應(yīng)用酸化力法評(píng)估醬油中酵母的活力

童星, 彭勃

(1.佛山市海天(高明)調(diào)味食品有限公司，廣東 佛山 528511；2.佛山市海天調(diào)味食品股份有限公司，廣東 佛山 528000；3.廣東海天創(chuàng)新技術(shù)有限公司，廣東 佛山 518064)

酵母菌在醬油發(fā)酵過程中具有重要的意義，是醬油釀造后期風(fēng)味物質(zhì)的來源[1]，其中魯氏酵母具有較高的耐鹽性，是目前醬油產(chǎn)業(yè)中最常見的產(chǎn)香菌株[2,3]。隨著高鹽稀態(tài)醬油工藝的推行，常常將魯氏酵母等耐鹽產(chǎn)香酵母以人工培養(yǎng)液的形式添加到醬醪中，從而改善醬油釀造中風(fēng)味的單一性，提高醬油的風(fēng)味質(zhì)量[4]。因此，酵母添加液中菌株的活力就成為了醬油風(fēng)味品質(zhì)和生產(chǎn)穩(wěn)定性的重要支撐之一。

目前在醬油的發(fā)酵研究中，人們通常以鏡檢總酵母數(shù)作為評(píng)價(jià)酵母培養(yǎng)液質(zhì)量的常規(guī)指標(biāo)，然而日常檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)當(dāng)酵母培養(yǎng)液在穩(wěn)定期時(shí)該指標(biāo)波動(dòng)較少，無法準(zhǔn)確預(yù)判酵母添加到醬醪后的酒精發(fā)酵能力。而亞甲基藍(lán)染色法、鎂離子釋放法以及平板涂布計(jì)數(shù)等檢測(cè)方法的操作相對(duì)復(fù)雜，檢測(cè)周期較長(zhǎng)，不利于在生產(chǎn)應(yīng)用中廣泛推廣[5]。酸化力法是檢測(cè)酵母活力的一種簡(jiǎn)單有效的方法，其原理為酵母細(xì)胞在培養(yǎng)液中葡萄糖含量提高時(shí)，能夠通過葡萄糖降解促進(jìn)質(zhì)子泵出細(xì)胞外以維持調(diào)整胞內(nèi)的pH穩(wěn)定[6]，從而會(huì)引起發(fā)酵液中pH值的變化，這種變化與酵母的活性及其發(fā)酵性能密切相關(guān)[7,8]，是評(píng)價(jià)酵母活性的有效方法之一[9]。

酸化力法最先被應(yīng)用于啤酒酵母的活力評(píng)價(jià)[10]，繼而有其適用于工業(yè)酒精酵母的報(bào)道[11]，本文通過從天然醬醪中篩選出魯氏酵母作為實(shí)驗(yàn)菌株，研究酸化力法對(duì)該菌株活力的檢測(cè)效果，并對(duì)其影響因素進(jìn)行穩(wěn)定性探究，最終表明酸化力法能夠高效、可靠地檢測(cè)出醬油中魯氏酵母的發(fā)酵活力，在醬油發(fā)酵產(chǎn)業(yè)中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

魯氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii)：從天然發(fā)酵醬醪中分離獲得。

酵母培養(yǎng)基：無水葡萄糖5%，酵母提取物1%，磷酸氫二鉀0.5%，醬醪汁10%，氯化鈉10%，pH 5.5，1×105Pa滅菌20 min。

無水葡萄糖、氯化鈉、磷酸氫二鉀(均為分析純)：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母提取物(生化試劑)：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；亞甲基藍(lán)(分析純)：上海埃彼化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SHP-250型生化培養(yǎng)箱、WBK-6B型電熱恒溫水浴鍋 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；BX53型光學(xué)顯微鏡 日本Olympus公司；紫外分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司；2k15型冷凍高速離心機(jī) Sigma公司；PB-10型pH計(jì)、BS323S型電子天平 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酵母泥的制備

實(shí)驗(yàn)室酵母擴(kuò)培，4000 r/min離心后取沉淀菌體，再用蒸餾水洗滌2次后得酵母泥。

1.3.2 酵母酸化力的檢測(cè)[12]

