觀賞向日葵腋芽組織培養(yǎng)及植株再生體系的研究

戚永奎, 陳 濤,朱 明, 陳建平, 沈羊城, 陳永紅, 葛兆建*

(1.江蘇沿海地區(qū)農業(yè)科學研究所，江蘇 鹽城 224002；2.鹽城師范學院，江蘇 鹽城 224002；3.農業(yè)部 沿海鹽堿地農業(yè)科學觀測實驗站，江蘇 鹽城 224002；4.鹽城市呈祥園藝有限公司，江蘇 鹽城 224014；5.鹽城昕宇農業(yè)發(fā)展有限公司，江蘇 鹽城 224024)

向日葵按習慣分為野生向日葵、栽培向日葵和觀賞向日葵[1]。近年來，隨著鄉(xiāng)村旅游的迅猛發(fā)展，觀賞向日葵越來越受到人們的青睞。而由于向日葵是異花授粉作物，在開放授粉的情況下天然異交率較高，自交結實率較低[2]，不利于種子的繁育和推廣。外植體的離體培養(yǎng)作為一種高效的生物技術手段可以大量生產優(yōu)良無性系，在向日葵新品種繁育和改良中具有巨大的應用潛力[3]，受到育種家們的重視。傳統(tǒng)向日葵的再生途徑主要通過器官[4-8]和胚胎發(fā)生而產生[9-11]，外植體的類型主要有下胚軸、子葉、子葉節(jié)和莖尖等[4]，但向日葵從轉化的細胞或者組織分化再生植株困難[12]，轉化頻率不高，并且重復性差，是公認的難轉化作物。關于利用腋芽作為外植體進行組織培養(yǎng)，前人在蝴蝶蘭[13]、鉆天柳[14]等作物上均取得了較好的效果，但在向日葵上鮮見報道。本試驗主要嘗試以腋芽作為外植體，研究其在觀賞向日葵上的組培效果及配套技術，以期豐富向日葵組織培養(yǎng)外植體類型，提高再生頻率，解決部分觀賞向日葵品種繁殖系數低的問題。

1 材料與方法

1.1 供試品種

供試品種為YAN1339、YAN1328、YAN1569、YAN1527。其中YAN1339為黃色多頭普通觀賞向日葵，YAN1328為紫色多頭普通觀賞向日葵，YAN1569為白色多頭普通觀賞向日葵，YAN1527為黃色菊花型(重瓣)多頭觀賞向日葵。所有材料均為江蘇沿海地區(qū)農業(yè)科學研究所觀賞葵花課題組的自育新品系。

1.2 外植體的選擇和處理

選取頂花即將開放或者已經開放的向日葵植株，采回后首先將整個植株分成幾段，用洗潔凈清洗干凈，然后用清水沖洗0.5 h，將所有腋芽切下后，先用75%乙醇浸泡30～60 s，再用10%過氧化氫或者3%次氯酸鈉溶液消毒15～20 min，然后在超凈工作臺上，切取腋芽5 mm大小的頂部作為外植體，接種到培養(yǎng)基上。

1.3 培養(yǎng)條件

組織培養(yǎng)室溫度25～28 ℃，日光燈每天光照時間12 h，光照強度1600 lx，固體培養(yǎng)基含7.5 g/L瓊脂，滅菌前調節(jié)pH值至5.8～6.0。將向日葵外植體接種于50 mL三角瓶中。外植體在培養(yǎng)25～30 d后直接分化出不定芽，繼續(xù)培養(yǎng)10～15 d后繼代培養(yǎng)1次。

1.4 數據的統(tǒng)計分析

試驗重復3次，每個處理接種外植體15～20個，愈傷率2周后統(tǒng)計，不定芽誘導率6周后統(tǒng)計。利用SAS 9.2軟件進行數據統(tǒng)計分析，用Duncan法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同腋芽日齡對觀賞向日葵不定芽形成的影響

