著水豆比的升高先增加后減少，其原因可能是水豆比較低時(shí)，固形物含量過高，乳酸菌產(chǎn)酸較多，風(fēng)味較酸，而水豆比過高時(shí)，固形物含量降低，乳酸菌產(chǎn)酸減少，影響感官。從圖7-d可以看出，當(dāng)麥苗粉添加量、抹茶粉添加量以及水豆比不變時(shí)，感官評(píng)分會(huì)隨著蔗糖添加量的增加先升高后降低， 這是因?yàn)橐欢康恼崽菚?huì)促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)會(huì)掩蓋豆腥味，但蔗糖含量過高，會(huì)使雙菌雙蛋白發(fā)酵乳過甜，發(fā)酵過度產(chǎn)酸，影響感官風(fēng)味。

表8 方差分析結(jié)果

注：“*”“**”分別表示在0.05、0.01水平上顯著。

由圖7可以看出，抹茶粉添加量和水豆比的交互作用最顯著，麥苗粉和蔗糖的交互作用次之，再次為麥苗粉和水豆比的交互作用，麥苗粉和抹茶粉的交互作用最弱。這與表8中方差分析的結(jié)果基本一致；結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果可以看出，4個(gè)單因素對(duì)雙菌雙蛋白酸乳感官評(píng)分的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，這也符合實(shí)際情況。因此，只有當(dāng)2個(gè)因素均在0～0.5水平時(shí)，感官分值達(dá)到最高，說明此時(shí)產(chǎn)品的感官品質(zhì)最佳。因此，在以巴氏殺菌乳、麥苗粉和抹茶粉為原料，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)雙菌雙蛋白酸乳時(shí)，以上4個(gè)因素在影響雙菌雙蛋白酸奶品質(zhì)上的優(yōu)先次序?yàn)辂溍绶厶砑恿?抹茶粉添加量>水豆比>蔗糖添加量。

2.3 特色雙菌雙蛋白發(fā)酵乳最佳工藝條件的響應(yīng)曲面優(yōu)化及驗(yàn)證模型

用Design Expert設(shè)置響應(yīng)值的變化范圍及預(yù)期目標(biāo)值，軟件運(yùn)行預(yù)測(cè)，以感官評(píng)分為指標(biāo)，給出最優(yōu)組合，特色雙菌雙蛋白發(fā)酵乳的最佳生產(chǎn)工藝參數(shù)為麥苗粉添加量10.75%、抹茶粉添加量4.04%、蔗糖添加量7.13%、水豆比11.41 ∶1預(yù)測(cè)感官評(píng)分為89.4分，為便于實(shí)際生產(chǎn)，將參數(shù)修正為麥苗粉添加量10.8%，抹茶粉添加量4%，蔗糖添加量7%，水豆比11.4 ∶1：在該條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證，所得感官評(píng)價(jià)的平均分為91分，與預(yù)測(cè)結(jié)果無明顯區(qū)別，證明結(jié)果合理可靠，說明試驗(yàn)的優(yōu)化條件可行。

2.4 特色雙菌雙蛋白發(fā)酵乳的營養(yǎng)特性和理化指標(biāo)

該產(chǎn)品評(píng)價(jià)指標(biāo)除感官外，還有理化指標(biāo)、微生物指標(biāo)、工藝過程可在線控制pH值、滴定酸度和黏度等參數(shù)。對(duì)試驗(yàn)所得的最佳組合進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，所制得的雙菌雙蛋白發(fā)酵乳口感細(xì)膩、色澤均一、組織狀態(tài)均勻、麥苗香氣清新、風(fēng)味獨(dú)特(圖8)。其感官評(píng)分為91分，黏度值為11 602 mPa/s，色值為33.2，pH值為4.12，乳酸菌數(shù)≥108CFU/mL，蛋白質(zhì)含量≥3.1 g/100 g，脂肪含量≥2.9 g/100 g，非脂乳固體≥8.9 g/100 g，酸度為85.9 °T。

3 結(jié)論

本研究以感官為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，綜合考察黏度、pH值、色值等指標(biāo)對(duì)品質(zhì)的影響。麥苗粉的適宜添加量為9%～11%，抹茶粉適宜添加量為3.5%～4.5%，蔗糖適宜添加量為6%～8%，明膠適宜添加量為0.3%～0.5%，水豆比選取10 ∶1～12 ∶1。用響應(yīng)曲面法進(jìn)行發(fā)酵乳工藝優(yōu)化，在發(fā)酵溫度為38 ℃，發(fā)酵時(shí)間為4.5 h，植物乳桿菌B1-6、瑞士乳桿菌MB2-1混合發(fā)酵劑接種量為5%的條件下，獲得的特色雙菌雙蛋白發(fā)酵乳最佳配方為麥苗粉添加量10.8%、抹茶粉添加量4.0%、蔗糖添加量7.0%、水豆比11.4 ∶1，感官評(píng)分為91分。

雙蛋白發(fā)酵乳無論從蛋白質(zhì)含量還是質(zhì)量上來講，都遠(yuǎn)高于牛奶或者豆奶，是具有高蛋白的優(yōu)質(zhì)飲品，而且我國盛產(chǎn)大豆，根據(jù)我國的國情，“雙蛋白”開發(fā)戰(zhàn)略將是大豆產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的一個(gè)方向[26]。本研究所開發(fā)的產(chǎn)品不僅是受大眾青睞的、營養(yǎng)豐富的功能性保健發(fā)酵乳，更重要的是為麥苗粉、抹茶粉的開發(fā)利用提供了新的途徑。