稱取洗滌離心后的酵母若干放到玻璃燒杯內(nèi)，加入50 mL蒸餾水，攪拌，使酵母懸浮，10 min后檢測(cè)pH值(pH10)；加入5 mL葡萄糖，再放置攪拌10 min后檢測(cè)pH值(pH20)，測(cè)定在20 ℃下進(jìn)行。GIPE值通過下式計(jì)算：GIPE= pH20-pH10。

1.3.3 菌體濃度的測(cè)定

將菌懸液適當(dāng)稀釋，用可見分光光度計(jì)于600 nm下測(cè)定吸收值(OD600)。用相同稀釋倍數(shù)的空白培養(yǎng)基作對(duì)照，扣除對(duì)照中固形物的吸收值，OD600=OD600讀數(shù)×稀釋倍數(shù)。

1.3.4 總酵母數(shù)與酵母死亡率的測(cè)定

總酵母數(shù)的測(cè)定采用血球計(jì)數(shù)板法，死亡率的測(cè)定采用亞甲基藍(lán)染色法[13]。

1.3.5 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

當(dāng)醬醪pH降至5.2～5.3時(shí)添加酵母培養(yǎng)液，添加量1%，分別在添加酵母培養(yǎng)液后第7天和第14天后測(cè)定其酒精度。

1.3.6 酒精度測(cè)定

酒精度的測(cè)定按GB/T 10345-2007《白酒分析方法》。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸化力法對(duì)魯氏酵母活力的評(píng)價(jià)條件

2.1.1 酵母泥濃度對(duì)酸化力測(cè)定的影響

圖1 不同酵母泥濃度對(duì)酸化力的影響Fig.1 Effects of yeast slurry concentration on acidification power

初定加入葡萄糖的濃度為5%，在室溫下進(jìn)行檢測(cè)，研究不同酵母泥濃度對(duì)酸化力的影響。由圖1可知，在酵母泥濃度為0～8%(W/V)時(shí)，隨酵母泥濃度增加，GIPE值逐漸增大，其中在0～4%范圍內(nèi)GIPE值有較大的增幅。當(dāng)酵母泥濃度在8%以上時(shí)，GIPE值趨于穩(wěn)定，因此選定8%為酸化力法的酵母泥測(cè)量濃度。

2.1.2 葡萄糖濃度對(duì)酸化力測(cè)定的影響

圖2 不同葡萄糖濃度對(duì)酸化力的影響Fig.2 Effects of different glucose concentration on acidification power

由圖2可知，不加入葡萄糖的空白對(duì)照，pH不發(fā)生變化，證明不存在底物對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾作用。隨著葡萄糖濃度的增加，GIPE值逐漸增大，在0～1%時(shí)增加速度最大。當(dāng)葡萄糖濃度大于5%后，GIPE值緩慢增加，超過10%后GIPE值變化趨于平穩(wěn)。綜合考慮，確定酸化力法的最適葡萄糖濃度為10%。

2.1.3 檢測(cè)溫度對(duì)酸化力測(cè)定的影響

圖3 不同溫度對(duì)酸化力的影響Fig.3 Effects of different temperatures on acidification power

由圖3可知，在0～30 ℃范圍內(nèi)，隨測(cè)定溫度的升高，GIPE值升高，可見酵母降解葡萄糖的速度在一定范圍內(nèi)與溫度呈正相關(guān)。然而溫度高于30 ℃后，GIPE值開始出現(xiàn)下降趨勢(shì)，這與酵母對(duì)溫度的耐受性有關(guān)[14]，因此酵母酸化力測(cè)試的最佳溫度為30 ℃。

經(jīng)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)后，確定酵母泥濃度8%，葡萄糖濃度10%，測(cè)定溫度30 ℃為酸化力法測(cè)定魯氏酵母活力的最適條件，將該條件應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中。

2.2 酸化力法評(píng)價(jià)魯氏酵母活力的可行性

2.2.1 不同活性酵母的酸化力評(píng)價(jià)