試驗以黃色菊花型觀賞向日葵YAN1527為材料，以MS+0.03 mg/L NAA+0.9 mg/L 6-BA為培養(yǎng)基，在腋芽開始分化時選取單株，標記腋芽的日齡，分別選取觀賞向日葵頂花開放1～3 d、4～6 d、7～10 d、11～13 d、14 d以上等5種不同日齡的腋芽進行處理。結果表明：腋芽日齡越低，其組培效果越好，更容易分化出不定芽，1～3 d的腋芽不定芽誘導率最高達80.25%，而4～6 d、7～10 d、11～13 d的腋芽誘導率較之1～3 d的腋芽分別降低3.58、26.75、31.82個百分點，14 d以上的腋芽已經基本失去培養(yǎng)價值，誘導率僅為27.25%(圖1)。由此可見，選取適齡的腋芽組培是觀賞向日葵組培成功的關鍵，觀賞向日葵最佳的外植體是1～6 d的腋芽，但是由于1～3 d的腋芽采集比較困難，實際操作時以選取4～6 d的腋芽為宜。

圖1 不同腋芽日齡對觀賞向日葵不定芽形成的影響

2.2 不同6-BA濃度對不同基因型觀賞向日葵腋芽誘導不定芽的影響

在加入等量0.03 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基中添加不同濃度的6-BA，濃度處理包括0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mg/L共6個濃度梯度，以4種供試基因型4～6 d的腋芽作為外植體材料，研究不定芽的誘導效果。結果表明：不同基因型觀賞向日葵在不同濃度的6-BA培養(yǎng)基上培養(yǎng)不定芽的誘導率均呈拋物線分布，隨著6-BA濃度的增加不定芽的誘導率呈先增加后下降的趨勢。但是不同基因型誘導不定芽的最佳6-BA濃度略有不同，YAN1569白色多頭普通觀賞向日葵誘導不定芽的最佳6-BA濃度為0.6 mg/L，YAN1339黃色多頭普通觀賞向日葵和YAN1328紫色多頭普通觀賞向日葵的最佳6-BA濃度為0.6～0.9 mg/L，YAN1527黃色菊花型多頭觀賞向日葵誘導不定芽的最佳6-BA濃度為0.9～1.2 mg/L，普通花型多頭觀賞向日葵誘導不定芽需要的6-BA的濃度低于菊花型(重瓣型)觀賞向日葵的，白色普通觀賞向日葵不定芽的誘導率低于黃色和紫色向日葵的。不同基因型的最佳誘導率在76.5%～83.5%之間，均在80.0%左右，說明不同基因型觀賞向日葵用腋芽誘導不定芽的潛力基本相同。

2.3 不同基因型觀賞向日葵外植體誘導對形成愈傷組織的影響

將4種不同基因型觀賞向日葵腋芽作為外植體，接種在含有上述不同濃度的所有培養(yǎng)基上，上述所有處理基本不形成愈傷組織或者愈傷組織很小，但是隨著時間的推移，外植體在明顯長大。在20～25 d后，所有處理的部分外植體上開始萌發(fā)不定芽，適中6-BA濃度處理的外植體上萌發(fā)得比較早且比例高，6-BA濃度太低和太高處理的不定芽萌發(fā)慢，同時在高濃度6-BA處理上萌發(fā)的不定芽長勢較弱，甚至有停止生長的現象(圖2)。而用向日葵花蕾作為外植體在組培15 d后開始形成愈傷組織，一直維持60 d左右，此后愈傷組織開始褐化而始終未能誘導出不定芽(圖2)。這種在向日葵組織培養(yǎng)上由外植體在培養(yǎng)基上生長膨大，不經過愈傷階段直接萌發(fā)成不定芽的現象未曾見到類似報道。