酵母的GIPE值依賴于位于質(zhì)膜上的ATP酶質(zhì)子泵活性，通過葡萄糖降解促進(jìn)質(zhì)子的流出，而死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜及膜的機(jī)能遭到破壞，ATP酶也遭到破壞。通過60 ℃水浴保溫2 h后制得死細(xì)胞，將不同比例的培養(yǎng)至穩(wěn)定期的酵母活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行混合處理，測(cè)定其酸化力，見圖4。

圖4 不同活細(xì)胞比例酵母的酸化力Fig.4 The acidification power of yeast with different living cell ratios

由圖4可知，死酵母的GIPE值接近0，證明酸化力法測(cè)定酵母活力的可行性。隨著活細(xì)胞比例的增加，GIPE值增大，且線性關(guān)系良好，說明酸化力法能很好地反映不同活性酵母的酵母活力。

2.2.2 不同老化程度酵母的酸化力評(píng)價(jià)

酵母在無營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的環(huán)境下代謝減慢，細(xì)胞開始發(fā)生老化，活力降低，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，老化程度加深，細(xì)胞逐步死亡。酵母經(jīng)離心收集、洗滌3次后重懸于無菌去離子水中，在30 ℃分別保溫0，3，6，9，12，24 h，使酵母細(xì)胞發(fā)生不同程度的老化，分別測(cè)定不同老化程度酵母細(xì)胞的酸化力和亞甲基藍(lán)染色率，見圖5。

圖5 不同老化程度的酵母酸化力及染色率Fig.5 The acidification power and dyeing rate of yeast with different aging degrees

由圖5可知，隨著酵母老化處理時(shí)間的延長(zhǎng)，酵母的死亡率增加，GIPE值降低，可以看出GIPE 值與亞甲基藍(lán)染色呈反相關(guān)。當(dāng)進(jìn)一步饑餓至發(fā)生死亡時(shí)(24 h)，GIPE 值降低至0，也就是說酵母完全失去活力。隨著染色率的增加，由GIPE值指示的酵母活力降低，理論與實(shí)際相符，表明GIPE值可以較好地反映酵母活力。

2.2.3 酸化力法評(píng)價(jià)魯氏酵母活力的穩(wěn)定性

表1 酵母GIPE的穩(wěn)定性Table 1 The stability of test of yeast's GIPE

由表1可知，酸化力法的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，GIPE值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差僅為3.39%(n=5)，小于5%，表明該方法評(píng)估酵母活力穩(wěn)定、準(zhǔn)確、可靠。

2.3 酸化力法評(píng)價(jià)醬油酵母活力的應(yīng)用

2.3.1 酸化力法評(píng)價(jià)靜置時(shí)間對(duì)酵母培養(yǎng)液質(zhì)量的影響

在醬油釀造過程中，有時(shí)需要在醬醪中添加酵母菌液來提高醬油的發(fā)酵性能。然而在生產(chǎn)中，由于多種條件的限制會(huì)影響操作的及時(shí)性，酵母菌液在放置一段時(shí)間后會(huì)導(dǎo)致其活力的下降，從而影響預(yù)期的效果。可以通過酸化力法對(duì)不同放置時(shí)間的魯氏酵母菌液進(jìn)行活力評(píng)估，對(duì)菌液的效果進(jìn)行預(yù)判。

圖6 不同靜置時(shí)間的魯氏酵母的酸化力Fig.6 The acidification power of yeast with different static culture time

由圖6可知，在培養(yǎng)基中酵母靜置培養(yǎng)，2 h內(nèi)酵母活力損失少，2 h后酵母活力有一定損失，5 h時(shí)酵母活力損失約15.2%。結(jié)果表明：魯氏酵母在培養(yǎng)基中靜置對(duì)其活力的影響較大，在生產(chǎn)應(yīng)用中，可以通過酸化力法快速評(píng)估酵母菌液的活力，然后根據(jù)評(píng)估結(jié)果適當(dāng)改變菌液的添加量，從而達(dá)到預(yù)期的發(fā)酵效果。

2.3.2 酸化力法對(duì)醬油發(fā)酵罐中酵母活力的評(píng)價(jià)

OD600和總酵母數(shù)等指標(biāo)由于其檢測(cè)的快捷，常被作為預(yù)判酵母質(zhì)量的方法，然而這2項(xiàng)指標(biāo)誤差較大，無法準(zhǔn)確評(píng)估酵母活力，即當(dāng)酵母死亡后，這一類指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果仍會(huì)處于高值。而使用平板法計(jì)算活酵母數(shù)被看作是衡量酵母質(zhì)量高低最準(zhǔn)確的方法之一，然而該法卻存在檢驗(yàn)結(jié)果等待時(shí)間過長(zhǎng)，人力資源成本花費(fèi)較高的缺陷。下面使用酸化力法等4種方法對(duì)不同醬油發(fā)酵罐中的酵母活力進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)比幾種方法的評(píng)價(jià)效果。

圖7 不同方法評(píng)價(jià)醬油發(fā)酵罐中的酵母活力Fig.7 Evaluation of the activity of yeast by different methods

注：1～3號(hào)培養(yǎng)罐使用營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化配方，4～6號(hào)培養(yǎng)罐使用正常配方。

由圖7可知，GIPE值的變化趨勢(shì)與活酵母數(shù)的變化趨勢(shì)最為接近，能較為準(zhǔn)確地對(duì)酵母的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估。OD600能夠反映不同培養(yǎng)罐間酵母增殖情況的差異，與活酵母數(shù)的變化趨勢(shì)在一定程度上吻合，但契合程度低于GIPE值。此外，OD600、GIPE值與活酵母數(shù)的結(jié)果共同表明營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化配方較正常配方酵母質(zhì)量有所提升。

2.3.3 酸化力法測(cè)定醬油中酵母活力與醬醪發(fā)酵性能的對(duì)應(yīng)性研究

酵母在發(fā)酵過程中會(huì)通過自身生長(zhǎng)代謝活動(dòng)產(chǎn)生一定量的酒精，通過檢測(cè)發(fā)酵樣品中的酒精含量變化，能夠在一定程度上反映酵母的發(fā)酵性能。

圖8 酵母活力與產(chǎn)酒精能力的關(guān)系Fig.8 The relationship between the activity of yeast and alcohol production capability

將活細(xì)胞和死細(xì)胞按不同比例混合接種到醬醪中進(jìn)行發(fā)酵，在接種前檢測(cè)其酸化力，考察其與產(chǎn)酒精能力的相關(guān)性。由圖8可知，GIPE值與添加酵母后7天的酒精度變化趨勢(shì)一致，相關(guān)性較好，這與酵母菌的生長(zhǎng)特性有關(guān)，高活力的酵母發(fā)酵時(shí)生長(zhǎng)速度較快，保證有較快的乙醇生成速度和生成量[15]。然而，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，在14天時(shí)活細(xì)胞占比60%以上樣品的酒精度均達(dá)2.8%以上。由此可知，醬醪發(fā)酵一段時(shí)間后，由于存在通氧、pH、溫度等各種因素的影響，酵母活力低的菌液也可在醬醪中良好增殖，最終達(dá)到相似的酒精度，但添加酵母菌液初期的酒精含量變化與GIPE值具有一定的相關(guān)性，因此可以通過酵母添加液的GIPE值控制酵母初期的發(fā)酵情況。

3 結(jié)論

本文通過酸化力法評(píng)價(jià)從天然醬醪中篩選得到的魯氏酵母活力，經(jīng)測(cè)定條件優(yōu)化可知，當(dāng)魯氏酵母泥濃度8%、葡萄糖添加量10%、檢測(cè)溫度30 ℃時(shí)評(píng)價(jià)效果最佳。同時(shí)，酸化力法能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)不同活性酵母以及不同老化程度酵母的酸化力，且檢測(cè)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差僅為3.39%，穩(wěn)定性好。將酸化力法應(yīng)用于醬油發(fā)酵過程中的相關(guān)指標(biāo)評(píng)估發(fā)現(xiàn)，該方法能夠有效評(píng)價(jià)酵母液靜置過程中的活性變化、醬醪中的酵母活性，以及預(yù)判酵母液添加7天內(nèi)的酒精度變化。應(yīng)用酸化力法評(píng)價(jià)醬油中的酵母活力操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，穩(wěn)定性好，對(duì)醬油發(fā)酵過程中酵母活力的預(yù)判具有重要的指導(dǎo)意義，有一定的應(yīng)用價(jià)值。