表1 不同6-BA濃度對不同基因型觀賞向日葵腋芽誘導不定芽的影響 %

注：同列數據后的小寫字母表示在0.05水平上的差異顯著性，字母相同則差異不顯著，不同則顯著。下同。

A～D：腋芽誘導不定芽和不定根再生過程；E～F：花蕾形成愈傷組織及出現褐化現象。

3 討論

3.1 不同腋芽日齡對觀賞向日葵不定芽形成的影響

以腋芽作為外植體誘導不定芽在一些植物上有過報道，如張元國等[13]以蝴蝶蘭花梗腋芽作為外植體，誘導率高達90%以上；王向軍等[14]利用鉆天柳腋芽進行組培，繁殖系數達到10～30倍；胡峰等[15]以厚莢相思含有腋芽的莖段進行組織培養(yǎng)，不定芽的誘導率最高可以達到80.56%。前人研究表明，不同日齡的組培材料是影響外植體再生能力的重要因素[16-17]。本試驗以黃色菊花型(重瓣型)觀賞向日葵YAN1527的不同日齡腋芽作為外植體，結果表明：低日齡腋芽誘導不定芽分化率高，其中1～3 d的腋芽不定芽誘導率最高可以達到80.25%，4～6 d的腋芽不定芽誘導率也達到76.67%，而7 d以上的腋芽分化率明顯降低，14 d以上的腋芽基本失去組培價值。在實際生產中，由于1～3 d的腋芽獲取相對困難，可采取4～6 d的腋芽進行觀賞向日葵組培。受胡峰等[15]研究的啟示，由于觀賞向日葵低日齡的腋芽作為外植體的不定芽誘導率高，是否可以嘗試使用含有腋芽的韌皮部作為外植體，從而提高不定芽的誘導率，有待進一步研究。

3.2 不同6-BA濃度和基因型對觀賞向日葵不定芽再生的影響

關于向日葵植株再生能力與基因型之間的關系，前人研究結果存在差異。劉寶等[18]認為離體培養(yǎng)的再生能力與基因型間存在顯著的相關性，而Pugliesi等[5]認為基因型和再生能力之間沒有關系，再生能力依賴于生長調節(jié)劑之間數量上的互作。本試驗以YAN1339、YAN1328、YAN1569、YAN1527等4種不同基因型的自交系為材料，以腋芽作為外植體，在加有相同量的0.03 mg/L NAA和不同濃度6-BA的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，發(fā)現不同基因型最佳不定芽誘導率沒有顯著差異。這可能與本試驗的4個材料都是由同一母本經過開放授粉后選育而成有關。但是，幾種基因型誘導不定芽再生的6-BA最佳濃度不同，普通花型的觀賞向日葵用腋芽作為外植體的6-BA最佳濃度為0.6～0.9 mg/L，而菊花型(重瓣型)觀賞向日葵用腋芽作為外植體的最佳6-BA濃度為0.9～1.2 mg/L。

3.3 不同外植體對形成愈傷組織的影響

劉海學等[4]以子葉、子葉節(jié)、下胚軸、真葉等作為外植體在MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IAA+0.5 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基上培養(yǎng)發(fā)現外植體平均愈傷率達到90%以上。本試驗也曾用花蕾和下胚軸作為外植體，發(fā)現用花蕾和下胚軸作為外植體愈傷率達到100%，用花蕾作為外植體形成的愈傷組織呈黃綠色，愈傷塊較大，但是經過60 d的培養(yǎng)，仍然不能誘導出不定芽，具體原因有待進一步研究。而本試驗發(fā)現用腋芽作為外植體進行組織培養(yǎng)，基本不形成愈傷組織，或者愈傷塊很小，但是在培養(yǎng)過程中，腋芽有明顯生長增大的現象，且不定芽誘導率高。本研究表明，對于觀賞向日葵利用腋芽進行組織培養(yǎng)，是否形成愈傷組織不是能否誘導不定芽的必要條件，而腋芽由于自身具有生長點等特定的組織結構，相對于其他外植體更容易誘導出不定芽，適合用作觀賞向日葵的外植體。

4 結論

本試驗以觀賞向日葵作為研究載體，探討了以腋芽作為外植體不同日齡以及不同基因型和不同6-BA濃度對不定芽誘導的影響。結果表明，低日齡的腋芽更容易誘導出不定芽，可以在不經過愈傷組織的情況下直接產生不定芽，是否形成愈傷組織不是觀賞向日葵誘導出不定芽的必要條件。不同基因型間再生能力沒有顯著差異，但不同基因型不定芽最佳誘導率的6-BA濃度存在一定差異。在實際生產中，應選擇低日齡腋芽作為外植體，根據不同基因型觀賞向日葵選擇適宜濃度的培養(yǎng)基，從而提高再生頻率。